La PROTEOMICA studia tutti i complementi proteici, i proteomi, che
derivano dai vari tessuti o tipi cellulari.
Al giorno d’oggi, la proteomica può essere divisa in proteomica classica
(sistematica e differenziale) e proteomica funzionale.
La Proteomica classica concentra il suo interesse sullo studio dei
proteomi completi
Quali proteine sono presenti in una cellula o in un tessuto?
mentre la proteomica funzionale studia gruppi più limitati di proteine
Come appare una particolare proteina?
(struttura, modificazioni…)
Con quali altre proteine interagisce la mia
proteina di interesse?
(network, interazioni….)
Caratterizzazione dei complessi :
¾ Natura delle molecole presenti nei complessi
¾ Stabilità, cinetica di formazione-dissociazione dei complessi,
variazione della loro composizione
¾ Proprietà funzionali dei complessi
¾ Interazioni proteiche dirette e indirette all’interno dei complessi
Lo studio dell’
INTERACTOMA
Conoscere i DETTAGLI delle interazioni all’interno di network e della
loro DINAMICA:
- Stabilire QUALI proteine interagiscono
- Stabilire COME varia la composizione dei complessi proteici in funzione
delle condizioni (Es. Risposta a specifici segnali cellulari)
- Confermare l’esistenza di proteine che non sono state predette e
attribuire loro un “ruolo potenziale”.
- Stabilire i siti molecolari di interazione
- Determinare i parametri cinetici di interazione
ANALISI DELLE INTERAZIONI PROTEINA-PROTEINA
Tecniche di determinazione diretta delle interazioni:
- analisi in vitro : es. co-purificazione / spettrometria di massa
(gel-filtrazione, ultracentrifugazione, coimmunprecipitazione…)
- analisi in vivo : es. Two Hybrid System, FRET…
Tecniche per la caratterizzazione delle interazioni:
-
protein-array
spettrofluorimetria
spettrofotometria
…….
ANALISI IN VITRO DELLE INTERAZIONI
PROTEINA-PROTEINA
Co-Immunoprecipitazione:
L’anticorpo diretto verso la proteina di interesse viene aggiunto a lisati cellulari. Gli immunocomplessi
vengono isolati mediante aggiunta di proteina-A immobilizzata su resina. L’ANALISI DEGLI
IMMUNOPRECIPITATI viene di solito effettuata mediante SDS-PAGE seguita da immunorivelazioni
specifiche o mediante 2D-E seguita da colorazione delle proteine totali.
Maria Monti, Stefania Orru` , Daniela Pagnozzi, and Piero Pucci
Interaction Proteomics; Bioscience Reports, Vol. 25, Nos. 1/2, February/April 2005
Pull-Down Assay:
la proteina di interesse viene usata come “esca” per catturare eventuali partner fisiologici. Di solito
la “proteina esca” viene prodotta come proteina di fusione ricombinante. Essa viene fatta interagire
in vitro con un lisato cellulare. Gli eventuali complessi formatisi vengono purificati per affinità.
Maria Monti, Stefania Orru` , Daniela Pagnozzi, and Piero Pucci
Interaction Proteomics; Bioscience Reports, Vol. 25, Nos. 1/2, February/April 2005
Tap-Tag Assay
La proteina di interesse (esca) viene fatta esprimere con una doppia specifica marcatura (tag): CBP
(Calmodulin Binding Peptide) e Proteina A (IgG binding domains of Staphylococcus aureus-Protein A).
Tra le regioni codificanti per i due “tag” è inserito un sito di idrolisi specifico per la Proteasi del Virus
del Tabacco (TEV). I complessi proteici sono isolati mediante due processi cromatografici di affinità.
Variazioni rispetto alla strategia originale: possibilità di introdurre i Tag sia all’N che al C-terminale
della proteina esca e nuovi tipi di Tag.
•Le
cellule
(procariotiche
o
eucariotiche)
possono
essere
trasfettate sia transientemente che
stabilmente.
•Non
si
dovrebbe
OVERESPRESSIONE.
mai
avere
•Le interazioni si stabiliscono “in vivo”
•Il sistema TAP-tag è stato messo a
punto per l’isolamento di complessi
espressi a “livelli naturali”.
CROSSLINKING
Il cross linking chimico “fissa” complessi multimolecolari, creando legami
covalenti ⇒ purificazione, arricchimento specifico e analisi.
Può essere effettuato sia in vivo che in vitro.
9 Non dà informazioni sulla forza delle interazioni.
9 Una volta identificati i “partners molecolari”, permette la “mappatura” dei
siti (amminoacidi) di interazione.
Situazione “ideale”:
COMPLESSI BIMOLECOLARI
GRUPPI FUNZIONALI DELLE PROTEINE
• Ammine Primarie (–NH2): N-terminali e catena laterale delle lisine (Lys, K) (gruppo
epsilon-amminico). Gruppi carichi positivamente in condizioni fisiologiche; solitamente
esposti sulla superficie esterna della proteina.
• Carbossili (–COOH): C-terminali e catene laterali di aspartato (Asp, D) e glutammato
(Glu, E). Solitamente esposti sulla superficie esterna della proteina e quindi accessibili per
la coniugazione senza dover denaturare la proteina.
• Sulfidrili (–SH): catena laterale della cisteina (Cys, C). Spesso formano ponti disolfuro
(–S–S–). Necessario effettuare la riduzione prima del crosslinking.
• Carbonili
(–CHO):
gruppi
aldeidici
e
chetonici;
glicoproteine ossidando gli zuccheri con meta-periodate.
possono
essere
creati
nelle
Protein crosslinker reactive groups
Functional Group Target
Reactive Group
Carboxyl (directly to amine)
Carbodiimide (e.g., EDC)
Amine
NHS ester
Imidoester
PFP ester
Hydroxymethyl phosphine
Sulfhydryl
Maleimide
Haloacetyl (Bromo- or Iodo-)
Pyridyldisulfide
Vinyl sulfone
Aldehyde (Carbonyls)
i.e., oxidized carbohydrates
Hydrazide
Any Group (Nonselective)
Diazirine (Photo-reactive)
Aryl Azide (Photo-reactive)
Hydroxyl (non-aqueous)
Isocyanate
CARBODIIMIDI (EDC E DCC)
Carbodiimidi usate come crosslinker sono:
EDC: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride
DCC: Dicyclohexylcarbodiimide
uno “zero-lenght
crosslinker”:
attiva il gruppo carbossilico
permettendone il legame con
un gruppo amminico.
EDC
è
Usato in procedure di
immobilizzazione (es. attacco
di proteine/peptidi a superfici
carbossilate)
o
nella
preparazione di immunogeni
(es. attacco di un piccolo
peptide a una proteina carrier
di grosse dimensioni).
ESTERI N-IDROSSISUCCINIMMIDI (NHS-estere)
La reazione avviene in condizioni debolmente alcaline e genera legami ammidici.
IMMIDOESTERI
La reazione avviene in condizioni alcaline e genera legami ammidinici.
Legame reversibile a pH elevato.
MALEIMMIDE
Il crosslinking che sfrutta la presenza dei gruppi sulfidrilici è una delle procedure
più usate.
Le cisteine non sono mai “troppo numerose”.
Processo selettivo e preciso.
I gruppi sulfidrilici possono essere generati (es. per riduzione; aggiunta di
cisteammina su gruppi fosfato o etanditiolo su doppi legami…).
Il tioetere che si forma è stabile ed irreversibile.
La combinazione di gruppi reattivi verso gli –SH e di gruppi reattivi verso gli –NH2
è tipica dei reattivi eterobifunzionali più usati.
IDRAZIDI
Le idrazidi reagiscono anche con le ammine, ma la reazione è più lenta.
I gruppi carbonilici nelle proteine non esistono, ma possono essere creati (es. carboidrati)
ARIL AZIDI
I reattivi fotochimici sono inerti; vengono resi reattivi se esposti a luce visibile o
ultravioletto.
Le arilazidi sonostati i primi gruppi foto-reattivi usati per il cross-linking delle
proteine.
Gli agenti riducenti impediscono la fotoattivazione.
Photoactivatable Cross-linking
Il cross linking può essere effettuato usando sostanze attivate dalla luce.
9 Processo più controllabile
9 Tempi di reazione più rapidi
ESEMPIO:
Tris(2,2’-bipyridyl)-ruthenium (II)
+
APS
Persolfato d’ammonio
• Rapido (10 - 30 s)
• Alta efficienza
• Radiazione visibile (> 400 nm)
• Non introduce “gruppi chimici”
(zero-lenhgt)
• Coinvolge residui di Tirosina
Meccanismo proposto per la reazione di photocrosslinking con Tris(2,2’-bipyridyl)-ruthenium (II)
REATTIVI OMOBIFUNZIONALI
9 2 identici gruppi reattivi separati da un “braccio spaziatore”.
9 Di solito: reazioni one-step e random.
Esempio: aggiungendo un crosslinker ammina-vs-ammina ad un lisato
cellulare si otterrà la coniugazione di tutte le proteine o peptidi le cui
lisine si troveranno ad una distanza utile.
Questo metodo è utile per capire la possibilità di associazione fra più
molecole e non permette di selezionare le molecole da analizzare.
REATTIVI ETEROBIFUNZIONALI
9 2 gruppi reattivi diversi alle loro estremità.
9 Le reazioni possono essere sia coniugazioni a singolo-step, che coniugazioni
sequenziali (two-step).
9 Processi di polimerizzazione e self-conjugation sono minimizzati.
Nelle procedure sequenziali:
1- reagisce il gruppo del crosslinker più labile;
2- si rimuove l’eccesso di crosslinker che non ha
reagito;
3- la soluzione con la proteina modificata viene
aggiunta ad una
soluzione contenente la seconda proteina,
che reagisce con il secondo gruppo reattivo.
SCELTA DEI CROSSLINKER
9 SPECIFICITÁ
reagisce?
CHIMICA:
con
quale/i
gruppo/i
funzionale
9 CARATTERISTICHE DEL “BRACCIO SPAZIATORE”: il
crosslinker è sufficientemente lungo da connettere le due molecole? Il
legame può essere reversibile? Il legame può essere rotto?
9 SOLUBILITÁ IN ACQUA E PERMEABILITÁ DELLE
MEMBRANE CELLULARI: il reattivo può entrare nella cellula? Il
reattivo può determinare crosslink delle proteine idrofobiche di
membrana?
9 REATTIVITÁ SPONTANEA O FOTOINDOTTA: la reazione
avviene spontaneamente e rapidamente o deve essere attivata in un
momento preciso?
FONDAMENTALE:
9 Preservare la struttura nativa delle proteine e dei complessi;
9 Non eccedere con il reattivo. Il rapporto molare, crosslinker-vs-proteina,
ottimale dovrebbe essere sempre determinato empiricamente;
9 Poter controllare il grado di coniugazione (es. basso se è necessario preservare
l’attvità biologica della proteina);
9 Considerare sempre i gruppi funzionali presenti sulla superficie della proteina.
Se questi sono molti, è necessario usare un basso rapporto crosslinker-vs-proteina,
viceversa se sono pochi.
9 Limitarsi all’analisi di complessi con pochi interagenti (situazione ideale: 2).
TIPI DI CROSS-LINKER DISPONIBILI COMMERCIALMENTE
I più comuni cross-linker formano legami fra:
9Lisina/Lisina
9Lisina/Aspartato
9Lisina/Glutammato
9Lisina/Cisteina
9Cisteina/Cisteina
Il cross-linking può essere effettuato
anche
per
inserire
dei
TAG
di
affinità, cromofori o fluorofori….
Il
cross-linking
può
anche
INTRODURRE gruppi chimici
Michael A. Trakselis, Stephen C. Alley, and Faoud T. Ishmael; Identification and Mapping of Protein-Protein Interactions
by a Combination of Cross-Linking, Cleavage, and Proteomics; Bioconjugate Chem.; 2005; 16(4): 741 - 750
NON
STRATEGIA GENERALE
Michael A. Trakselis, Stephen C. Alley, and Faoud T. Ishmael; Identification and Mapping of Protein-Protein Interactions
by a Combination of Cross-Linking, Cleavage, and Proteomics; Bioconjugate Chem.; 2005; 16(4): 741 - 750
Blue native electrophoresis for isolation of membrane
protein complexes in enzymatically active form.
Schagger H, von Jagow G., Anal Biochem. 1991 Dec;199(2):223-31.
LA
BLUE
NATIVE
ELECTROPHORESIS
è
una
tecnica
sviluppata per l’analisi dei complessi proteici che formano la
catena respiratoria di trasferimento elettronico di vari
organismi.
VANTAGGI RISPETTO AD ALTRE TECNICHE
SEPARATIVE DI COMPLESSI MULTIPROTEICI:
9 Non introduce TAG o ANTICORPI che potrebbero influenzare
le interazioni proteina/proteina.
9 I complessi possono anche essere analizzati in un unico
immunoblot.
9 Fornisce
composizione
informazioni
e
rapide
abbondanza
presenti nei complessi.
su:
relativa
numero,
delle
singole
ampiezza,
subunità
Tecnica ideata per l’analisi di “complessi proteici di membrana”
9
Circa il 20-30% delle proteine cellulari sono proteine integrali di membrana, e
molte proteine solubili sono associate ad esse.
9
L’analisi biochimica di proteine integrali di membrana richiede di solito
l’estrazione con detergenti e denaturanti che solubilizzino efficientemente le
proteine idrofobiche
“distruzione” delle interazioni proteina-
proteina e possibile perdita dell’attività enzimatica.
9
La
“native
isoelectric
focusing”
non
è
adatta
all’analisi
delle
proteine
idrofobiche, che tendono a diventare insolubili a pH vicini al loro pI e a
precipitare al polo basico.
9
Il cross-linking chimico talvolta impedisce l’identificazione corretta di tutte le
proteine presenti in un complesso; complessi multi-proteici (a molte componenti)
possono generare segnali difficilmente interpretabili…..
L’analisi elettroforetica BLUE NATIVE permette la separazione ad
alta risoluzione di complessi multiproteici, in condizioni native:
9
richiede detergenti non forti e non ionici, come il Triton X-100, il β-Ddodecilmaltoside (DDM), e la digitonina…
9
è possibile solo in condizioni non denaturanti (in contrasto con le tecniche
“classiche”, quali SDS-PAGE e IEF).
9
Applicabile solo a materiale purificato.
9
Risoluzione superiore a quella di altre tecniche quali gel-filtrazione o
ultracentrifugazione su gradiente.
DETERGENTI USATI PER LA PREPARAZIONE DI CAMPIONI
DA SOTTOPORRE A BN-PAGE
Le cariche negative vengono attaccate ai complessi
proteici solubilizzati, dal legame con il colorante
Coomassie Blue G250:
• Il Coomassie non agisce come un detergente
e preserva la struttura dei complessi
multiproteici.
• Il legame del Coomassie avviene piuttosto
uniformemente nel caso di proteine di
membrana (Coomassie:proteina (W:W), 1:1).
• I complessi proteici (e le singole proteine)
migrano all’anodo per l’eccesso di carica
negativa e vengono separate in base alla massa
molecolare apparente.
9
La ragione per cui la BN-PAGE è stata più comunemente usata per l’analisi di
complessi proteici respiratori e fotosintetici è la loro abbondanza nel proteoma
di mitocondri e cloroplasti.
9
L’utilizzo della tecnica BN per altri tipi di campioni può richiedere un pretrattamento per l’arricchimento del complesso proteico di interesse.
9
La BN-PAGE non è stata usata con successo per l’analisi di complessi proteici
solubili, nonostante essi siano in teoria meno problematici da analizzare dei
complessi proteici di membrana.
9
Spesso si possono verificare problemi di allargamento e/o restringimento
dell’ampiezza delle bande nel gel, dovuti in parte ad una inappropriata
concentrazione di sali.
QUINDI:
Per solubilizzare complessi proteici intatti, evitando la denaturazione delle
proteine è necessario usare:
9 detergenti blandi non ionici come DDM, digitonina, Triton X-100;
9 sali di bassa forza ionica, come acido aminocaproico o acetato di potassio.
LA MOBILITA’ ELETTROFORETICA è DETERMINATA DALLA CARICA
NEGATIVA DATA DAL LEGAME CON IL COOMASSIE BLUE G-250 E
DALL’AMPIEZZA E DALLA FORMA DEI COMPLESSI MULTIPROTEICI.
Per ragioni sconosciute NON E’ POSSIBILE SEPARARE COMPLESSI DA
LISATI CELLULARI TOTALI, anche se:
PARZIALE PURIFICAZIONE E/O DIALISI
Per l’analisi BN di complessi proteici citoplasmatici sembra essere
necessario rimuovere “una sostanza di passo peso molecolare” mediante
DIALISI.
2D BN/SDS-PAGE
from WCL:
PROTEIN COMPLEX
“FOOTPRINT”
Camacho-Carvajal, M. M. (2004)
Mol. Cell. Proteomics 3: 176-182
Di solito vengono usati
gel di acrilamide in
gradiente:
5-14%/ 5-17%
estremità catodica
estremità anodica
Nel caso più comune, alla BN-PAGE è abbinata una SDS-PAGE
1% SDS
1% β-mercaptoetanolo
Per una BN-SDS PAGE, la striscia del gel BN deve essere
incubata prima della seconda dimensione in un tampone
contenente SDS e 2-mercaptoetanolo (o DTT…);
questo passaggio assicura una completa denaturazione
dei complessi proteici necessaria per una successiva
separazione delle loro subunità.
In una BN/SDS-PAGE le proteine monomeriche migrano
all’interno di una parabola iperbolica, mentre i complessi
multiproteici (MPC) ne rimaranno al di sotto.
Dopo la seconda dimensione le proteine appartenenti ad uno
stesso complesso multiproteico, si separeranno in colonne
verticali
Visualization of MPCs on a 2D WCL BN/SDS gel and identification of
MPC components by MS
Quando i campioni vengono pre-trattati con SDS, si ha la scissione dei complessi
nelle singole unità monomeriche. L’analisi bidimensionale BN-PAGE/SDS-PAGE (B)
mostrerà una localizzazione a forma di “diagonale iperbolica”.
Senza pre-trattamento avremo una visualizzazione degli spot in colonne verticali (A).
BN/SDS PAGE
BN/BN PAGE
COMBINA O L’USO DI DETERGENTI DIVERSI O
ALTRI TRATTAMENTI DEBOLMENTE DENATURANTI
QUALI TEMPERATURE ELEVATE, VARIAZIONI DI
CONCENTRAZIONE SALINA, RIDUCENTI…..
BN/IEF-SDS PAGE
L’identificazione delle singole proteine
presenti nei complessi, può essere
effettuata o mediante MS o mediante
IMMUNORIVELAZIONE SPECIFICA.
LE
VARIE
SUBUNITÀ
MEDIANTE
IDENTIFICATE
PROTEICHE
BN/SDS-PAGE,
UTILIZZANDO
SEPARATE
VENGONO
STRATEGIE
“TRADIZIONALI”:
9 Peptide Mass Finger Print (MS).
9 Sequenziamento peptidico (MS/MS).
9 Western blotting.
9 Altro……..
I risultati possono comunque essere convalidati mediante
riconoscimento immunospecifico (Western Blot)!
Two-dimensional Blue Native/SDS Gel Electrophoresis of
Multi-Protein Complexes from Whole Cellular Lysates:
A PROTEOMICS APPROACH
Margarita M. Camacho-Carvajal, Bernd Wollscheid, Ruedi
Aebersold, Viktor Steimle ,and Wolfgang W. A. Schamel
MOLECULAR AND CELLULAR PROTEOMICS (2004), 3:176-182
ANALISI DEI COMPLESSI PROTEASOMICI IN SISTEMI
EUCARIOTICI E LORO DINAMICA
Identification of MPCs by immunoblotting
L’analisi è stata estesa a molte proteine
cellulari
note,
per
verificare
la
loro
appartenenza a MPC.
Importin-β e Importin-α: implicate nel
trasporto verso il nucleo, non sempre
appartengono a stessi MPC.
P53 appartiene almeno a tre distinti MPC
(quello di 200 kDa è presumibilmente un
omotetramero).
……….
Alcune delle proteine analizzate, migrano
come componenti monomeriche all’interno
della “diagonale iperbolica”
Camacho-Carvajal, M. M. (2004)
Copyright ©2004 American Society for Biochemistry and Molecular Biology
Mol. Cell. Proteomics 3: 176-182
L’identificazione di proteine “incognite” presenti in MPC è
stata effettuata mediante PEPTIDE MASS FINGER PRINT
e/o SEQUENZIAMENTO DIRETTO (LC-MS/MS)
Cosa succede se due MPCs (multi-protein complexes)
hanno la stessa mobilità elettroforetica?
9 Dopo la BN i due MPCs sono “sovrapposti”.
9 Dopo la successiva SDS-PAGE le singole componenti di entrambi
si separano… ma come si attribuiscono gli spots???
Antibody-based gel shift assay
Antibody-based gel shift assay
La posizione di due spot in una colonna verticale dopo BN/SDS-PAGE può indicare:
9 Due proteine appartenenti ad uno stesso MPC.
9 Due proteine appartenenti a due MPC con uguale mobilità elettroforetica .
Incubando il lisato cellulare totale con un anticorpo diretto verso una
delle proteine presenti in uno dei MPC, prima della BN/SDS-PAGE, si
genererà un complesso addizionato della massa dell’anticorpo:
SHIFT vs TOP
(Higher molecular mass)
SPOSTAMENTO SOLO DELLE PROTEINE APPARTENENTI AD UNO
STESSO COMPLESSO
Identification and analysis of distinct proteasomes by WCL 2D
BN/SDS-PAGE
RICONOSCIMENTO
IMMUNOSPECIFICO
(WB)
Subunità proteiche
complesso 20S:
Mcp21 e β2
del
Subunità proteiche
complesso 19S cap
proteasoma 26S:
S4 ATPase
del
del
Subunità proteica di PA28:
PA28α
Subunità dell’ immunoproteasoma indotto dal
trattamento con IFN-γ:
LMP2
IN D: Antibody-based gel shift assay
In-gel activity staining of oxidized nicotinamide adenine
dinucleotide kinase by blue native polyacrylamide gel
electrophoresis
Ryan J. Mailloux, Ranji Singh, Vasu D. Appanna, Analytical Biochemistry 359 (2006) 210–215
La NADK è un importante enzima metabolico che permette agli organismi
viventi di modulare la concentrazione intracellulare di NAD+ e NADP+.
Fondamentale per la generazione di un ambiente riducente in grado di
contrastare la generazione/esposizione di/ai ROS (Reactive Oxygen
Species).
Messa a punto di una tecnica Blue Native-PAGE per
valutare l’attività e l’espressione della NADK
REAZIONE CATALIZZATA DALLA NADK:
NAD+ + ATP
NADK
NADP+ + ADP
L’attività viene monitorata direttamente su gel, in presenza di un enzima NADP+dipendente (Glucosio-6-fosfato deidrogenasi, G6PDH o isocitrato deidrogenasi, ICDH).
ICDH
Il NADPH che si forma, interagisce con CLORURO DI IODONITROTETRAZOLIO
(INT)
INT generando un precipitato bruno, che si deposita nel sito dove è presente
l’enzima NADK.
PROCEDURA:
9 Lisi in 50 mM Bis-Tris, 500 mM six-amino hexanoic acid (pH 7.0)
9 Aggiunta di Coomassie G-250 0.02% (presente anche nel tampone catodico)
9 Elettroforesi in condizioni native (20-80 µg proteine)
9 Equilibrazione in 25 mM Tris, 5 mM MgCl2 (pH 7.4)
9 Aggiunta di NAD+ 0.5 mM, ATP 3 mM, Glucosio-6-fosfato 5 mM o isocitrato 5 mM,
G6PDH o ICDH 5 unità, INT 0.4 mg/ml, PMS 0.2 mg/ml
Controlli negativi:
incubazione senza substrato (ATP o NADH) o aggiunta di iodoacetato e CTP
Blue Native Electrophoresis
1a dimensione
Una volta individuata la “banda attiva”,
essa viene:
9 Ritagliata
9 Equilibrata in 24 mM Tris, 191
mM Glicina, 1% SDS (W/v), 1%
mercaptoetanolo (v/v)
9 SDS-PAGE
2a dimensione
ANALISI COMPLETA:
(BN (zimogramma)/SDS-PAGE)
