Questione di gusto

 Sperimenta il Biolab Ques%oni di gusto La variazione gene3ca associata alla percezione del gusto amaro Il gene TAS2R38 Università degli Studi di Milano
Indice Conoscenze propedeu3che, obieEvi e metodi sperimentali 1. Enzimi di restrizione 2. Polimorfismi del DNA 2.1. Polimorfismi allelici 2.2. Polimorfismi di sequenza • Polimorfismi di singolo nucleo7de (SNP) • Polimorfismi di ripe7zione, VNTR o DNA microsatellite • Polimorfismi di restrizione, RFLP 2.3. U7lizzo dei Polimorfismi del DNA 3. La percezione del gusto: segnali, cellule e receNori 3.1. Il gusto e la scoperta delle differenze di sensibilità all’amaro 3.2. Cellule gusta7ve e loro organizzazione 4. I geni della percezione del gusto 4.1. I geni della percezione del sapore amaro 4.2. Il gene TAS2R38 4.3. SNPs e aplo7pi del gene TAS2R38 4.4. Evoluzione e distribuzione del gene TAS2R38 5. Tecniche u3lizzate 5.1. PCR (Polymerase chain reac7on) • Termociclatori • Taq polimerasi • Scelta primer 5.2. EleUroforesi su gel di agarosio 6. Norme generali di sicurezza in laboratorio • U7lizzo del forno a microonde • U7lizzo della centrifuga • U7lizzo dell’apparecchiatura per eleUroforesi • Smal7mento dei rifiu7 7. In laboratorio 7.1. Analisi del feno7po “sensibilità all’amaro” 7.2. Iden7ficazione del geno7po mediante analisi del SNP C/G in posizione 145 7.3. Protocollo di laboratorio • Soluzioni e reagen7 usa7 nell’a\vità di laboratorio • Operazioni preliminari • Preparazione del gel di agarosio • Corsa eleUrofore7ca • Operazioni da svolgere alla fine della corsa eleUrofore7ca 7.4 Laboratorio di Bioinforma7ca: localizzazione dei primer all’interno del gene TAS2R38 e calcolo della lunghezza del prodoUo di PCR • Calcolo della lunghezza dei frammen7 aUesi dopo diges7one dei prodo\ di PCR con HaeIII • Iden7ficazione dei geno7pi mediante eleUroforesi su gel di agarosio 8. Scenari e costruzione di alberi genealogici 9. Test di autovalutazione 10. Glossario 11. Bibliografia e Sitografia A cura di: •prof.ssa Maria Grazia Fiorin •prof.ssa Maria Teresa Oliveira, Liceo Fiocchi, Lecco •prof. Giovanni Pavone, Liceo Fiocchi, Lecco •prof.ssa Giovanna Viale, Università degli Studi di Milano •doU.ssa Marisa Oppizzi, CusMiBio
Conoscenze propedeu3che, obieEvi e metodi sperimentali Per poter svolgere questa a\vità, gli studen7 devono avere precedentemente acquisito le conoscenze rela7ve a: Leggi di Mendel, glossario di gene7ca classica, meiosi, geni indipenden7 e geni associa7. Replicazione del DNA. ObieEvi Questo laboratorio dimostra alcuni conce\ importan7 in gene7ca e biologia molecolare: •rapporto fra geno7po e feno7po •i polimorfismi del DNA •come i polimorfismi di singolo nucleo7de (SNP) e le loro combinazioni (aplo7pi) possono essere u7lizza7 per predire la sensibilità al gusto amaro Metodi sperimentali •Amplificazione di una regione specifica del DNA con PCR •Diges7one con Enzimi di restrizione dei prodo\ di PCR •Analisi dei prodo\ della diges7one con eleUroforesi su gel di agarosio •Bioinforma7ca: Uso di BLAST per iden7ficare sequenze all’interno di un database •Posizionamento dei primer di PCR su una sequenza e calcolo della lunghezza dei prodo\ di PCR 1. Enzimi di restrizione Gli enzimi di restrizione (ER) sono “forbici molecolari” in grado di tagliare la doppia elica del DNA in si7 specifici (lunghi 4-­‐8 paia di basi) de\ “si7 di restrizione” generando una serie di frammen7 di diversa lunghezza, deUa paUern di restrizione, specifica per il DNA di ogni specie. Gli ER sono prodo\ dai baUeri che li u7lizzano per difendersi dagli aUacchi di un DNA estraneo, per esempio di un virus. Il DNA endogeno viene proteUo modificando residui di adenina e citosina con l’aggiunta di gruppi me7le (-­‐CH3). Dal punto di vista biochimico gli ER sono delle endo-­‐desossi-­‐ribonucleasi che scindono un legame fosfodiesterico. Sono sta7 purifica7 1027 enzimi di restrizione prodo\ da 861 7pi di baUeri diversi (Tab.1). Una mutazione della sequenza di basi del DNA può creare o distruggere un sito di restrizione; digerendo il DNA di individui diversi con uno stesso ER, si osserva quindi un polimorfismo di lunghezza dei frammen7 di restrizione (in inglese Restric7on Fragment Lenght Polymorphism o RFLP, pronuncia riflip). Nome dell’ ER
Pronuncia
Organismo di provenienza
Sito di restrizione e posizione del taglio
BamHI
bam-­‐acca-­‐uno
Bacillus amyloliquefaciens H
G/GATC C
C CTAG/G
EcoRI
eco-­‐erre-­‐uno
Escherichia coli RY13
G/AATT C
C TTAA/G
HindIII
indi-­‐tre
Haemophylus influenzae Rd
A/AGCT T
T TCGA/A
DdeI
di-­‐di-­‐e-­‐uno
Desulfovibrio desulfuricans
C/TNA G
G ANT/C
MstII
emme-­‐esse-­‐7-­‐due
Microcoleus species
CC/TNA GG
GG ANT/CC
SmaI
sma-­‐uno
SerraAa marcescens
CCC/GGG
GGG/CCC
Tabella 1. Enzimi di restrizione e il loro sito di taglio. Gli enzimi di restrizione si indicano con un sistema di leUere e numeri che si riferisce al ceppo baUerico da cui sono sta7 isola7. Nella tabella vengono mostra7 alcuni esempi di enzimi di restrizione, le sequenze di DNA che ques7 tagliano e i prodo\ di scissione. Alcuni enzimi tagliano le sequenze in modo da dare origine ad estremità coesive, mentre altri effeUuano un taglio neUo.
Come tu\ i polimorfismi, i RFLP sono ereditabili come caraUeri mendeliani semplici (Fig.1) e sono trasmessi come caraUeri codominan7. Il feno7po di un RFLP è evidenziabile in termini di differenze di numero e/o dimensione dei frammen7 di DNA oUenu7 dalla diges7one con un certo enzima di restrizione. I frammen7 sono visibili dopo migrazione eleUrofore7ca su gel (Fig. 1 B). A
Fig 1. Albero genealogico di un RFLP. A. Frammenti di restrizione ottenuti con digestione mediante l’enzima EcoRI di due alleli (1 e 2) di un gene. B. Analisi del DNA di una famiglia composta da padre, madre, figlio e figlia. I frammenti di DNA ottenuti dalla digestione con EcoRI vengono separati mediante corsa elettroforetica. Il DNA dei genitori rivela 3 bande corrispondenti a frammenti da 500, 350 e da 150 pb (paia di basi), dimostrando che sono eterozigoti (1/2); il DNA del figlio risulta diviso in 2 bande corrispondenti a frammenti da 350 e 150 pb, è quindi omozigote per l’allele 1 (1/1); mentre il DNA della figlia, che mostra una sola banda da 500 pb, è omozigote per l’allele 2 (2/2).
B
Gli ER si possono suddividere in varie classi a seconda della specificità e della modalità di taglio (Tab1); ER diversi riconoscono e tagliano, in linea di massima, sequenze diverse, deUe sito di restrizione. Uno stesso enzima taglia qualsiasi 7po di DNA dovunque trovi il proprio sito di restrizione. I si7 di restrizione sono sequenze palindromiche, ovvero sequenze che possono essere leUe in entrambe le direzioni, come ad esempio le parole ANNA o ETNA GIGANTE, di poche coppie di nucleo7di, in genere 4, 5 o 6. Gli ER sono uno strumento fondamentale per l’analisi e la manipolazione del DNA. La scoperta degli ER ha aperto la strada all’ingegneria gene7ca, ossia alla possibilità di “tagliare e cucire” il DNA in modo riproducibile e di costruire molecole di DNA ricombinante. Tagliando due DNA diversi con uno stesso enzima si meUono allo scoperto le stesse sequenze nucleo7diche, generando delle estremità adesive o coesive complementari una all’altra. Questo permeUe di costruire molecole di DNA ricombinante (Fig.2). Gli ER consentono di costruire veUori ricombinan7 (un veUore è molecola di DNA capace di replicarsi in una cellula ospite), in cui sono state inserite sequenze di DNA, della stessa specie o di una specie diversa, u7li allo scopo che si vuole raggiungere. Esempi di veUori usa7 per le nuove biotecnologie sono quelli per costruire vaccini o produrre molecole di uso terapeu7co, per la terapia genica, per modificare gene7camente piante o Fig 2. Costruzione di una molecola di DNA ricombinante. Due molecole di DNA provenienti da fonti diverse, una bianca e una nera, si “legano” una all’altra dopo essere state entrambe tagliate con lo stesso enzima di restrizione EcoRI, formando una molecola di DNA ricombinante.
animali. Tagliando il DNA con un dato enzima di restrizione si oUengono frammen7 di lunghezza discreta e riproducibile. Questo consente il clonaggio di frammen7 di DNA e l’analisi del DNA genomico. 2. Polimorfismi del DNA Il termine polimorfismo significa “esistenza di forme diverse”. In gene7ca, il polimorfismo può essere analizzato a livello di proteina: polimorfismo proteico, oppure di materiale gene7co: polimorfismo gene7co. Nel secondo caso, le varian7 gene7che possono riguardare un traUo di DNA codificante una proteina, ovvero un gene, oppure un traUo di DNA non codificante. Nel primo caso, si parla di polimorfismo allelico, nel secondo caso di polimorfismo di sequenza del DNA. 2.1. Polimorfismi allelici Per polimorfismi allelici si intende l’esistenza di due o più alleli di uno stesso gene o locus. Gli alleli di un gene si formano uno dall’altro per mutazione, ossia per variazione della sequenza nucleo7dica di un gene. Gli alleli di un gene possono determinare feno7pi diversi, ad esempio capelli neri o biondi, quindi vengono iden7fica7 dal feno7po. Se gli alleli di un gene sono due, il polimorfismo si chiama polimorfismo biallelico. Se gli alleli sono in numero maggiore di due, come nel sistema di gruppo sanguigno ABO, il polimorfismo è deUo polimorfismo mul7allelico. 2.2. Polimorfismi di sequenza Nel caso dei polimorfismi del DNA, contrariamente ai polimorfismi allelici, la variazione di sequenza nucleo7dica avviene in genere in un traUo di DNA non codificante, che nel suo complesso cos7tuisce circa il 98% del genoma. I polimorfismi del DNA sono quindi più frequen7 dei polimorfismi allelici e conseguentemente più u7li nella ricerca gene7ca. Poiché interessano generalmente il DNA non codificante, i polimorfismi del DNA rappresentano differenze tra individui, senza conseguenze sul feno7po. Quindi, non è possibile rilevarli osservando le caraUeris7che feno7piche di un individuo. Esistono diversi 7pi di polimorfismi del DNA: 1.polimorfismi di singolo nucleo7de = SNP (Single Nucleo7de Polymorphism) 2.polimorfismi di ripe7zione = VNTR (Variable Number Tandem Repeats) 3.polimorfismi di restrizione = RFLP (Restric7on Fragment Length Polymorphism), una forma par7colare di SNP •Polimorfismi di singolo nucleo3de (SNP) Un polimorfismo di singolo nucleo7de (Single Nucleo7de Polymorphism o SNP, che si pronuncia “snip”) è un polimorfismo del DNA, cioè una variazione a livello di sequenza, che si presenta tra individui della stessa specie, caraUerizzata da una differenza a carico di un singolo nucleo7de. Confrontando il genoma di due esseri umani, il 99.9 % delle basi sono iden7che, il rimanente 0.1 % è cos7tuita da SNPs e determina l’unicità dell’individuo. Nel genoma umano si verificano SNPs all’incirca uno ogni 100-­‐300 paia di basi. Questo significa che su 3 miliardi di nucleo7di presen7 nel genoma umano avremo circa 10-­‐30 milioni di SNPs. Gli SNPs cos7tuiscono il 90% di tuUe le variazioni gene7che umane. Non bisogna confondere una mutazione pun7forme con uno SNP! Anche se si assomigliano, non sono la stessa cosa: -­‐ sono entrambe differenze di singoli nucleo7di, ma per parlare di SNP bisogna che questo sia presente in almeno 1% della popolazione -­‐ molte mutazioni correlate a mala\e sono più rare -­‐ le mutazioni con effe\ feno7pici si trovano all’interno delle regioni codifican7 di un gene o in quelle regolatorie e interessano la proteina corrispondente. Viceversa, la maggior parte degli SNPs non sono localizza7 nei geni o nelle loro vicinanze e non hanno effe\ feno7pici. In base a quanto deUo possiamo dis7nguere gli SNPs in due principali categorie: 1.Linked SNPs: non si trovano all’interno dei geni e non alterano la funzione della proteina. Possono essere associa7 (linked), ossia vicini a una sequenza codificante o regolatoria di un gene, e quindi essere dei marcatori gene7ci importan7. La sfida per la ricerca è iden7ficare gli SNPs associa7 con un par7colare effeUo feno7pico (vedi soUo). 2.Causa3ve SNPs: alterano il funzionamento di una proteina, correlando lo SNP ad una mala\a o ad un traUo feno7pico. Si dis7nguono 2 7pi di causa7ve SNPs: •Coding SNPs: localizza7 nella regione codificante del gene, cambiano la sequenza di aminoacidi nella proteina. •Non Coding SNPs: situa7 nella regione regolatoria del gene, cambiano la quan7tà di proteina prodoUa. Nella Figura 3 è rappresentato un esempio di linked SNP. Si nota che il soggeUo sano (DNA 1) possiede una C in un par7colare locus SNP in streUa prossimità del locus mala\a, c’è quindi bassissima probabilità che queste due regioni vengano separate durante un crossing-­‐over alla meiosi. Nel soggeUo malato (DNA 2), la presenza di un SNP C/T streUamente associato all’allele patologico può essere u7lizzata come marcatore gene7co. Pertanto, la ricerca e individuazione di una T in quella determinata posizione in un altro membro della famiglia indica, con buona probabilità, la presenza dell’allele patologico. Fig 3. Linked SNPs e loro utilizzo nella diagnostica. Rappresentazione del DNA di due membri di una famiglia, entrambi omozigoti, uno normale (DNA 1) e l’altro con una malattia genetica autosomica recessiva (DNA 2).
•Polimorfismi di ripe3zione, VNTR o DNA microsatellite Il DNA microsatellite è formato da monomeri di 1-­‐5 paia di basi ripetu7 10-­‐30 volte, presen7 in blocchi distribui7 nelle regioni non codifican7 di diversi cromosomi. Il numero di ripe7zioni può essere diverso da un individuo all’altro, questo conferisce ai microsatelli7 un elevato grado di polimorfismo all’interno della popolazione umana. Questo è noto come polimorfismo di lunghezza, in quanto il numero di ripe7zioni determina la lunghezza del microsatellite analizzato (Figura 4). Fig 4. Polimorfismo di lunghezza: In questo esempio la ripetizione CA presente in un particolare locus cromosomico ha tre forme alleliche di 15, 19 e 21 ripetizioni.
Come per tu\ i loci gene7ci, anche per i microsatelli7 i singoli individui possono essere omozigo7 o eterozigo7; se un individuo è omozigote per il locus analizzato sui due cromosomi omologhi sarà presente lo stesso numero di ripe7zioni. Se invece un individuo è eterozigote, sui due cromosomi omologhi ci sarà un numero di ripe7zioni diverso. Nel caso dei polimorfismi di lunghezza del DNA, la diversità fra due individui si può meUere in evidenza “misurando” la lunghezza dei microsatelli7. Questo polimorfismo è u7lizzato per costruire il fingerprin7ng del DNA, ossia un profilo che permeUe di dis7nguere ogni individuo da un altro. Il DNA fingerprin7ng viene anche u7lizzato nel campo forense, per individuare, ad esempio, a chi appar7ene il DNA ritrovato sulla scena di un crimine (vedi la dispensa del DNA Fingerprin7ng sul sito del CusMiBio). TuUe le regioni vengono amplificate per mezzo della PCR u7lizzando due primer complementari a sequenze uniche fiancheggian7 ogni singolo microsatellite. I frammen7 così oUenu7 sono successivamente analizza7 mediante eleUroforesi su gel di agarosio: i frammen7 più cor7 migreranno più velocemente di quelli più lunghi, generando un profilo di bande simile ad un codice a barre, caraUeris7co per ciascun individuo (Figura 5). Analizzando contemporaneamente i 17 loci gene7ci si ha la probabilità di 1 su 1015 che lo stesso DNA possa appartenere a due individui diversi. Fig 5. Profilo genetico degli individui A e B relativo a 2 microsatelliti. L’individuo A è eterozigote per il microsatellite 1 (2 bande arancioni) e omozigote per il microsatellite 2 (1 banda gialla), mentre l’individuo B è eterozigote per entrambi i microsatelliti. Inoltre, l’individuo A non condivide alleli del microsatellite 1 con l’individuo B, mentre condivide un allele del microsatellite 2.
•Polimorfismi di restrizione, RFLP Il polimorfismo di lunghezza dei frammen7 di restrizione (Restric7on Fragment Lenght Polymorphism, RFLP che si pronuncia “riflip”), deUo polimorfismo di restrizione, è dovuto alla presenza di uno SNP all’interno di una sequenza del DNA, che crea o distrugge il sito di taglio di un enzima di restrizione (Figura 6). Fig 6. Esempio di RFLP. A. Il frammento di DNA analizzato con7ene la sequenza riconosciuta dall’ER EcoRI. L’enzima taglia il DNA in corrispondenza del sito di restrizione e genera due frammen7 di DNA. B. Lo SNP si trova all’interno della sequenza riconosciuta dall’ER e determina la perdita del sito di restrizione. In questo caso, l’enzima non è in grado di tagliare il frammento di DNA, e il risultato della diges7one sarà un frammento intero.
Digerendo il DNA di individui diversi con un dato ER, si osserverà quindi un polimorfismo di lunghezza dei frammen7 di restrizione. Se un RFLP coincide o è streUamente associato ad una mutazione patologica, l’analisi del RFLP può avere u7lità diagnos7ca. E’ quello, ad esempio, che accade nella anemia falciforme (sickle cell disease), in cui la mutazione di un singolo nucleo7de causa la sos7tuzione aminoacidica che genera la globina betaS ma anche la perdita del sito di restrizione dell’enzima MstII. Analizziamo ad esempio, guardando la Figura 7, l’azione degli ER sul frammento di DNA oUenuto per PCR da un soggeUo normale (DNA1) e da un soggeUo malato, che presenta uno SNP associato alla mutazione-­‐mala\a (DNA2). In un soggeUo omozigote, nel traUo di DNA1 sono presen7 tre si7 di restrizione che vengono riconosciu7 e taglia7 dall’ER con la formazione di quaUro frammen7. Nello stesso Fig 7. Analisi di RFLP e diagnos3ca. Azione di un ER su un traUo del DNA2, a seguito della perdita di un frammento di DNA oUenuto per PCR di un soggeUo sito di restrizione a causa del SNP, lo stesso normale (DNA1), di un soggeUo malato con SNP associato all’allele mala\a (DNA2) e di un soggeUo eterozigote enzima fa solo due tagli e generando (DNA3).
solamente tre frammen7 di restrizione. Eseguendo l’eleUroforesi dei frammen7 di restrizione è possibile individuare le due condizioni: DNA1 soggeUo omozigote normale, con quaUro bande, e DNA2 soggeUo omozigote malato, con tre bande. Il DNA di un soggeUo eterozigote soUoposto a diges7one con quell’enzima esibirà un profilo eleUrofore7co con 5 bande (DNA 3). Come abbiamo visto per gli SNPs associa7, se lo SNP u7lizzato come marcatore gene7co è localizzato nel gene (caso estremo l’anemia falciforme in cui SNP e mutazione/mala\a coincidono) o vicino al gene, sia gene che marcatore segregheranno congiuntamente e, l’analisi eleUrofore7ca permeUerà di individuare il geno7po del soggeUo e l’eventuale condizione patologica. Oltre che nella diagnos7ca, l’iden7ficazione di SNP è la base della farmacogenomica, ossia la “medicina personalizzata", che sarà parte integrante della medicina del futuro prossimo. La farmacogenomica si avvale delle variazioni nei geni o di SNP associa7 per predire la risposta individuale ad un determinato farmaco. AUualmente, è circoscriUa solo ad alcuni farmaci, per lo più usa7 nella chemioterapia dei tumori, per stabilire protocolli terapeu7ci “su misura” rispeUo al profilo di mutazioni del tumore e delle metastasi di un determinato paziente. TuUavia, lo screening gene7co degli SNP includerà, in breve tempo, la risposta a mol7 farmaci di largo uso, molto efficaci ma con no7 e poten7 effe\ collaterali su alcuni sogge\. AUualmente, la grande sfida per la ricerca genomica è quella di iden7ficare i profili di SNPs associa7 a mala\e complesse e mul7geniche come il diabete, mala\e cardio-­‐vascolari, ipertensione, obesità, sidrome bipolare. 2.3. U3lizzo dei Polimorfismi del DNA I polimorfismi del DNA sono u7li come: ✓ IDENTIFICATORI di INDIVIDUALITA’: •controllo delle relazioni parentali in famiglie con mala\e mendeliane •gene7ca di popolazione •indagini di paternità (DNA fingerprin7ng) •indagini di medicina legale (DNA fingerprin7ng) ✓ MARCATORI GENETICI e ANALISI DI LINKAGE: •iden7ficazione di geni-­‐mala\a (diagnosi del portatore) •mappaggio gene7co (ordinamento dei geni sui cromosomi) e fisico (distanza fisica tra i geni) •analisi del rischio di sviluppare patologie complesse e di risposte ai farmaci 3. La percezione del gusto: segnali, cellule e receNori 3.1. Il gusto e la scoperta delle differenze di sensibilità all’amaro Il gusto è uno dei cinque sensi che ci meUe in relazione con il mondo esterno. Ci fornisce informazioni sulle caraUeris7che chimiche delle sostanze che ingeriamo, quindi ci permeUe di valutare la qualità del cibo ed evitare le sostanze nocive. I l g u s t o u 7 l i z z a i l s i s t e m a c h e m i o re c e U o r i a l e d e i re c e U o r i , localizza7 principalmente nella lingua, in grado di captare s7moli chimici e di inviare segnali al sistema nervoso che li interpreta e ne rielabora la risposta. Al polo basale le cellule gusta7ve formano sinapsi con i dendri7 dei neuroni sensoriali (fibre afferen7 gusta7ve primarie), che trasmeUono le informazioni al cervello. Le cellule gusta7ve hanno una forma a bo\cella (boUone gusta7vo): nella porzione apicale sono presen7 microvilli, Fig 8. BoNone gusta3vo. BoUone gusta7vo è formato da: 1. cellule gusta7ve, di forma allungata provviste di receUori del gusto sui microvilli (2) della membrana apicale e innervate al polo basale dal nervo sensoriale (3); 4. cellule di supporto; 5. Cellule basali
per assicurare un buon contaUo con la saliva e le sostanze in essa disciolte, mentre in quella basale avviene il contaUo sinap7co con più fibre nervose afferen7 (Figura 8). Anche se le molecole presen7 negli alimen7 sono numerosissime, solo cinque rappresentano le qualità gusta7ve di riferimento: dolce, salato, umami, amaro e acido (Figura 9). Il dolce indica la presenza di zuccheri e quindi di fon7 energe7che. Il salato viene percepito dall’assunzione di sodio e altri ioni, essenziali per il mantenimento dell’equilibrio idro-­‐salino. L’umami, descriUo per la prima volta da uno scienziato giapponese poco più di un secolo fa, è il gusto saporito proprio di alcuni alimen7 ricchi in glutammato monosodico come la salsa di soia, il brodo di carne, i pomodori maturi e il formaggio parmigiano. Così come il dolce e il salato, anche l’umami genera una risposta posi7va allo scopo di favorire l’assunzione di cibi ricchi di proteine. Amaro e acido, invece, lanciano un “segnale d’allarme”: molte sostanze tossiche e velenose presen7 in natura nei vegetali hanno un sapore amaro; l’acido può indicare cibi avaria7 in cui potrebbero essersi sviluppa7 microrganismi dannosi, allo stesso tempo avvisa anche sulla maturazione dei fru\. La percezione dell’amaro è il caraUere m a g g i o r m e n t e s t u d i a t o a p a r 7 r e F! ig 9. I cinque sapori percepiti dal gusto. Salato, dolce, umami, amaro e acido. dall’osservazione faUa nel 1931 dal chimico A. Fox. Mentre versava del fenil7ocarbammide (PTC) in una bo\glia un po’ di polvere si disperse nell’aria: un collega che lavorava in laboratorio percepì un sapore amaro mentre Fox non senv alcun gusto. Per capire meglio le differenze di sensibilità, Fox fece assaggiare la polvere di PTC a numerose altre persone (il PTC è tossico solo ad elevate concentrazioni). Rilevò che la maggior parte degli individui si divide in due categorie: quelli in grado di percepire l’amaro anche a piccole concentrazioni (tasters) e quelli incapaci di percepire l’amaro (non tasters). Gli studi di popolazioni pubblica7 dal gene7sta Albert Blakeslee nel 1932 dimostrarono che il caraUere taster è determinato gene7camente, viene ereditato come un caraUere mendeliano dominante e la sua frequenza varia nelle diverse popolazioni (Figura 10, Blakeslee AF. 1932. Gene7cs of sensory thresholds: taste for phenyl thio carbamide. Proc Natl Acad Sci 18: 120-­‐130). Fig 10. Lavoro di Albert Blakeslee del 1932
3.2. StruNura dei receNori del gusto dolce, umami e amaro I receUori che intervengono nella percezione di dolce, amaro e umami hanno struUura simile. Come abbiamo deUo, appartengono alla famiglia dei GPCR (G Protein Coupled Receptor), la più grossa famiglia genica presente nel genoma umano. I suoi membri, più di 800, sono deputa7 alla ricezione di segnali, non solo gusta7vi e olfa\vi, ma anche di neurotrasme\tori, ormoni e ferormoni e sono le molecole bersaglio di oltre il 30% dei farmaci. Sono proteine di membrana cos7tuite da una singola catena polipep7dica che aUraversa 7 volte la membrana plasma7ca. Il dominio N-­‐
terminale è extracellulare e ha lunghezza variabile, mentre il C-­‐terminale è intracellulare. Sono anche chiama7 receUori a serpen7na (serpen7ne receptors) o receUori eptaelicali (heptahelical receptors). Fig 11. I receUori del gusto umami, dolce e amaro
I receUori presentano struUura diversa a seconda del gusto (Figura 11). L’uomo possiede circa 30 receUori per l’amaro e poiché sono state iden7ficate più di 500 molecole in grado di legarsi e molte di più sono le sostanze dal sapore amaro esisten7 in natura è probabile che ogni singolo receUore risponda a più compos7. Il receUore per l’amaro (TAS2R38), ad esempio, che si lega al gruppo 7ocianato (N-­‐C=S), è considerato poco sele\vo e risponde anche a sostanze prive del gruppo N-­‐C=S. 4. I geni della percezione del gusto 4.1. I geni della percezione del sapore amaro Numerosi sono i geni che codificano per i receUori del “gusto amaro”, localizza7 in cellule specializzate (TRCs o Taste Receptor Cells) che si trovano all’interno dei boUoni gusta7vi della lingua. Nell’uomo è stata iden7ficata una famiglia di 25 geni indica7 dalle sigle T2Rs o TAS2Rs localizza7 sui cromosomi 12, 7 e 5 che presiedono alla percezione del gusto amaro (Figura 12). La percezione gusta7va varia tra gli individui in funzione di variazioni gene7che (alleli) nei geni che codificano i receUori del gusto. TAS2R1
Fig 12. I cluster dei geni per i receUori dell’amaro. Localizzano sul braccio lungo (q) del cromosoma 7 e sul braccio corto (p) dei cromosomi 12 e 5. 4.2. Il gene TAS2R38 Il gene TAS2R38 (Cr 7) è uno dei più studia7 e codifica per il receUore TAS2R38 (biUer taste receptor). Come altri receUori del gusto (e degli odori), TAS2R38 è un piccolo gene con un singolo esone di circa 1000 nucleo7di, senza Fig 13. Struttura chimica del PROP (6-­‐n-­‐Propiltiouracile) e introni. Per la loro piccola dimensione, ques7 del PTC (feniltiocarbammide) geni si sono duplica7 facilmente durante l’evoluzione e questo spiega la loro presenza in cluster in alcune regioni cromosomiche (Figura 12). Varian7 geno7piche di questo gene influenzano la capacità di gustare, ossia di sen7re il sapore amaro di sostanze come il PROP (6-­‐n-­‐Propil7ouracile) e il PTC (fenil7ocarbammide), 7ouree che contengono il gruppo 7ocianato (N-­‐C=S), responsabile appunto del gusto amaro (Figura 13). 4.3. SNPs e aplo3pi del gene TAS2R38 Il gene TAS2R38 è presente nella popolazione umana in diverse forme alleliche determinate da tre SNPs in posizioni specifiche, esaUamente a livello dei nucleo7di 145, 785 e 886 (Tabella 2). Nella popolazione umana i diversi alleli di questo polimorfismo presentano in posizione 145 il nucleo7de C o G, in posizione 785 una C o una T, in posizione 886 una G o una A. Ques7 SNPs portano alla sos7tuzione di aminoacidi nella proteina, con conseguente cambiamento nella funzionalità della proteina stessa. La combinazione degli SNP nell’allele TASTER produce una proteina che con7ene gli aminoacidi Prolina-­‐Alanina-­‐Valina (PAV). L’allele NON-­‐TASTER, invece, produce una proteina che con7ene aminoacidi Alanina-­‐Valina-­‐Isoleucina (AVI), rispe\vamente nelle posizioni 49, 262, 296. allele PTC-­‐taster
allele PTC-­‐non taster
posizione SNP
nucleotide codone aminoacido nucleotide codone aminoacido
posizione aminoacido
145
C
CCA
P (prolina)
G
GCA
A (alanina)
49
785
C
GCT
A (alanina)
T
GTT
V (valina)
262
886
G
GTC
A
ATC
I (isoleucina)
296
V (valina)
Tabella 2. SNPs del gene TAS2R38. La combinazione degli SNP nell’allele TASTER produce una proteina che contiene gli aminoacidi Prolina-­‐Alanina-­‐Valina (PAV) nelle posizioni indicate. L’allele NON-­‐TASTER, invece, produce una proteina che contiene gli aminoacidi Alanina-­‐Valina-­‐Isoleucina (AVI).
Le combinazioni di SNPs in una definita regione di DNA prendono il nome di aplo7pi. I tre SNPs del gene TAS2R38 possono trovarsi in 23 combinazioni e quindi in oUo differen7 aplo7pi. Nella popolazione umana sono diffusi principalmente gli aplo7pi PAV e AVI. Il feno7po PAV è dominante sul feno7po AVI. Gli aplo7pi segregano in modo mendeliano, sono quindi possibili le combinazioni omozigo7 PAV/PAV o AVI/AVI e quella eterozigote PAV/AVI. Il geno7po AVI/AVI è ampiamente diffuso negli individui che manifestano il caraUere feno7pico di non taster (U) (86% degli individui AVI/AVI sono non taster), mentre le combinazioni PAV/PAV e PAV/AVI sono presen7 nella maggior parte dei feno7pi super taster (TT) e medium taster (Tt). Questa ulteriore suddivisione dei taster è basata sull’intensità della risposta e fu introdoUa con losviluppo degli studi e l’impiego nelle prove di assaggio del composto PROP, oltre al PTC. Si è visto che il 68% degli individui PAV/PAV sono TT e 64% degli individui PAV/AVI sono Tt. Nella nostra popolazione il 70% è classificato come taster, mentre il 30% è non-­‐taster, con distribuzione dei tre feno7pi all’incirca: 30% Non-­‐taster, 45% Medium-­‐taster, 25% Super-­‐taster (Tabella 3). Aplotipo
Genotipo
Fenotipo
Distribuzione
PAV/PAV
TT
super-­‐taster
0,25
PAV/AVI
Tt
medium-­‐taster
0,45
AVI/AVI
tt
non-­‐taster
0,3
Tabella 3. Distribuzione degli aplotipi, genotipi e fenotipi nella popolazione europea.
Oltre agli aplo7pi PAV e AVI, solo alcuni aplo7pi rari (AAV, AAI, e PVI), che presentano una sensibilità intermedia, sono sta7 descri\ limitatamente a specifiche popolazioni o in determinate aree geografiche (AAI popolazione sub-­‐Sahariana), come si legge nel paragrafo successivo. Frequenze del tuUo sovrapponibili sono riportate dai risulta7 del test del gusto del PTC e l’analisi dei SNP del gene TAS2R38 effeUua7 in un gruppo di più di 500 studen7 liguri (….) Come si evince da ques7 da7, i geno7pi di TAS2R38 non sono in grado di predire la totalità delle va r i a z i o n i n e l fe n o 7 p o d e l l a sensibilità al gusto amaro, e ciò implica che altri faUori (gene7ci e epigene7ci) possano essere coinvol7 nell’espressione di questo caraUere gene7co (Figura 14). Fig 14. Fattori genetici, e non, che influenzano la percezione del gusto amaro delle tiouree
4.4. Evoluzione e distribuzione del gene TAS2R38 Il gene TAS2R38 è comune a mol7 esseri viven7, e gioca un ruolo importante nella determinazione di specifiche caraUeris7che. Il saper riconoscere un sapore amaro ha preservato la vita a mol7 animali, uomo compreso, condizionando e guidando le loro abitudini alimentari. Infa\ mol7ssime sostanze tossiche di origine vegetale, come la stricnina e il chinino, sono amare: saperle riconoscere aUraverso il gusto ha consen7to la sopravvivenza sia a uomini che animali. L’interesse per capire come nel corso dell’evoluzione la selezione naturale abbia operato sugli alleli dell’amaro ha portato alla realizzazione di numerose ricerche. Nel caso specifico del gene TAS2R38 tali ricerche sono state favorite dalla facilità d’iden7ficazione della variabilità feno7pica al PTC, dalla modalità mendeliana di trasmissione del caraUere e, più di recente, dalla possibilità di analizzare le sequenze del DNA. E’ stato condoUo uno studio sulle frequenze alleliche degli aplo7pi PAV e AVI nella popolazione umana, u7lizzando un campione di europei, asia7ci, africani e nord americani, numericamente non omogenei tra loro. L’analisi delle sequenze del gene TAS2R38 ha evidenziato che i due aplo7pi PAV e AVI sono presen7 in più del 90% dei cromosomi analizza7, mentre gli aplo7pi AAV, AAI e PVI sono rari e diffusi sopraUuUo in Africa. Emerge anche, in più popolazioni, che la selezione naturale ha conservato i due alleli taster e non-­‐taster in forma pressochè bilanciata. TuUavia, in casi come il Nord America, devono esserci state pressioni sele\ve che hanno favorito l’allele taster (v. Figura 15). !
Fig 15 Istogramma con evidenziate le frequenze alleliche in diverse popolazioni. Da Wooding e al. Natural selec7on and molecular evolu7on in PTC, a biUer-­‐taste receptor gene, 2004. Per spiegare la conservazione degli alleli non taster si ipo7zza che i receUori che esprimono l’aplo7po AVI siano in grado di legare molecole dell’amaro diverse da quelle che interagiscono con il receUore espresso dall’aplo7po PAV. Ciò conferirebbe un vantaggio sele\vo agli eterozigo7, che sono così in grado di percepire più molecole dell’amaro rispeUo agli omozigo7. Questo spiegherebbe il perché del mantenimento dell’allele non taster nelle popolazioni umane. Gli studi sull’origine evolu7va della sensibilità al PTC hanno evidenziato che si traUa di un caraUere ancestrale e che le varian7 gene7che nella percezione gusta7va di Homo sapiens si svilupparono molto prima della comparsa dell’uomo moderno. L’an7ca età della variazione è stata supportata dall’analisi di un campione di osso appartenuto a un uomo di Neanderthal, vissuto circa 48000 anni fa e rinvenuto a El Sidron, nel nord della Spagna. Un’ulteriore conferma del carattere ancestrale è data dal confronto delle sequenze nucleotidiche di TAS2R38 PAV di Homo sapiens con quelle di altri primati (scimpanzè, gorilla, orango, ecc) che indica la presenza nelle stesse posizioni dei medesimi aminoacidi (prolina, alanina, valina). Possiamo dedurre che l’uomo e gli altri primati hanno ereditato gli stessi alleli taster e non-­‐taster da un antenato comune. 5. Tecniche u3lizzate 5.1 PCR (Polymerase Chain Reac3on)
Si traUa di una tecnica innova7va che consiste nell’amplificazione specifica di segmen7 di DNA mediante reazioni a catena della DNA polimerasi. Il principio è molto semplice. Data una sequenza di DNA a doppio filamento e due corte sequenze oligonucleo7diche (primer), di cui una complementare ad un traUo di filamento a una estremità del DNA da amplificare (forward primer) e l’altra complementare ad un altro traUo posto all’altra estremità (reverse primer), in presenza di una DNA polimerasi termostabile e di una miscela di desossinucleo7di trifosfa7 in appropriate condizioni di reazione, è possibile copiare numerosissime volte il traUo compreso tra i due primers, semplicemente facendo variare ciclicamente la temperatura di reazione. Infa\, raggiunta la temperatura di denaturazione (circa 95°C), la doppia elica si apre (fase di denaturazione), rendendo disponibile lo stampo per una eventuale sintesi delle catene complementari. Quando la temperatura si abbassa, in virtù delle loro minori dimensioni e della loro concentrazione, i primer si legheranno (fase di appaiamento o annealing) al DNA stampo prima che si rinaturi e, in presenza di una DNA polimerasi con un op7mum di temperatura elevato (circa 72°C), inizierà la sintesi di DNA a par7re dai primer (fase di sintesi del DNA o extension), procedendo lungo i filamen7 singoli.
Al termine del primo ciclo di PCR da una doppia elica di DNA se ne oUengono due. Ripetendo il ciclo "denaturazione – annealing – extension" numerose volte (in genere da 20 a 30), si o\ene una massiccia amplificazione specifica di un dato traUo di DNA che può quindi essere analizzato e studiato in deUaglio. Il metodo di analisi del DNA mediante PCR presenta vantaggi molto eviden7:
• è molto rapido (da 60 a 90 minu7), • la manualità è semplicissima, • è automa7zzato, • i risulta7 sono visualizzabili con facilità mediante eleUroforesi del DNA • Termociclatori
Il successo della PCR è dovuto in gran parte alla possibilità di far avvenire l’intero processo in modo automa7co all’interno di strumen7 de\ termociclatori (thermal cyclers), in grado di variare ciclicamente la temperatura tra le varie fasi di ogni ciclo di PCR. Un esempio di profilo di amplificazione standard impostato mediante un termociclatore (Fig. 16) è il seguente: Fig 16. Termociclatore
1. denaturazione del DNA: 30 sec a 94°C 2. appaiamento (annealing) dei primers: 30 sec a 50°-­‐60°C 3. sintesi (extension) di DNA: 30 sec-­‐ 5 minu7 a 72°C Le fasi 1, 2 e 3 possono ripetersi per 30-­‐35 cicli, dipende dal frammento che si deve amplificare. • Taq polimerasi
Il successo della PCR è stato possibile grazie anche all’uso di una DNA polimerasi termostabile estraUa da baUeri termofili (che vivono ad elevate temperature). Una DNA polimerasi u7lizzata nelle reazioni della PCR è la Taq polimerasi, estraUa dal baUerio Thermus aquaAcus. L’isolamento di DNA polimerasi termostabili ha sollevato gli operatori dall’ingrato compito di aggiungere enzima fresco ad ogni ciclo di reazione!
Quando bisogna amplificare frammen7 di DNA molto lunghi (5kb-­‐20kb), è necessario u7lizzare Taq polimerasi par7colari. • Scelta dei primer
Per ogni PCR, è necessario usare due primer (forward e reverse). La scelta della coppia di primer è cri7ca per una buona riuscita della PCR, ovvero per oUenere l’amplificazione di un traUo di DNA in modo specifico. I primer devono essere “disegna7” a livello di sequenze uniche nel genoma (presen7 una sola volta), in modo che possano appaiarsi al DNA solo nella zona di interesse e non in altre zone. F i g 1 7 . C e l l a e l e U r o f o r e 7 c a orizzontale per l’eleUroforesi del DNA su gel di agarosio e alimentatore.
5.2. EleNroforesi su gel di agarosio
E’ una tecnica che consente di separare in base alle loro dimensioni (peso molecolare) molecole dotate di carica, facendole migrare su un gel in presenza di un campo eleUrico. Il gel può essere immaginato come una rete tridimensionale aUraverso le cui maglie migrano le molecole soUo l’azione di un campo eleUrico. Il campo eleUrico è generato da un apparecchio, deUo alimentatore e la migrazione avviene nel gel immerso in una soluzione tampone, all’interno di una cella eleUrofore7ca (Fig. 17).
Per separare molecole di DNA si usano gel di agarosio. Le molecole di DNA sono cariche nega7vamente per la presenza di gruppi fosfato e migrano dal polo nega7vo verso il polo posi7vo. Per un certo intervallo di pesi molecolari, la velocità di migrazione è funzione del loro peso molecolare: tanto più grande è la molecola di DNA, tanto minore è la velocità di migrazione, tanto più piccola è la molecola di DNA, tanto più velocemente migra. Le molecole di DNA di diversa lunghezza vengono pertanto separate in base alla diversa velocità di migrazione.
Per poter determinare la lunghezza delle molecole di DNA in esame separate mediante eleUroforesi, viene “caricato” sul gel anche il cosiddeUo marcatore di peso molecolare, ossia una miscela di frammen7 di DNA di cui è noto il peso molecolare. Confrontando la posizione dei frammen7 a peso molecolare noto con quella dei frammen7 di DNA in esame, è possibile calcolarne il peso molecolare, ossia la lunghezza.
Dato che il peso molecolare di un frammento di DNA è proporzionale al numero di coppie di nucleo7di (basi) che lo cos7tuiscono, di solito esso viene espresso in paia di basi (bp).
Al termine della corsa eleUrofore7ca, i vari frammen7 di DNA, essendo incolori, possono essere visualizza7, immergendo il gel in un colorante. Per poter visualizzare il DNA, durante la Fig 18. Frammen7 di DNA separa7 preparazione del gel, all’agarosio si aggiunge Eurosafe, una tramite eleUroforesi su gel, colora7 con Eurosafe ed espos7 a luce sostanza che ha la proprietà di legarsi al DNA e di emeUere ultravioleUa.
fluorescenza se esposta a luce UV. Alla fine della corsa, le bande si visualizzano esponendo il gel alla luce ultravioleUa (Fig. 18). 6. Norme generali di sicurezza in laboratorio Qui di seguito sono elencate alcune norme elementari di sicurezza, che devono essere tassa7vamente rispeUate. ○ Entrando in laboratorio, individuare le vie di fuga, indicate dalla segnale7ca verde. ○ In laboratorio indossare sempre il camice. Il camice deve essere chiuso sul davan7, con maniche lunghe e polsini ad elas7co. Al termine delle a\vità, prima di lasciare il laboratorio, togliersi il camice. In ogni caso, non uscire dal laboratorio, per recarsi in altre aree (biblioteca, uffici, bar, ecc.), senza aver prima tolto il camice. ○ Non introdurre in laboratorio borse, zaini o altro materiale non necessario. ○ Gli studen7 che presentano derma77 o altre lesioni sulle mani, devono indossare guan7 prote\vi in tuUe le fasi di lavoro. ○ I guan7 vanno tol7, quando si usino strumen7 di qualsiasi natura (telefono, tas7era, strumen7 scien7fici, maniglie, ecc.). I guan7 usa7 non vanno riu7lizza7. ○ In laboratorio è vietato mangiare, bere, fumare, portare ogge\ alla bocca ed applicare cosme7ci. ○ Pulire sempre, al termine del loro u7lizzo, le apparecchiature scien7fiche e, al termine della a\vità, i piani di lavoro. ○ Seguire scrupolosamente le indicazioni di sicurezza riportate nei protocolli di esperimento. ○ Stante i cos7 eleva7 dello smal7mento, ridurre il più possibile l’uso del materiale disposable. ○ Segnalare immediatamente al personale docente qualsiasi incidente o la mancanza di materiale di protezione U3lizzo del forno a microonde ● non accendere il forno se è vuoto ● non u7lizzare il forno con materiali infiammabili ● non u7lizzare il forno con recipien7 sigilla7 (potrebbero esplodere): svitare i tappi delle bo\glie, rimuovere i coperchi ● non u7lizzare il forno con ogge\ metallici o metallizza7: (es. bo\glie coperte di stagnola) e con carta d’argento ● non riempire eccessivamente i recipien7: il liquido bollendo, potrebbe traboccare ● proporzionare la potenza e il tempo di riscaldamento al contenuto in acqua di quanto viene riscaldato. In par7colare, nel caso di soluzioni acquose, il liquido potrebbe surriscaldarsi oltre il punto di ebollizione, senza che appaiano bollicine. Ciò può portare al traboccamento improvviso di liquido bollente. Per prevenire questo pericolo, mescolare il liquido prima di scaldarlo e lasciarlo riposare per qualche minuto prima di togliere il recipiente dal forno ● u7lizzare i guan7 imbo\7 per togliere i recipien7 dal forno ● dopo l’uso pulire il forno con carta spruzzata con detersivo per vetri ● in caso di incendio del contenuto del forno, tenere chiusa la porta, spegnere il forno, staccare la spina dalla presa di corrente lasciando che il fuoco si es7ngua per soffocamento U3lizzo della centrifuga ● chiudere accuratamente il tappo delle proveUe, per evitare la fuoriuscita di liquido e la formazione di aerosol ● assicurarsi che il rotore sia bilanciato: proveUe di ugual peso devono essere inserite negli alloggiamen7 diametralmente oppos7 ● chiudere il coperchio della centrifuga prima di avviarla ● non cercare di aprire il coperchio prima del completo arresto del rotore ● in caso di fuoriuscita di liquido dalle proveUe, avver7re il personale docente U3lizzo dell’apparecchiatura per eleNroforesi ● assicurarsi che l’alimentatore sia spento, prima di collegare i morse\ ● assicurarsi che il coperchio della vascheUa sia correUamente posizionato, prima di collegare i morse\ ● alla fine della corsa, prima di rimuovere il coperchio della cella eleUrofore7ca, spegnere l’alimentatore e staccare i morse\ Smal3mento dei rifiu3 ● tuUo il materiale disposable (puntali, proveUe, pipeUe ecc.) va messo in apposi7 contenitori per rifiu7 ● cercare di ridurre al minimo il materiale da eliminare, visto i cos7 eleva7 del loro smal7mento. 7. In laboratorio 7.1. Analisi del feno3po “sensibilità all’amaro” Ogni studente meUe una strisciolina di carta con PTC al centro della lingua per alcuni secondi e prende nota del gusto che prova. Molto amaro, debolmente amaro, nessun sapore. I risulta7 di ciascun gruppo di studen7 della classe viene riportato nella tabella seguente: FENOTIPO
gr 1
gr 2
gr 3
gr 4
TOTALE
%
super-­‐taster
medium-­‐taster
non-­‐taster
TOTALE
Quanto i risulta7 della classe sono in accordo con le frequenze della popolazione caucasica riportate in leUeratura? (vedi § 4.3) 7.2. Iden3ficazione del geno3po mediante analisi del SNP C/G in posizione 145 Per iden7ficare il polimorfismo C/G in posizione 145 è necessario prima amplificare un frammento di DNA del gene TAS2R38 contenente la posizione 145. E’ necessario quindi disegnare i primer opportuni per effeUuare la PCR e scegliere un ER adaUo a dis7nguere una forma del polimorfismo dall’altro. Come si vede qui soUo, l’ER HaeIII (Haemophilus aegypAcus) riconosce e taglia la sequenza palindromica di 4 pb GGCC. Osservando le sequenze del taster e non-­‐taster, si nota che la base che genera il polimorfismo (posizione 145) si trova all’interno di una sequenza molto simile a quella riconosciuta dall’ER HaeIII. Introducendo un mismatch A/G in posizione 143 nel primer forward, tu\ i prodo\ di PCR avranno in quella posizione una G al posto di una A. Amplificando il DNA taster con questo primer, si crea il sito di restrizione per l’enzima HaeIII (143-­‐146). Il sito HaeIII non si crea nei prodo\ di PCR da DNA non-­‐taster in cui è presente il polimorfismo C/G (145). L’amplificazione con PCR e la diges7one dei prodo\ con HaeIII consente quindi di determinare il geno7po. 7.3. Protocollo di laboratorio Soluzioni e reagen3 usa3 nell’aEvità di laboratorio • tampone TBE (Tris-­‐Borato-­‐EDTA, composizione Tris 108 gr (0,89 M), acido borico 55 gr (0,89 M), EDTA 9.3 gr (0,02 M) pH 8,3, H2O fino a 1 litro. Il pH 8,3 viene raggiunto automa7camente.). Questo tampone si prepara facendo una diluizione 1:10 della soluzione “madre” TBE 10x. • DNA prodo\ con la PCR, già pron7 • marcatore di peso molecolare • agarosio in polvere (0.6 gr) • soluzione EuroSafe (1 µg/ml) • loading dye 6x, già pronto in eppendorf e contenente: • H2O dis7llata Nota di laboratorio: la concentrazione di agarosio del gel viene scelta dal ricercatore in base alle dimensioni dei frammen7 di DNA da separare. Nel nostro caso, dovendo separare frammen7 lineari di DNA compresi tra 100 e 2.000 bp (base pairs, coppie di basi), si u7lizza un gel di agarosio al 2%. Operazioni preliminari • per chi ha i capelli lunghi: legarsi i capelli con un elas7co • prima di cominciare a lavorare, lavarsi le mani • pulire il banco di lavoro con alcol e7lico denaturato • prima di cominciare l’esperimento, lo studente verrà familiarizzato con la strumentazione che dovrà u7lizzare, in modo par7colare con le micropipeUe Preparazione del gel di agarosio Preparare la vascheUa per eleUroforesi con bordi di “nastro adesivo di carta” verificare che il piano su cui si appoggia la vascheUa per eleUroforesi sia a bolla misurare 30 ml di tampone TBE 1x in un cilindro e versarli nella beuta di vetro pirex che con7ene già 0,6 gr di agarosio. AUenzione a non rovesciare la beuta. pesare la beuta contenente la soluzione di agarosio e segnare il peso sul protocollo: _______ leggere aUentemente la “Nota di sicurezza sulla u7lizzazione del forno a microonde” sciogliere l’agarosio nel forno a microonde impostato sulla potenza indicata da una figura con tre fiammelle (circa 500V) per 1 minuto. Aprire poi il forno a microonde, agitare delicatamente la soluzione con una presina, facendo aUenzione a non scoUarsi. Richiudere il forno a microonde e sciogliere la soluzione per un ulteriore minuto alla stessa potenza pesare la soluzione di agarosio (l’acqua del tampone, bollendo, è evaporata!) e riportare la soluzione di agarosio al peso originale, u7lizzando una spruzzeUa con H2O dis7llata. AUenzione: far cadere l’acqua delicatamente, facendola scivolare lungo i bordi della beuta, altrimen7 si formano delle bolle aggiungere 1µl di Eurosafe e aspeUare 3-­‐5 minu7. L’agarosio deve raggiungere una temperatura intorno ai 60°C, altrimen7 rovina il supporto di plas7ca della vascheUa dell’eleUroforesi. Quindi versare la soluzione di agarosio, evitando di formare bolle, nella vascheUa per eleUroforesi dove è già stato inserito il pe\ne, nella quale va inserito il pe\ne. I pozze\ si formano quando, una volta solidificato il gel, viene tolto il pe\ne lasciare solidificare a temperatura ambiente per circa 15 min. Quando è solidificato, il gel diventa opaco mentre si aspeUa che il gel solidifica, fare delle prove di caricamento dei pozze\ del gel su altri gel già pron7 togliere il nastro di carta dalla vascheUa e meUerla nella cella versare il tampone TBE 1x nella camera di corsa (servono circa 250 ml), evitando che si formino bolle, fino a coprire completamente il gel. Se si formano bolle, toglierle con la punta di una pipeUa Pasteur togliere lentamente il pe\ne, tenendosi perpendicolare rispeUo al gel Corsa eleNrofore3ca aggiungere 2 µl di loading dye 6x e risospendere con la micropipeUa, evitando di formare bolle. Il glicerolo presente nel loading dye serve per rendere più densa la soluzione di DNA da caricare nel pozzeUo e quindi a facilitarne l’entrata nel pozzeUo se si formano bolle, centrifugare brevemente (1 sec) in una microcentrifuga eppendorf (in gergo di laboratorio, si dice “spinnare” da spin, centrifugare) leggere aUentemente la “Nota di sicurezza sulla u7lizzazione della centrifuga” posizionare la vascheUa per l’eleUroforesi su un foglio nero, perchè sia più facile individuare i pozze\ caricare lentamente ciascun campione (10 µl) nei singoli pozze\ (ogni pozzeUo ha un volume di circa 15 µl), ponendosi con la punta della micropipeUa in un angolo del pozzeUo e perpendicolare rispeUo al gel, facendo aUenzione a non bucare il fondo del pozzeUo stesso e a non far uscire il campione fuori dal pozzeUo in un pozzeUo laterale, caricare il marker di DNA a peso molecolare noto chiudere il coperchio della cella eleUrofore7ca leggere aUentemente la “Nota di sicurezza sulla u7lizzazione dell’apparato per eleUroforesi” collegare i morse\ alla camera di corsa e ai poli del generatore di corrente, deUo anche power supply; il DNA è carico nega7vamente e migra verso il polo posi7vo fissare il voltaggio al valore costante di 100 V e lasciare procedere la corsa eleUrofore7ca per circa 20 min fare aUenzione che la banda del blu di bromofenolo non esca dal gel (altrimen7 alcune bande di DNA possono uscire dal gel) osservare la migrazione del loading dye per valutare la migrazione del DNA, che, essendo incolore, non si può vedere. Il blu di bromofenolo migra alla stessa velocità di un frammento di DNA a doppia elica di circa 300 bp, mentre lo xilen cianolo migra alla stessa velocità di un frammento di circa 4.000 bp. AUenzione: fermare la corsa eleUrofore7ca quando il blu di bromofenolo si trova a circa 1-­‐2 cm dalla fine del gel, in modo da evitare che il DNA esca dal gel stesso. Se dovesse succedere, si perdono i campioni di DNA! Operazioni da svolgere alla fine della corsa eleNrofore3ca al termine della corsa, indossare i guan7 monouso “disposable”, togliere delicatamente il gel dalla cella eleUrofore7ca osservare il gel al transilluminatore documentare il risultato del gel, facendo una foto al gel (ricordarsi di portare una macchina fotografica digitale!) pulire le apparecchiature ed il banco di lavoro con acqua ed etanolo denaturato dopo aver finito di lavorare, lavarsi le mani 7.4 Laboratorio di Bioinforma3ca: localizzazione dei primer all’interno del gene TAS2R38 e calcolo della lunghezza del prodoNo di PCR Usiamo il so€ware Blast per ricercare le sequenze dei primer in banca da7. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) è un programma che confronta una sequenza data (query) con le sequenze presen7 nelle banche da7 e calcola la significa7vità degli appaiamen7. Accediamo al sito web: hUp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ Scegliere NUCLEOTIDE BLAST, nella finestra incollare le sequenze dei due primer u7lizza7 per amplificare il traUo del gene TAS2R38 contenente la posizione 145. Le sequenze dei primer sono (copiare e incollare solo le par7 evidenziate in rosso): 5'-­‐CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCGG-­‐3' (FORWARD ) 44nt 5'-­‐GAGGTTGGCTTGGTTTGCAATCATC-­‐3' ( REVERSE ) 25 nt Selezionare “nucleo7de collec7on (nr/nt) e in “Program Selec7on” scegliere Op7mize for “Somewhat similar sequences (blastn)”. Clicchiamo Blast. !
Appare un grafico che mostra l’allineamento dei due primer con sequenze presen7 nel database. La percentuale di omologia è segnalata dal colore. Nel nostro caso il colore verde corrisponde ad una percentuale di sovrapposizione compresa tra il 50 e l’oUanta per cento, mentre il colore blu denota un valore inferiore. Entrambi i primer si appaiano a sequenze sia di Homo sapiens che di Pan troglodytes, Gorilla ecc., come si evince dalla maschera successiva. Cliccando su un link di questa pagina, es Homo sapiens… (12°) si viene automa7camente porta7 nella sezione “Alignments”, dove compaiono gli allineamen7 tra i primer e le sequenze trovate. !
Notate che l’iden7tà tra i due primer e la sequenza di DNA di Homo sapiens è del 100% (42/42 per il forward e 25/25 per il reverse), mentre in Pongo diventa 40/42 per poi scendere a 39/42 in altri allineamen7. Notare il valore di E-­‐value (nella figura expect). Questo parametro, espresso in termini logaritmici in base e, indica la validità degli allineamen7. Più il valore è basso, (3e-­‐11 ossia 1/3e11 ) più è alta la probabilità che l’appaiamento tra la query (il primer) e la sequenza (Sbjct) sia vera, reale e non forzata dal sistema. Cliccando sulla Sequence ID: gb|JQ272198.1|accediamo alla pagina di NCBI dove troviamo le informazioni rela7ve alla sequenza completa del gene e la sequenza stessa. Nella figura … è riportata la sequenza del gene TAS2R38 e, in evidenza, le sequenze di appaiamento dei primer. Notate che il primer forward è di 44 nucleo7di ed ha un mismatch in posizione 143. Primer forward 5’-­‐CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCGG-­‐3’ Primer reverse 5'-­‐GAGGTTGGCTTGGTTTGCAATCATC-­‐3' 25 nt Osservando i numeri che indicano le posizioni degli appaiamen7 dei primer sulla sequenza completa, possiamo dedurre la lunghezza del prodoUo che ci aUendiamo dalla amplificazione con PCR (dal primo nucleo7de del primer forward all’ul7mo nucleo7de del primer reverse). 321 – 101 = 220+1 = 221 (+ 1 perchè si deve contare anche l’ul7mo nucleo7de!) • Calcolo della lunghezza dei frammen3 aNesi dopo diges3one dei prodoE di PCR con HaeIII La diges7one del frammento di DNA taster con HaeIII genera prodo\ di 177 e 44pb. Quindi, dopo corsa eleUrofore7ca, ci dobbiamo aUendere, per i 3 geno7pi, i seguen7 risulta7: Genotipo
Lunghezza frammenti (bp)
Sito di restrizione
T/T
177+44
presente in omozigosi
T/t
221+177+44
presente in eterozigosi
t/t
221
assente in omozigosi
• Iden3ficazione dei geno3pi mediante eleNroforesi su gel di agarosio Marker = marcatore di peso molecolare, U = undigested (controllo non digerito con ER), D = digested. 8. Scenari e costruzione di alberi genealogici Per ogni scenario assegnato a ciascun gruppo, disegnare almeno due alberi genealogici compa7bili con i risulta7 della gel-­‐eleUroforesi GRUPPO 1. Campioni forni7: TT Tt U marker bianco U, U Tt (1 TT, 2 Tt, 3 U) Possibile albero 1 I, Nonna TT II, Figlia Tt x partner Tt III, 3 figli U (!) Possibile albero 2 I, Nonna U (nonno non si sa, ma deve essere T-­‐) II, Figlia Tt x partner Tt III, 3 figli TT e U, U GRUPPO 2. Campioni forni7: Tt Tt U marker bianco U, U Tt (0 TT, 3 Tt, 3 U) Possibile albero 1 I, Zio, sorella (madre) padre Tt II, 3 figli U (!) Possibile albero 2 I, Tt II, U x Tt III, Tt, U, U GRUPPO 3. Campioni forni7: TT Tt Tt marker bianco TT, U Tt (2 TT, 3 Tt, 1 U) Possibile albero 1 I, TT II, Tt, Tt III, TT,Tt,U Possibile albero 2 I, TT x Tt II, Tt, Tt III, TT,U GRUPPO 4. Campioni forni7: TT Tt U marker bianco TT, TT Tt (3 TT, 2 Tt, 1 U) Possibile albero 1 I, TT x U II, Tt, Tt III, 2 TT Possibile albero 2 I, TT II, Tt, Tt III, 2 TT, U 9. Test di autovalutazione 1. Il DNA dell'uomo è diverso da individuo a individuo ecceUo che nel caso di: A. marito e moglie B. fratello e sorella C. genitori e figli D. gemelli dizigo7ci E. gemelli monozigo7ci 2. Una molecola di DNA è formata da un filamento che in un certo traUo è cos7tuito dalla seguente sequenza nucleo7dica: 5' GGATTACCAGGCTTATGTG3'. Iden7fica quella del filamento complementare. A. 5' GGATTACCAGGCTTATGTG3' B. 3' GGATTACCAGGCTTATGTG5' C. 3' CCTAATGGTCCGCTTATGTG5’ D. 5’CCTAATGGTCCGAATACAC3’ E. 3' CCTAATGGTCCGAATACAC5' 3. Nella reazione a catena della polimerasi (PCR) il primer ha la funzione di: A. fungere da innesco cui si aUacca la DNA-­‐polimerasi B. indicare il primo nucleo7de del DNA-­‐polimerasi C. provocare la suddivisione del DNA-­‐polimerasi D. a\vare la DNA-­‐polimerasi E. a\vare i nucleo7di. 4. I Primer u7lizza7 nella PCR A. sono sequenze ripetute di DNA-­‐polimerasi. B. sono oligonucleo7di ritaglia7 dagli enzimi di restrizione C. per essere u7lizzabili devono essere presen7 molte volte nel filamento di DNA D. sono corte sequenze nucleo7diche sinte7zzate in laboratorio complementari a regioni fiancheggian7 il segmento di DNA da amplificare E. cos7tuiscono i marcatori di peso molecolare usa7 come riferimento nell'eleUroforesi. 5. I cromosomomi omologhi A. sono presen7 nelle femmine ma non nei maschi B. sono diversi per forma e dimensioni ma portano geni iden7ci C. sono diversi a seconda che si trovano nei maschi o nelle femmine D. sono i cromosomi sessuali, contrappos7 agli eterocromosomi E. sono uguali nella struUura e nella posizione occupata dai geni corrisponden7. 6. Per polimorfismo si intende: A. esistenza di geni diversi in uno stesso individuo B. esistenza di geni diversi in sequenze non codifican7 del DNA C. esistenza di geni diversi in sequenze codifican7 del DNA D. esistenza di due o più alleli diversi di uno stesso gene E. esistenza di alleli diversi lungo uno stesso cromosoma 7. Un polimorfismo può essere: (indica la risposta ERRATA) A. proteico B. gene7co C. di singolo nucleo7de D. cromosomico E. di restrizione 8. Un polimorfismo di singolo nucleo7de SNP (iden7fica la risposta ERRATA) A. crea variabilità gene7ca all'interno di una popolazione B. determina che due individui differiscono tra loro per lo 0,1% del genoma C. può essere presente sia in sequenze codifican7 che in sequenze non codifican7 D. può essere la conseguenza di una sos7tuzione nucleo7dica E. può generare o eliminare un sito di restrizione. 9. Uno SNP ( segna la proposizione ERRATA ) A: origina diversi aplo7pi B. può essere considerato un marcatore gene7co C. è ereditabile D. può trovarsi sia su un cromosoma sessuale che su un autosoma E. può determinare nel prodoUo genico la sos7tuzione di un amminoacido. 10. Restric7on enzymes: A. Separate the DNA double helix in two single strands B. Copy a restricted DNA por7on C. Introduce foreign genes in the DNA D. Cut the DNA at the level of specific nucleo7de sequences E. Eliminate segments of DNA 11. La Taq polimerasi: A. E’ un enzima estraUo da un baUerio termofilo, usato nelle reazioni della PCR B. E’ un enzima che interviene nella replicazione del DNA nelle cellule eucario7che C. E’ l’enzima che favorisce l’annealing dei primer nei termociclatori D. E’ un marcatore di peso molecolare usato nell’eleUroforesi E. E’ il colorante che permeUe di visualizzare le bande di DNA nell’eleUroforesi 12. L’eleUroforesi: A. E’ una tecnica di separazione di molecole che si basa sulle differen7 masse dei campioni analizza7 B. PermeUe di separare tra loro con chiarezza i microsatelli7 con un numero di unità di ripe7zione significa7vamente diverso in base al loro rapporto carica/massa C. Richiede l’u7lizzo di soluzioni tampone che amplificano la forza ionica dei campioni da analizzare D. Richiede l’u7lizzo di un gel di agarosio che funge da colorante per le varie bande di DNA E. E’ una tecnica di separazione di molecole che si basa sulle differen7 caraUeris7che dei campioni analizza7 13. Gli alleli VNTR sono regioni ipervariabili del DNA umano, che differiscono tra loro per: A. la localizzazione di si7 di restrizione interni riconosciu7 da enzimi di restrizione B. il numero di mutazioni pun7formi C. il numero di copie di una sequenza interna ripetuta D. la localizzazione sul cromosoma E. la capacità di ibridare con una sonda specifica a singolo locus Le endonucleasi di restrizione sono enzimi che: A. Riconoscono e tagliano esclusivamente il DNA denaturato B. Sono codifica7 dal genoma di alcuni virus e sono responsabili dei danni causa7 da una infezione virale C. Tagliano la doppia elica del DNA a livello di sequenze specifiche D. Sono responsabili di traslocazioni cromosomiche E. Determinano la formazione dei frammen7 di Okazaki 14. Quale affermazione è correUa riguardo a un APLOTIPO? A. Un aplo7po è un gruppo di SNPs associa7 sullo stesso cromosoma e che vengono eredita7 insieme B. Un gruppo di alleli di geni diversi associa7 sullo stesso cario7po e che vengono eredita7 insieme C. In un individuo eterozigote per un dato aplo7po, sono espressi solo i prodo\ allelici di un singolo aplo7po D. Un individuo eterozigote per un dato aplo7po, presenta il feno7po dell’aplo7po recessivo E. Un aplo7po è ereditato come un caraUere autosomico dominante 15. Un polimorfismo di lunghezza dei frammen7 di restrizione (RFLP) è una variazione del DNA che: A. consiste nella produzione di molteplici copie di un sito di restrizione B. causa la mancata produzione di un enzima di restrizione C. è ereditato come un caraUere autosomico recessivo D. è prodoUo da un par7colare enzima di restrizione E. genera o elimina un sito di restrizione Risposte:
1
2
A
3
4
5
6
7
8
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9
10
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B
12
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13
14
15
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C
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D
E
11
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10. Glossario Aplo3po: dal greco haplóos = singolo o semplice. Nell’uomo serie di alleli che si trovano in loci associa7 su un singolo cromosoma. DNA microsatellite: traUo di DNA ripetuto molte volte, caraUerizzato da una sequenza di due o tre nucleo7di ripetuta in gruppi, sparsi in tuUo il genoma. Enzimi di restrizione: enzimi denomina7 endonucleasi, prodo\ da baUeri, che riconoscono e tagliano le molecole di DNA estranee al baUerio. Il taglio avviene a livello di specifiche sequenze nucleo7diche (si7 di restrizione). Farmacogenomica: scienza che vuole realizzare farmaci (farmaco) mira7 al profilo gene7co (genomica) dell’individuo. Questo è possibile grazie al completamento della caraUerizzazione del genoma umano, informazione che possiamo aggiungere alle conoscenze della biologia della cellula e del nostro organismo. Applicazione delle tecniche e dei metodi della genomica allo scopo di individuare i geni associa7 a specifici fenomeni patologici, di scoprire e realizzare farmaci e di indagare le cause della diversa risposta a essi in funzione della variabilità gene7ca individuale. GPCR: G Protein Coupled Receptor (GPCR), sono proteine di membrana con seUe domini transmembrana (la catena amminoacidica passa, cioè, seUe volte aUraverso la membrana plasma7ca) e probabilmente sono la superfamiglia di proteine più eterogenea e una delle più rappresentate nel proteoma umano. Polimorfismi: il termine polimorfismo significa “molte forme”. Il polimorfismo della molecola di DNA indica una variazione della sequenza di basi nello stesso traUo di DNA (locus cromosomico) di individui diversi. I polimorfismi sono alla base della variabilità tra le persone. Primer: breve catena di RNA (nella cellula, mentre nel termociclatore, vengono usa7 primer a DNA), sinte7zzata da un enzima specifico, deUo primasi, che si appaia a un filamento stampo di DNA e serve come sito di riconoscimento al quale vengono aggiun7 nucleo7di di DNA nel corso della sua sintesi. RFLP: Restric7on Fragment Length Polymorphism, si traUa di polimorfismi di lunghezza di frammen7 di DNA prodo\ dal taglio con enzimi di restrizione. A seguito di un SNP, il sito di restrizione diventa irriconoscibile da parte dell’enzima di restrizione e si ha pertanto un cambiamento della lunghezza dei frammen7 di restrizione forma7 per diges7one da parte dell’enzima di restrizione. Sequenze palindrome: una sequenza palindromica ha la stessa sequenza nucleo7dica in entrambi i filamen7 ma in senso opposto, an7parallelo. Es: 5'-­‐gaaUc-­‐3'
3'-­‐cUaag-­‐5' SNP: Single Nucleo7de Polymorphism, mutazioni di singole coppie di basi del genoma; si riscontrano in almeno l’1% della popolazione TAS2Rs: taste receptor, type 2, receUori del gusto amaro che fanno parte di una famiglia mul7-­‐
genica di GPCR. 11. Bibliografia e Sitografia hUp://learn.gene7cs.utah.edu/content/inheritance/ptc/ hUp://bioinforma7cs.dnalc.org/ptc/anima7on/ptc.html Supervisione di: Prof. Paolo Plevani, Giovanna Viale, Cinzia Grazioli, Livia Pirovano A cura di: ● prof.ssa M. Grazia Fiorin ● prof.ssa M. Teresa Oliveira, IIS Fiocchi, Lecco ● prof. G. Pavone, IIS Fiocchi, Lecco ● doU.ssa Marisa Oppizzi