IMAGEN™ Adenovirus
IT
K610011-2...................50 Test
1. USO PREVISTO
IMAGEN™ Adenovirus test è un test di immunofluorescenza diretto
qualitativo per la determinazione dell’antigene dell’adenovirus in
campioni clinici e per la conferma della presenza dell’adenovirus
in colture cellulari.
2. SOMMARIO
Gli adenovirus sono virus a DNA senza inviluppo, a simmetria
icosaedrica.La famiglia degli adenoviridae include due generi,
gli adenovirus di origine mammifera (mastadenovirus) e gli
adenovirus di origine avicola (aviadenovirus).1 Almeno 47 sierotipi
noti di adenovirus umani sono stati identificati e caratterizzati
mediante emoagglutinazione, neutralizzazione, ibridazione del
DNA e analisi endonucleare del DNA adenovirale.1,2,3,4
Gli adenovirus umani sono associati a una vasta gamma di
malattie cliniche, sia in individui immunocompetenti che
immunocompromessi, che comprendono infezioni delle vie
respiratorie, delle congiuntive e del tratto gastro-intestinale.3,5 Le
infezioni sono comuni nei bambini e possono essere sporadiche
o epidemiche.
Approssimativamente il 5% delle malattie respiratorie acute
nei bambini e il 10% delle malattie febbrili e delle polmoniti
dell’infanzia sono state associate alle infezione da adenovirus. 3,6,7
Le infezioni oculari da adenovirus possono essere causa
di febbre faringocongiuntivale, congiuntivite follicolare o
cheratocongiuntivite epidemica.3,8
I sierotipi 40 e 41 dell’adenovirus nei bambini sono comunemente
associati a gastroenterite virale e ad essi viene attribuito il 4-15%
delle infezioni nosocomiali dei reparti pediatrici.3,9,10 In pazienti
immunocompromessi (p.e. trapianti in pazienti affetti da AIDS)
possono manifestarsi gravi infezioni sistemiche, che possono
essere causa di mortalità.3
La diagnosi di laboratorio delle infezioni da adenovirus gioca
un ruolo importante nella gestione dei pazienti e consente una
gestione e un controllo efficace delle epidemie. I metodi di
diagnosi comprendono la determinazione diretta del virus o delle
proteine virali in campioni clinici (p.e. aspirato rino-faringeo),
isolamento del virus vivo in colture cellulari monostrato, inoculate
con campioni di materiale congiuntivale, fecale o proveniente
dalle vie respiratorie e la determinazione delle immunoglobuline
specifiche per l’adenovirus.3,5
L’isolamento dell’adenovirus in campioni cinici può essere
effettuato in linee cellulari continue di provenienza
prevalentemente epiteliale, comprese le linee cellulari HeLa,
HEp-2, KB e 293, in cui gli adenovirus possono evidenziare un
caratteristico effetto citopatico. 3,5
Sono state utilizzate diverse tecniche per confermare
l’identificazione degli isolati di adenovirus, compresi test di
neutralizzazione, radioimmunoanalisi, ibridazione del DNA,
microscopia elettronica e tipizzazione elettroforetica del
DNA.11,12,13,14,15 Queste tecniche possono essere complesse,
laboriose e spesso inadeguate per un uso routinario.
Recentemente, per la determinazione diretta dell’adenovirus
in campioni clinici o in colture cellulari monostrato, sono stati
descritti test di immunofluorescenza indiretta o immunoanalisi
enzimatiche (p.e. IDEIA™ Adenovirus), con utilizzo di anticorpi
monoclonali o policlonali genere-specifici.15,16,17
I test di immunofluorescenza diretta con l’impiego di anticorpi
monoclonali specifici offrono un metodo veloce, sensibile e
specifico per la determinazione diretta degli adenovirus in
campioni clinici, come aspirati rino-faringei e strisci congiuntivali,
o per confermare la presenza di isolati di adenovirus in colture
cellulari monostrato.
IMAGEN™ Adenovirus test è un test di immunofluorescenza diretto
per la determinazione e l’identificazione di sierotipi di adenovirus
umani in campioni clinici e in colture cellulari. Il test utilizza un
anticorpo monoclonale genere-specifico per la determinazione
dell’epitopo dell’esone delle proteine dell’adenovirus, espresso in
tutti i sierotipi di adenovirus umani noti. 18
3. PRINCIPIO DEL TEST
Il test IMAGEN™ Adenovirus contiene un anticorpo monoclonale
coniugato con isotiocianato di fluoresceina(FITC). Il reagente
coniugato si lega in modo specifico a un epitopo comune
dell’esone della proteina, determinata in tutti i sierotipi di
adenovirus umano. Il reagente viene utilizzato in una tecnica
di immunofluorescenza diretta mono-passaggio. I campioni
vengono incubati con il reagente a base di anticorpo FITCconiugato per 15 minuti, successivamente l’eccesso di reagente
viene dilavato con soluzione fisiologica in tampone fosfato (PBS).
Le zone colorate vengono montate e visualizzate al microscopio,
utilizzando illuminazione epifluorescente. Se l’adenovirus è
presente, all’interno del citoplasma e/o del nucleo delle cellule
infette viene visualizzata una caratteristica fluorescenza color
verde mela vivo, contrastante con la colorazione rossa delle
cellule non infette dello sfondo.
Riconoscimenti
L’anticorpo monoclonale utilizzato in questo test è stato creato
dalla Division of Microbiological Reagents and Quality Control,
Central Public Health Laboratory, Colindale, Londra, Regno Unito.
4. DEFINIZIONI
I seguenti simboli sono stati utilizzati nelle informazioni del
prodotto.
Numero di Catalogo
Consultare le istruzioni per l’uso
N
Contenuto sufficiente per <N> test
Fabbricante
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Utilizzare entro
5. REAGENTI FORNITI
50 – Ogni kit contiene materiale sufficiente per 50 campioni
7. ATTREZZATURA
E’ necessaria la seguente attrezzatura:
diretti o preparati di coltura cellulare. - La conservabilità del kit
su scaffale è quella indicata sull’etichetta della confezione esterna.
pipette di precisione e puntali mono-uso per la dispensazione di
25μL.
5.1.
Bagno di lavaggio.
IMAGEN™ ADENOVIRUS REAGENT
Istruzioni per l’uso.
2 x 1 vetrino di controllo positivo con pozzetto
contenente cellule epiteliali umane, fissate in
acetone (HEp-2) infettate con adenovirus.
Un flacone di:
3mL di liquido di montaggio. Il liquido
di montag gio contiene un inibitore
fotosbiancante in soluzione di glicerolo (pH
10,0).
1,4mL di IMAGEN™ Adenovirus reagent. Il
reagente contiene un anticorpo monoclonale
murino purificato, specifico per un epitopo
comune presente sull’esone della proteina
dell’adenovirus, FITC-coniugato. Il coniugato
viene preparato in una soluzione tampone
proteica stabilizzata (pH 7,5), contenente
colorante Evans blu come controcolorante e
15mmol/L di azide sodica come conservante.
5.2. PREPARAZIONE, CONSERVAZIONE E RIUTILIZZO DEI
COMPONENTI DEL KIT
Al fine di garantire una performance ottimale del kit, è importante
che i componenti inutilizzati del kit vengano conservati in base
alle seguenti istruzioni:
5.2.1
VETRINI DI CONTROLLO POSITIVI I vetrini di controllo positivi vengono forniti individualmente
in sacchetti di pellicola metallizzata sigillati, contenenti azoto.
Conservare i vetrini inutilizzati a 2-8°C. La confezione contenente
il vetrino deve essere esposta a temperatura ambiente (15-30°C)
per 15 minuti prima di essere aperta.
Colorare il vetrino subito dopo l’apertura.
5.2.2
LIQUIDO DI MONTAGGIO Pronto all’uso. Conservare il liquido di montaggio a 2-8°C. Il liquido
di montaggio deve essere esposto a temperatura ambiente
(15-30°C) per 5 minuti prima di essere utilizzato.
5.2.3
REAGENTE Pronto all’uso. Conservare il reagente non utilizzato a 2-8°C. Il
reagente deve essere conservato al buio a 2-8°C ed esposto a
temperatura ambiente (15-30°C) per 5 minuti prima dell’uso.
6. REAGENTI AGGIUNTIVI
6.1. REAGENTI
Acetone fresco (per il fissaggio).
Codice del lotto
Soluzione fisiologica in tampone fosfato (PBS) a pH 7,5 per il
lavaggio dei campioni colorati e per la preparazione dei campioni.
Limiti di temperatura per la conservazione
6.2. ACCESSORI
I seguenti prodotti sono stati studiati per essere utilizzati con
IMAGEN™ Adenovirus. Per qualsiasi richiesta contattare il
distributore.
Vetrini per microscopia in vetro, ricoperti di teflon con pozzetto
singolo da 6mm di diametro (100 vetrini per confezione)
disponibili presso il distributore , (codice n. S611430-6).
Vetrini di controllo positivi (codice n.
S611330-2).
Coverslip adatto alla copertura di un pozzetto da 6mm di diametro.
Olio per immersione non fluorescente.
Microscopio epifluorescente con sistema di filtraggio per FITC
(max. lunghezza d’onda eccitazione 490nm, emissione media
lunghezza d’onda 520nm) e ingrandimento x200-x500.
Incubatrice a 37°C.
Centrifuga a bassa velocità.
Per campioni diretti
Tamponi sterili.
Estrattore di muco (solo per campioni rino-faringei).
Per la conferma della coltura
Tamponi sterili, mezzo di trasporto virale (VTM) e contenitore
adatto per la raccolta, il trasporto e la coltura di adenovirus.
Linee cellulari raccomandate per la coltura e l’isolamento di
adenovirus.
8. PRECAUZIONI
- Per uso diagnostico in vitro. Chiunque esegua analisi con
questo prodotto deve essere qualificato al suo uso ed esperto
nelle procedure di laboratorio.
8.1. PRECAUZIONI DI SICUREZZA
8.1.1
IMAGEN™ Adenovirus reagent contiene <0.1% di azide
sodica, che è un prodotto tossico. L’azide sodica può
reagire con le tubature in piombo e in rame, formando
azidi metalliche esplosive. Smaltire sempre i materiali
contenenti azide sodica, sciacquando abbondantemente
con acqua.
8.1.2
L’adenovirus presente sui vetrini di controllo positivi è
risultato non infettivo nella coltura cellulare, tuttavia
il vetrino deve essere maneggiato e smaltito come se
fosse potenzialmente infettivo.
8.1.3
Nel Reagente è presente il colorante blu di Evans.
Sebbene la concentrazione presente sia inferiore
alla percentuale necessaria affinché il prodotto sia
classificato come cancerogeno, è necessario evitare il
contatto con la pelle.
8.1.4
Osservare la massima attenzione nell’uso del liquido di
montaggio, in quanto può provocare irritazione della
pelle. In caso di contatto, la cute deve essere sciacquata
abbondantemente con acqua.
8.1.5
Non mangiare, bere, fumare, conservare o preparare
alimenti o utilizzare cosmetici nell’area di lavoro
designata.
8.1.6
Non pipettare i materiali con la bocca.
8.1.7
Prima di maneggiare campioni clinici e cellule infette,
indossare guanti monouso e lavare sempre le mani dopo
aver trattato materiali infettivi.
8.1.8
Lo smaltimento di tutti i campioni clinici deve avvenire
nell’osservanza della legislazione locale.
8.1.9
Le schede con i dati sulla sicurezza sono disponibili su
richiesta degli utenti professionisti.
8.2. PRECAUZIONI TECNICHE
8.2.1
Non utilizzare i componenti dopo la data di scadenza
stampata sulle etichette. Non miscelare o scambiare fra
di loro diverse partite/lotti di reagenti.
8.2.2
I reagenti vengono forniti in concentrazioni di lavoro
fisse. La performance del test sarà influenzata in modo
negativo dall’uso di reagenti modificati o conservati in
condizioni diverse da quelle descritte alla sezione 5.
8.2.3
Preparare esclusivamente il quantitativo di soluzione
fisiologica in tampone fosfato (PBS) necessario all’uso
giornaliero.
8.2.4
Il lavaggio in PBS è necessario. L’uso di soluzioni di
lavaggio diverse da acqua di rubinetto o acqua distillata
può compromettere i risultati dei test.
8.2.5
Evitare la contaminazione microbica dei reagenti.
8.2.6
Non congelare il reagente.
9. PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI19
Il prelievo e la preparazione dei campioni è di importanza
fondamentale nella diagnosi dell’adenovirus mediante
immunofluorescenza diretta e tecniche di coltura cellulare. I
campioni devono essere raccolti dal sito dell’infezione durante
il periodo di massima virulenza, in modo da contenere il più
possibile materiale infetto, e devono essere preparati in maniera
da preservare intatte le cellule esenti da muco aderente ecc., per
l’esame microscopico diretto dei campioni, o per preservare la
vitalità dei virus nei campioni da sottoporre a coltura.
9.1. CAMPIONI CLINICI
9.1.1 Campioni oftalmici
Prelievo
Instillare anestetico locale nell’occhio, quindi esporre la
congiuntiva superiore e inferiore. Utilizzando un tampone
con punta di cotone o in Dacron™ strofinare vigorosamente
la superficie della congiuntiva superiore e di quella inferiore,
ruotando il tampone durante il processo di prelievo, per garantire
di raccogliere materiale da tutta la superficie congiuntivale.
Preparazione dei vetrini
Ruotare il tampone con il campione, applicando una leggera
pressione, nell’area del pozzetto di 6mm del vetrino per
microscopia. Accertare che sia stata utilizzata tutta la punta del
tampone per la preparazione del vetrino. Lasciare asciugare
completamente il campione all’aria a temperatura ambiente
(15-30°C) e fissarlo in acetone fresco per 10 minuti. Lasciare
asciugare il vetrino all’aria. Se il campione non si colora
immediatamente, conservare a 4°C per una notte.
9.1.2
Aspirati/secreti rinofaringei
Prelievo
Raccogliere i campioni di materiale rino-faringeo in un estrattore
di muco attraverso un tubetto di aspirazione di 8mm di diametro.
Conservare l’estrattore e il tubetto a 2-8°C e inviarli in laboratorio
il prima possibile.
Separazione cellulare
Se necessario aggiungere 2mL di soluzione fisiologica in tampone
fosfato (PBS) al campione prima di centrifugarlo, per ridurre
la viscosità e diluire il muco. Centrifugare l’estrattore di muco a
temperatura ambiente (15-30°C) per 30 minuti a 380g. Rimuovere
il surnatante che può essere utilizzato per la coltura cellulare.
Risospendere il deposito cellulare in 2mL di PBS e pipettare
delicatamente su e giù le cellule con una pipetta a foro largo
o agitare delicatamente su vortex fino a frantumare il muco,
evidenziando il materiale cellulare. Non pipettare/agitare su
vortex con forza per evitare danni alle cellule. Una volta ottenuta
una sospensione cellulare omogenea, aggiungere ulteriore PBS, se
necessario, e pipettare o agitare su vortex dopo aver aggiunto altra
soluzione PBS e lavare ancora le cellule. Rimuovere ed eliminare
le macchie di muco ancora visibili. Il muco in eccesso deve essere
rimosso in quanto impedirebbe una adeguata penetrazione del
reagente, con conseguente fluorescenza non specifica.
Se tutte le secrezioni restano nel tubetto di aspirazione, senza
raggiungere l’estrattore di muco, dilavare le secrezioni dal tubetto
in PBS. L’operazione risulta più efficace inserendo una pipetta
pasteur nel lato terminale del tubetto inserito sull’estrattore.
Inserire la quantità di liquido adeguata nel tubetto ed espellerla
ripetutamente fino a che tutte le secrezioni aderenti alle pareti del
tubetto non saranno staccate. Pipettare su e giù la sospensione
fino a che il muco non sarà frantumato adeguatamente.
Preparazione dei vetrini
Dopo aver effettuato il processo di separazione cellulare,
centrifugare la sospensione cellulare ottenuta a temperatura
ambiente (15-30°C) per 10 minuti a 380g ed eliminare il
surnatante. Risospendere il deposito cellulare in un quantitativo
sufficiente di PBS per diluire il muco rimanente, mantenendo allo
stesso tempo un’alta densità cellulare. Inserire 25μL di deposito
cellulare risospeso nella zona del pozzetto del vetrino. Lasciare
asciugare completamente il campione all’aria a temperatura
ambiente (15-30°C) e fissarlo in acetone fresco a temperatura
ambiente (15-30°C) per 10 minuti. Se il campione non si colora
immediatamente, conservare a 4°C per tutta la notte o congelare
a –20°C per una conservazione prolungata.
9.2. COLTURA CELLULARE
Inoculazione di colture cellulari
I campioni raccolti per la diagnosi di infezioni da adenovirus devono
essere inoculati nelle linee cellulari utilizzate abitualmente in
laboratorio, in base a metodi di laboratorio consolidati. Le colture
cellulari devono essere esaminate regolarmente per evidenziare
l’effetto citopatico (CPE) e i test di emoassorbimento devono
essere effettuati a intervalli regolari. Tutte le colture positive
all’emoassorbimento o le colture che evidenziano CPE possono
essere raccolte e testate in relazione alla presenza di adenovirus.
Preparazione dei vetrini
Se si osserva emoassorbimento o CPE corrispondente a infezione
da adenovirus, raccogliere il monostrato della coltura cellulare se
almeno il 50% delle cellule è interessato.
Inserire raschiando la lamina cellulare nel terreno di coltura
liquido utilizzando una pipetta sterile. Lasciare depositare
le cellule centrifugando a 200g per 10 minuti a temperatura
ambiente (15-30°C) e rimuovere il surnatante.
Lavare le cellule risospendendo il deposito cellulare in PBS (vedi
sezione 8.2) e ripetere la centrifugazione. Rimuovere il surnatante
e risospendere il deposito cellulare in un piccolo volume di PBS
fresca per mantenere un’alta densità cellulare.
Inserire 25μL di aliquota del deposito cellulare risospeso nella
zona del pozzetto del vetrino. Lasciare asciugare completamente
il campione all’aria a temperatura ambiente (15-30°C) e fissarlo in
acetone fresco per 10 minuti. Se il campione non viene colorato
immediatamente, conservare a 4°C per una notte o congelare a
–20°C per periodi di conservazione prolungati.
10. PROCEDURA DEL TEST
FARE RIFERIMENTO ALLA SEZIONE 8.2 PRECAUZIONI TECNICHE
PRIMA DI EFFETTUARE LA PROCEDURA DI TEST.
10.1. AGGIUNTA DEL REAGENTE
Aggiungere 25μL di reagente al pozzetto da 6mm. Accertare che il
reagente copra tutta l’area del pozzetto.
e colorato evidenziano i tipici pattern fluorescenti descritti alla
sezione 11.2.1.
La diagnosi è negativa se i campioni fissati e colorati non
evidenziano fluorescenza a contatto con il reagente.
10.2. PRIMA INCUBAZIONE
Incubare i vetrini con il reagente in una camera di umidificazione
per 15 minuti a 37°C. Non lasciare asciugare il reagente sul
campione, in quanto ciò potrebbe essere causa di una colorazione
non specifica.
Per i campioni di aspirato rinofaringeo o di materiale oftalmico
colorato direttamente, devono essere osservate almeno 20
cellule dell’epitelio congiuntivale o delle vie respiratorie non
infette, prima che possa essere riportato un risultato negativo.
Vedi sezione 11.2.3 se sono presenti cellule insufficienti.
10.3. LAVAGGIO DEL VETRINO
Dilavare l’eccesso di reagente con soluzione fisiologica in tampone
fosfato (PBS), poi lavare delicatamente il vetrino in bagno agitato
contenente PBS per 5 minuti. Drenare la PBS e lasciare asciugare
il vetrino a temperatura ambiente (15-30°C).
11.2.3 Cellule insufficienti
10.4. AGGIUNTA DI LIQUIDO DI MONTAGGIO
Aggiungere una goccia di IMAGEN™ Adenovirus mounting fluid al
centro di ogni pozzetto e posizionare un coprivetrino sul liquido
di montaggio e sul campione, verificando che non vi siano bolle
d’aria.
10.5. LETTURA DEL VETRINO
Esaminare tutta la zona del pozzetto contenente il campione
colorato, utilizzando un microscopio epifluorescente. La
fluorescenza, come descritto alla sezione 11, deve essere visibile
con ingrandimento x200-x500. (I vetrini che evidenziano i risultati
migliori dovranno essere esaminati subito dopo la colorazione,
ma possono essere conservati a 2-8°C al buio per max. 24 ore).
11. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI DEI TEST
11.1. CONTROLLI
11.1.1 Vetrino di controllo positivo
ll vetrino di controllo positivo, colorato e visualizzato, come
descritto alla sezione 10, deve evidenziare cellule con fluorescenza
intracellulare, nucleare e/o citoplasmatica color verde mela,
contrastante con il fondo rosso del materiale di controcolorazione.
Queste cellule sono leggermente più grandi delle cellule delle vie
respiratorie o dell’epitelio congiuntivale ma devono evidenziare
una simile fluorescenza intracellulare, nucleare e/o citoplasmatica
se infettate con adenovirus. I vetrini di controllo positivo devono
essere utilizzati per verificare che la procedura di colorazione sia
stata effettuata in modo soddisfacente.
11.1.2 Controllo negativo
Se è necessario un controllo negativo, si consiglia di utilizzare
cellule intatte, non infettate, del tipo utilizzato per la coltura e
l’isolamento dell’adenovirus. Le cellule devono essere preparate e
fissate come descritto nella sezione 9.2 e colorate come descritto
nella sezione 10.
11.2. CAMPIONI CLINICI
11.2.1 Aspetto delle cellule infettate da adenovirus
Le cellule delle vie respiratorie o dell’epitelio congiuntivale
infettate da adenovirus devono evidenziare fluorescenza
intracellulare, nucleare e/o citoplasmatica verde mela.
Le cellule non infettate si colorano di rosso con controcolorante
Evans blu.
11.2.2 Interpretazione dei risultati
La diagnosi è positiva se una o più cellule del campione fissato
Se le cellule presenti sul vetrino non sono sufficienti, il resto del
campione clinico dovrà essere centrifugato a 380g per 10 minuti
a temperatura ambiente (15-30°C). Risospendere le cellule in un
volume minore di PBS prima della redistribuzione (25μL) nella
zona del pozzetto. In alternativa, occorre ripetere il campione
clinico.
11.3. CONFERMA DELLA COLTURA CELLULARE
11.3.1 Aspetto delle cellule infettate da adenovirus
Le cellule infettate evidenzieranno fluorescenza intracellulare,
nucleare e/o citoplasmatica color verde-mela e dovranno essere
registrate come positive per l’adenovirus.
Le cellule non infettate si colorano di rosso con controcolorante
Evans blu.
11.3.2 Interpretazione dei risultati
La diagnosi è positiva se almeno una delle cellule del campione
fissato e colorato evidenzia i tipici pattern fluorescenti descritti
nella sezione 11.3.1.
Almeno 50 cellule non infettate della coltura cellulare da
sottoporre al test devono essere osservate nel pozzetto del
vetrino prima che possa essere riportato un risultato negativo.
Vedi sezione 11.2.3 se le cellule presenti non sono sufficienti.
11.3.3 Cellule insufficienti
Se nel preparato del vetrino non sono presenti cellule sufficienti,
il resto del campione clinico dovrà essere centrifugato a 200g per
10 minuti a temperatura ambiente (15-30°C). Risospendere in un
volume minore di PBS prima della redistribuzione (25μL) nella
zona del pozzetto.
In alternativa, un campione ripetuto dovrà essere reinoculato
sui monostrati cellulari freschi e la coltura cellulare dovrà essere
ripetuta.
12. LIMITI DI PERFORMANCE
12.1. Utilizzare esclusivamente il liquido di montaggio fornito
con IMAGEN™ Adenovirus test.
12.2. L’aspetto visivo dell’immagine fluorescente ottenuta può
variare a causa del tipo di microscopio e della sorgente
luminosa utilizzati.
12.3. Si raccomanda di utilizzare 25μL di reagente per coprire la
zona del pozzetto da 6mm. Un volume minore potrebbe
essere insufficiente per coprire la zona del campione e
potrebbe ridurre la sensibilità.
12.4. Tutti i reagenti vengono forniti in concentrazioni di lavoro
fisse. La performance del test può essere influenzata dalla
modifica dei reagenti o se questi non vengono conservati
alle condizioni raccomandate nella sezione 5.
12.5. La mancata determinazione dell’adenovirus può essere
attribuita a un prelievo inadeguato, a una campionatura
e/o a un trattamento inadeguato del campione, a coltura
cellulare insufficiente ecc. Un risultato negativo non
esclude la possibilità di un’infezione da adenovirus.
12.6. La presenza dell’adenovirus nelle secrezioni rinofarinegee
non esclude necessariamente la possibilità di una
concomitante infezione da altri agenti patogeni.
Tutti i risultati positivi devono essere interpretati con
precauzione, in quanto l’adenovirus è soggetto a latenza e
a recrudescenza. Entro 18 mesi dall’infezione si può avere
una ricaduta asintomatica.20 I risultati dei test devono
essere interpretati congiuntamente alle informazioni
disponibili sugli studi epidemiologici, nel contesto
della diagnosi clinica del paziente e di altre procedure
diagnostiche.
12.7. I risultati dei test devono essere interpretati
congiuntamente alle informazioni disponibili sugli studi
epidemiologici, nel contesto della valutazione clinica del
paziente e di altre procedure diagnostiche.
13. VALORI PREVISTI
Gli appartenenti a diversi sottogeneri di adenovirus evidenziano
distintamente diversi tropismi organici.
Tuttavia, la malattia si manifesta principalmente con infezioni
respiratorie, oculari ed enteriche. La quota di isolamento positivo
varierà in base al test utilizzato, alla correttezza del prelievo
del campione, all’età della popolazione sottoposta al test e al
sovraffollamento della popolazione sottoposta allo studio.
La frequenza dell’isolamento è influenzata dalla severità delle
malattie associate al virus e dalla tendenza del ceppo virale a
causare infezioni persistenti con ricadute di infezioni virali per
periodi prolungati.
Gli adenovirus sono responsabili del 5% delle infezioni acute
delle vie respiratorie nei bambini di età inferiore a 4 anni e
sono responsabili del 10% dei ricoveri in ospedale dei bambini
appartenenti a questo gruppo di età.3,6,7La cistite emorragica acuta
nei bambini può essere causata da adenovirus. Gli adenovirus
enterici sono responsabili del 4%-15% dei ricoveri in ospedale di
bambini affetti da gastroenterite virale, in prevalenza bambini di
età inferiore a 3 anni. 3,11,12
Le infezioni oculari da adenovirus (cheratocongiuntivite
epidemica e congiuntivite delle piscine) possono manifestarsi in
ogni gruppo di età, così come le infezioni da adenovirus in pazienti
immunosoppressi. 3,8
Negli adulti gli adenovirus sono stati isolati da lesioni cervicali e
del pene e in infezioni acute delle vie respiratorie, in particolare
nel personale militare.
14. CARATTERISTICHE DI PERFORMANCE SPECIFICHE
14.1. SPECIFICITA’ DELL’ANTICORPO MONOCLONALE IN
RELAZIONE AI SIEROTIPI DI
ADENOVIRUS
E’ dimostrato che l’anticorpo monoclonale utilizzato in questo
test reagisce con un epitopo genere-specifico dell’esone della
proteina dell’adenovirus, presente in tutti i sierotipi umani.
14.2. STUDI CLINICI
IMAGEN™ Adenovirus test è stato studiato in due centri di
sperimentazione clinica per l’impiego diretto su secrezioni
rinofaringee, prelevate da bambini e da adulti ricoverati con
sintomatologia da infezione delle vie respiratorie. Il test è
stato inoltre studiato presso un centro leader nel campo
dell’oftalmologia su campioni di materiale congiuntivale prelevato
da pazienti con congiuntivite. Tre centri di sperimentazione
hanno studiato IMAGEN™ Adenovirus test in relazione alla
determinazione dell’adenovirus in colture cellulari.
I centri di sperimentazione hanno testato direttamente 474
campioni clinici di materiale proveniente dalle vie respiratorie
e 179 campioni di materiale congiuntivale, oltre a 296 campioni
per la conferma della coltura. Nei test standard dei campioni
diretti sono state utilizzate colture cellulari con o senza
immunofluorescenza indiretta e per la conferma della coltura
fluorescenza indiretta di anticorpi policlonali o neutralizzazione
specifica.
Tutti i calcoli presuppongono una sensibilità e una specificità pari
al 100% dei test standard. La sensibilità, la specificità e i valori
predittivi sono stati calcolati secondo le modalità descritte in
precedenza.21
14.3. PERFORMANCE CLINICA
14.3.1 Campioni diretti
La tabella 14.1 indica i risultati dell’IMAGEN™ Adenovirus
test reagent. L’incidenza generale dell’adenovirus in questa
popolazione era pari a 9,1% (43/474). I risultati erano correlati
ai test standard in 468 casi (98,7%). La sensibilità dell’IMAGEN™
Adenovirus test era pari a 86,0% (37/43) e la specificità pari al
100% (431/431). I valori predittivi dei risultati positivi e negativi
erano pari rispettivamente a 100% (37/37) e a 98,6% (431/437).
Tabella 14.1
Comparazione dei risultati di IMAGEN™
Adenovirus test e di colture cellulari su campioni rinofaringei in
due centri di sperimentazione.
*1)
RISULTATO
Neg
Neg
431
Tabella 14.2
Comparazione dei risultati dei test in
IMAGEN™ Adenovirus test e in colture cellulari su campioni
oftalmici umani
TEST
Metodo di riferimento
IMAGEN™ Adenovirus
N. di campioni (179)
RISULTATO
Neg
Neg
142
Pos
Pos
32
Pos
Neg
3*
Neg
Pos
2**
*
Secrezione rinofaringea
Sono stati testati campioni clinici freschi durante l’inverno
1988/89 e campioni conservati (congelati) prelevati fra il 1978
e il 1988. I due centri hanno confrontato IMAGEN™ Adenovirus
test con metodi di riferimento. Il risultato dei metodi di
riferimento veniva considerato positivo se o la coltura cellulare o
l’immunofluorescenza indiretta erano positive. Ciò ha permesso
di rilevare la presenza del virus non vitale attraverso fluorescenza
o la determinazione del virus esente da cellule attraverso la
coltura cellulare. Nell’IMAGEN™ Adenovirus test un campione
veniva considerato positivo se si potevano evidenziare una o più
cellule epiteliali fluorescenti (vedi sezione 11.2).
TEST
Metodo di riferimento
IMAGEN™ Adenovirus
N. di campioni (474)
una o più cellule epiteliali fluorescenti (vedi sezione 11.2). Il
campione veniva considerato positivo nel test di coltura cellulare
se l’immunofluorescenza indiretta confermava l’effetto citopatico.
I risultati di questo studio sono indicati nella tabella 14.2. Su
179 campioni testati, sono stati ottenuti gli stessi risultati con
entrambi i metodi in 174 campioni dopo la ripetizione del test,
evidenziando una correlazione pari a 97,2%. La sensibilità e la
specificità di IMAGEN™ Adenovirus test era pari rispettivamente
a 91,4% (32/35) e a 98,6% (142/144). I valori predittivi dei test
positivi e negativi erano rispettivamente pari a 94,1% (32/34) e
a 97,9% (142/145).
Pos
Pos
37
Pos
Neg
6*
Neg
Pos
0
4/6 campioni hanno impiegato più di 10 giorni per evidenziare CPE nella coltura. Ciò potrebbe indicare un livello molto
basso di virus presente inizialmente nel campione.
2)
2/6 campioni erano negativi all’IF indiretta.
Campioni oftalmici
L’IMAGEN™ Adenovirus test è stato studiato contro un sistema
di coltura cellulare affermato. Sono stati prelevati tamponi
congiuntivali da 179 pazienti affetti da congiuntivite, in cura in
un ospedale oftalmico. L’incidenza di infezioni da adenovirus nel
gruppo di popolazione studiato era pari a 19,6% (35/179). Gli
strisci sono stati ricavati da tamponi eseguiti presso la struttura
clinica e i tamponi sono stati posti su terreno di trasporto per la
valutazione della coltura cellulare. Nell’IMAGEN™ Adenovirus
test il campione veniva considerato positivo se si osservavano
Materiale insufficiente per testare nuovamente uno dei
campioni.
** Entrambi i campioni sono stati sottoposti a coltura per solo
2 giorni.
14.3.2 Conferma della coltura cellulare
Branhamella catarrhalis
Candida albicans
Chlamydia psittaci
Chlamydia trachomatis
Coxsackie virus
Cytomegalovirus
Echovirus
Virus di Epstein-Barr
Haemophilus influenzae
Virus del Herpes simplex
Virus dell’influenza A & B
Legionella pneumophila
Virus del morbillo
Virus della parotite
Mycobacterium avium
Mycobacterium intracellulare
Mycobacterium tuberculosis
Mycoplasma arginini
Mycoplasma hominis
Mycoplasma orale
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma salivarium
Neisseria cinerea
Neisseria flavescens
Neisseria gonorrhoea
Neisseria lactamica
Neisseria meningitidis A, B, C e D
Neisseria mucosa
Neisseria perflava
Neisseria pharyngis
Virus parainfluenzale tipo 1,2,3 e 4b
Pneumocystis carinii
Virus Polio virus tipo 1 e 2
Virus respiratorio sinciziale
Rinovirus
Staphylococcus aureus
Streptococcus gps A,B,C,D,F,G
Virus varicella zoster
15. BIBLIOGRAFIA
1.
Frankl, R.I.B., Fauquet, C.M., Knudson, D.L., and Brown, F. (1992)
Tre centri di sperimentazione hanno testato l’IMAGEN™
Adenovirus test su colture cellulari di campioni clinici. La
comparazione è stata effettuata con test di immunofluorescenza
indiretta e/o di neutralizzazione, per la conferma della coltura.
L’isolamento è stato eseguito su linee cellulari standard, utilizzate
per la coltura degli adenovirus. Le colture cellulari sono state
lavate in PBS prima di essere rimosse e applicate sui vetrini. I
vetrini sono stati fissati in acetone e testati utilizzando i reagenti
dell’IMAGEN™ Adenovirus test. Per questa valutazione sono
stati utilizzati sia campioni clinici freschi, isolati, che campioni
precedentemente congelati. Complessivamente sono state
valutate 296 colture. Gli isolati positivi delle colture cellulari
sono stati confermati attraverso test di immunofluorescenza o di
neutralizzazione.
2.
Classification and Nomenclature of Viruses. Fifth Report of the
International Committee on Taxonomy of Viruses. Archives of Virology
Supplement 2, Spurger Velacy, New York, pp 140-144.
Rosen, L. (1960)
3.
Haemagglutination inhibition technique for typing adenoviruses.
American Journal of Hygiene 71, 120-128
Wadell, G. (1990)
4.
Adenoviruses. In Principles and Practice of Clinical Virology (eds A.J.
Zuckerman et al) John Wiley and Sons Ltd, Chapter 4 iv, pp 267-287.
Albert, M.J. (1986)
5.
Enteric Adenoviruses.
Archives of Virology 88, 1-17.
Horwitz, M.S. (1985)
Adenoviral diseases in “Virology”, Raven Press, New York (eds B.N. Fields
et al) pp 477-495.
Mallett, R., Ribierre, M., Bonnenfant, F., Labrune, B., and Reyrole,
L. (1966)
I risultati (tabella 14.3) indicano che l’IMAGEN™ Adenovirus test
rileva tutti gli isolati di adenovirus positivi, con una sensibilità pari
al 100% (162/162). La specificità del reagente è risultata pari al
100% (134/134).
7.
Les pneumopathies graves à adenovirus.
Arch. FR. Pediatr 23: 1057-1073.
Pacini, D.L., Collier, A.M., and Henderson, F.W. (1987)
8.
Adenovirus Infections and Respiratory Illnesses in Group Day Care.
Journal of Infectious Diseases 156, No 6: 920-927.
Ford, E., Nelson, K.E., and Warren, D. (1987)
9.
Epidemiology of Epidemic Keratoconjunctivitis.
Epidemiological Reviews 9: 244-261.
Madeley, C.R. (1986)
Tabella 14.3
Comparazione dei risultati di IMAGEN™
Adenovirus test e di metodi standard per la conferma della
coltura in 3 centri di sperimentazione
TEST
Conferma standard
IMAGEN™ Adenovirus
N. di campioni (296)
RISULTATO
Neg
Neg
134
Pos
Pos
162
Pos
Neg
0
Neg
Pos
0
14.4. CROSS-REATTIVITA’
L’IMAGEN™ Adenovirus test è stato eseguito su preparati di altri
virus e organismi presenti in campioni respiratori e oftalmici o
in colture cellulari. Tutti gli organismi testati (tabella 14.4) sono
risultati negativi con l’IMAGEN™ Adenovirus test.
Tabella 14.4
Organismi testati con IMAGEN™ Adenovirus
test e risultati non reattivi
Acholeplasma laidlawii
Mycoplasma hyorhinus
6.
The emerging role of adenovirus as inducers of gastroenteritis.
Pediatric Infectious Diseases 5: 563-574.
10. Uhnoo, I., Wadell, G., Svensson, L., and Johansson, M.E. (1984)
Importance of enteric adenoviruses 40 and 41 in acute gastroenteritis
in infants and young children.
Journal of Clinical Microbiology 20: 365-372.
11. Miller, S.E., (1986)
Detection and identification of viruses by electron microscopy.
Journal of Electron Microscopy Technique 4: 265-301.
12. Darougar, S., Walpita, P., Thaker, U., Viswalingham, N., and Wishart,
M.S. (1984)
Rapid culture test for adenovirus isolation.
British Journal of Ophthalmology 68: 405-408.
13. Kidd, A.H., Harley, E.H., and Erasmus, M.J. (1985)
Specific detection and typing of adenovirus types 40 and 41 in stool
specimens by dot-blot hybridization.
J. Clinical Microbiology 22: 934-939.
14. Gomes, S.A., Nascimento, J.P., Siquera, M.M., Krawczuk, M.M.,
Pereira, H-G., and Russel W.C. (1985)
In situ hybridization and biotinylated DNA probes: a rapid diagnostic
kit for adenovirus upper respiratory infections.
Journal of Virological Methods 12: 105-110.
15. Lehtomaki, K., Julkunen I., Sandelin, K., Salonen, J., Virtanen, M.,
Ranki, M, and Hovi, T. (1986)
Rapid diagnosis of respiratory adenovirus infections in young adult men.
Journal Clinical Microbiology 24: 108-111.
16. Pereira, H.G., Azeredo, R.S., Leite, J.P.G., Andrade, Z.P., and De
Castro, L. (1985)
A combined enzyme immunoassay for Rotavirus and Adenovirus.
Journal of Virological Methods 10: 21-28.
17. August, M. J., and Warford, A.L. (1987)
Evaluation of a commercial monocloncal antibody for detection of
adenovirus antigen.
Journal of Clinical Microbiology 25, No 11: 2233-2235
18. Cepko, C.L., Whetstone, C.A. and Sharp, P.A. (1983)
Adenovirus hexon monoclonal antibody that is group specific and
potentially useful as a diagnostic reagent.
Journal of Clinical Microbiology 17: 360-364.
19. Gardner, P.S. and McQuillen, J. (1980)
Rapid virus diagnosis. Application of immunofluorescence (2nd Ed).
Butterworth, London, Chapter 5, 92-109.
20. Greenburg, S.B. and Krilov, L. (1986)
Laboratory diagnosis of viral respiratory disease.
Cumitech. No 21. ASM. Drew, W.L. and Rubin, S.J., editors.
21. Galen, R.S. (1982)
Application of the predictive value model in the analysis of test
effectiveness. In Clinics in Laboratory Medicine. Symposium on Test
Selection Strategies.
Volume 2. W. B. Saunders Company, pp 685-699.
IFU X7846, riveduta Marzo 2013
OXOID Limited, Wade Road, Basingstoke,
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