Il metabolismo delle proteine nei batteri lattici (http://molgen.biol.rug.nl/molgen/research/lactis/proteolysis.php) La capacità di molte specie batteriche di crescere su un substrato complesso come il latte è subordinata alla presenza di un efficiente sistema proteolitico che possa permettere la degradazione delle caseine in peptidi sufficientemente piccoli da essere trasportati attraverso la membrana cellulare. Il livello di attività proteolitica delle specie batteriche di interesse lattiero-caseario è tale da garantirne il loro sviluppo in latte ma non è mai così attivo da determinare la completa degradazione delle caseine attraverso il rilascio di proteasi esocellulari, come invece accade per molte specie batteriche anti-casearie (Pseudomonas, Bacillus). 1 CEP Il processo di proteolisi esercitato dai batteri lattici si può suddividere in diverse fasi temporali. Nella prima fase, le proteinasi di parete (Cell Envelope Proteinase, CEP), intervengono attaccando le caseine e generando piccoli peptidi o (nel caso di processi caseari) idrolizzando i peptidi originati dall’azione delle chimosine del caglio. In una seconda fase, i piccoli peptidi generati dall’azione delle CEP vengono trasportati all’interno della cellula da opportune proteine di trasporto (Oligopeptide permease system, Opp) dove potranno essere ulteriormente idrolizzati ad amminoacidi necessari per la crescita cellulare. In questa terza fase interviene una categoria piuttosto complessa di peptidasi costituita da endo-, ammino- e carbossi-peptidasi. Nella produzione di formaggi, questa categoria di enzimi svolgerà una importante funzione anche dopo la morte della cellula durante quella fase di processo denominata di “maturazione”. Caratteristiche delle CEP Le proteasi di parete caratterizzate a livello genetico e/o biochimico sono quelle di Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus e Streptococcus thermophilus. PrtP (type I) PrtP (type III) Lactococcus lactis PrtB Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus PrtP Lactobacillus casei PrtH Lactobacillus helveticus PrtS Streptococcus thermophilus Le CEP sopra elencate mostrano una diversa specificità di taglio nei confronti delle caseine. Di seguito sono rappresentati diversi profili HPLC in fase inversa delle miscele di peptidi ottenuti incubando tre diverse CEP di L. lactis con un idrolizzato chimosinico di caseina (αs +β). 2 Specificità di taglio di alcune CEP nei confronti della frammento caseinico αs1 (1-23) PrtH PrtP (type III) PrtP (type I) 1 5 8 9 10 13 14 16 17 18 20 21 22 23 R P K H P I K H Q G L P Q E V L N E N L L R F PrtS = Elevata frazione relativa di taglio = Media frazione relativa di taglio = Bassa frazione relativa di taglio Organizzazione genica di prtS di Streptococcus thermophilus SS PP PR A H W AN 4775 bp 1585 aa La proteina codificata da prtS è costituita da 7 diversi domini funzionali. SS rappresenta la sequenza segnale, PP il propeptide, PR il dominio catalitico, A il dominio globulare, B il dominio stabilizzante, H il dominio ad elica, W il dominio di parete e AN il dominio di ancoraggio alla parete caratterizzato dal motivo LPXTG. Grazie a questo motivo, presente nelle CEP di altre specie e estremamente conservato nelle proteine batteriche ancorate alla parete, la PrtS di S. thermophilus è molto probabilmente legata in modo covalente al tetrapeptide di cross-bridge del peptidoglicano. Questo legame, che dovrebbe essere catalizzato da una sortase, avviene tra il residuo di treonina (T) delle CEP e il tetrapeptide del peptidoglicano. 3 Rappresentazione grafica della biosintesi delle CEP N N- proteina matura prtS attiva ancorata alla parete -C membrana parete OUT C IN C- PrtM C- PrtM (lipoproteina chaperone responsabile del processamento delle Prt - presente in Lb. casei e Lc. lactis). Nessun gene prtM-like in Lb. helveticus e in S. thermophilus. Pre-prtS -N mRNA prtS prtS La caratterizzazione biochimica delle CEP dei batteri lattici ha evidenziato che questi enzimi appartengono alla classe delle serin-proteasi attivate da ioni Ca2+ e generalmente hanno degli optimun di attività a 30-37 °C a pH 7-7.5 anche se rimangono attive a temperature più basse e a pH acidi (5-5.5). 4 La CEP matura di Lactococcus lactis (PrtP-III) è costituita da una estremità N-terminale con caratteristiche analoghe alla classe enzimatica delle subtilisine e da una porzione Cterminale la cui funzione non è nota ma che nella regione distale ancora la proteina alla parete cellulare. La rimozione di ioni Ca dalla forma nativa della proteina provoca una forte diminuzione dell’attività specifica e una altrettanto marcata, ma reversibile, riduzione della stabilità termica dell’enzima (nessuna attività a 25 °C, pH 6.5). Exterkate and Alting. 1999. Appl. Environ. Microbiol., 65: 1390-1396 In questa rappresentazione grafica è riportata la regione della PrtP coinvolta nel legame con il substrato e sono indicati i residui amminoacidici coinvolti nel legame con il Ca. I residui catalitici sono indicati in grigio. 5 Le CEP di molti batteri lattici vengono rilasciate dalla parete attraverso una semplice incubazione delle cellule in un tampone privo di ioni Ca2+ che induce il rilascio degli ioni covalenti dai siti della struttura proteica suscettibili all’autoproteolisi. I siti di autoproteolisi e di legame agli ioni Ca2+ sono localizzati nel dominio B presente in diverse CEP (PrtP) ma non nella PrtS di S. thermophilus. Per questa ragione PrtS è difficilmente separabile dalla parete batterica anche utilizzando detergenti molto energici. Per quanto riguarda le CEP in cui il dominio B è presente, è stato recentemente osservato un cambio nella specificità di taglio sulla b-caseina tra la PrtP(III) di Lactococcus lactis e la sua forma rilasciata dalla cellula inseguito all’attività autoproteolitica. PrtP lavaggio delle cellule in un tampone privo di ioni Ca Ca Ca Ca Ca Ca2+ AUTOPROTEOLISI ∆PrtP Ca Ca Ca2+ liberazione nel mezzo di PrtP modificata e ancora attiva 6 Crescita diauxica di Streptococcus thermophilus in latte (Letort et al., 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68: 3162-3165) I ceppi di S. thermophilus che possiedono la CEP PrtS, mostrano in latte una chiara crescita diauxica che scompare se il latte viene implementato di amminoacidi. Questo fenomeno, che determina un rallentamento della crescita di S. thermophilus, è dovuto al fatto che amminoacidi essenziali quali Glu e Met sono presenti in latte in concentrazioni decisamente inferiori (Glu 45 mg/l, Met 1 mg/l) a quelle richieste da questa specie per crescere correttamente (Glu 200 mg/l, Met 60 mg/l). Di conseguenza, S. thermophilus deve trovare altre fonti amminoacidiche per poter raggiungere alte concentrazioni cellulari in latte. 7 espressione di prtS Per controllare i livelli di espressione del gene prtS, il promotore di questo gene è stato fuso con due geni lux (luciferasi). I livelli di fluorescenza emessa erano così proporzionali ai livelli di mRNA prtS prodotti. Si è potuto quindi verificare come la biosintesi della CEP PrtS fosse stimolata al termine della prima fase esponenziale dalla carenza di amminoacidi liberi. L’azione di PrtS sulle caseine generava nuovi peptidi, che idrolizzati da peptidasi endocellulari, rifornivano di amminoacidi essenziali la cellule che di conseguenza riattivavano la fase esponenziale di crescita. 8 La crescita diauxica di S. thermophilus si riflette in un rallentamento della velocità di acidificazione in latte. (Courtin et al., 2002. Microbiology, 148, 3413-3421.) La crescita diauxica di S. thermophilus rimane evidente anche in co-colture si S. thermophilus e L. delbrueckii subsp. bulgaricus, come ad esempio avviene nella preparazione dello yogurt. In questa associazione batterica la crescita diauxica di S. thermophilus non influenza la velocità di acidificazione del prodotto a condizione che sia presente PrtB di L. delbrueckii subsp. bulgaricus. In questo caso specifico, per garantire il raggiungimento di un adeguato pH finale (4.8-4.9) e di una buona biomassa (108-109 ufc/ml) risulta essere di fondamentale importanza la presenza di PrtB di L. delbrueckii subsp. bulgaricus mentre è ininfluente la presenza di PrtS. 9 Le peptidasi (Christensen et al., 1999. Antonie van Leeuwenhoek, 76: 217-246) La conversione dei peptidi a singoli amminoacidi e la loro successiva utilizzazione rappresentano la parte centrale delle attività metaboliche dei procarioti. Sino ad oggi, sono state caratterizzate (biochimica e genetica) circa 20 peptidasi di diverse specie batteri lattici. I sistemi peptidasici caratterizzati in maggior dettaglio sono quelli delle specie Lactobacillus helveticus e Lactococcus lactis. I batteri lattici associati all’ambiente lattiero-caseario sono generalmente auxotrofi per un numero variabile da 6 a 14 amminoacidi. Di conseguenza, la capacità di crescere in latte di molte specie di batteri lattici è subordinata all’efficienza del loro sistema proteolitico. Le peptidasi rappresentano una classe di enzimi che comprende cysteino-peptidasi, metallo-peptidasi e serin-peptidasi; si tratta di enzimi che hanno strutture quaternarie da monomeriche a ottameriche. Il sistema di classificazione più utilizzato per questi enzimi è quello che si basa sulla specificità di taglio nei confronti di substrati peptidici sintetici. 10 amminopeptidasi A (PepA) Idrolisi dall’amminoacido N-terminale. Glu, Asp. Lc. lactis, S. thermophilus. Attive sugli aa X-prolyl dipeptidyl amminopeptidasi (PepX) liberano Xaa-Pro dipeptidi dall’Nterminale di peptidi. Lb. acidophilus, Lb. delbrueckii, Lb. casei, Lb. helveticus, Lc. lactis, S. thermophilus. dipeptidasi (PepD) Idrolisi di dipeptidi ad esclusione di Val-Xaa, Ile-Xaa. L. helveticus. dipeptidasi (PepV) simile a PepD. Non idrolizza peptidi contenenti Gly all’Nterminale. Lb casei, Lb delbrueckii, Lb helveticus, Lb sake, Lb sanfrancisciensis, Lc lactis. prolina imminopeptidasi (PepI) Idrolizza peptidi contenenti Pro all’N-terminale. Lb delbrueckii, Lb helveticus. prolidase (PepQ) Idrolizza dipeptidi Xaa-Pro e mostra attività anche nei confronti di altri dipeptidi. Lb delbrueckii, Lb helveticus. prolinase (PepR) Idrolizza specificatamente dipeptidi Pro-Xaa. Lb helveticus, Lb rhamnosus. peptidasi (PepL) Idrolizza dipeptidi e tripeptidi con Leu, Ala e Pro in posizine Nterminale. Lb delbrueckii. peptidasi (PepP) Idrolizza Xaa-Pro-Pro- (Yaa)n. Lc lactis. tripeptidasi (PepT) Idrolizza tripeptidi con un ampio range di amminoacidi. Lb delbrueckii, Lb sake, Lc lactis, P pentosaceus. endopeptidasi (pepE) Lb delbrueckii, Lb helveicus. PepG simile a PepC, Lb delbrueckii, Lb helveicus. endopeptidasi (PepO) La sua attività aumenta per substrati del tipo YGGF(X)n con n da 1 a 13. Lc lactis, Lb helveticus, S thermophilus. endopeptidasi (PepF) Idrolizza oligopeptidi costituiti da 6 a 16 amminoacidi. Lc lactis. 11 Peptidi bioattivi del latte (Meisel and Bockelman, 1999. Antonie van Leeuwenhoek, 76: 207-215) Le proteine del latte contengono sequenze amminoacidiche di peptidi con caratteristiche bioattive. La formazione di questi peptidi è però conseguente al verificarsi di una adeguata azione proteolitica come quella che si può potenzialmente verificare in seguito ad un intervento microbico. = CEP = OPP = peptidasi = caseine/peptidi = peptide BIOATIVO 12 I peptidi bioattivi sono potenziali modulatori diretti o indiretti di processi metabolici dei mammiferi e quindi dell’uomo (hormone-like activity). OPPIOIDI INIBITORI DELL’ACE IMMUNOMODULANTI ANTIMICROBICI ANTICOAGULANTI CARRIERS DI MINERALI Anche se peptidi biologicamente attivi possono essere ottenuti da altre proteine animali e vegetali le proteine del latte rappresentano la fonte maggiore di biopeptidi. 13 Si tratta di opioidi peptidici atipici che differiscono dagli oppioidi endogeni (encefaline, endorfine e dynorfine) nella regione Nterminale. Sono peptidi che hanno azione inibitoria nei confronti dell’enzima ACE (angiotensin-I-converting enzyme). ACE è un enzima multifunzionale che ha un ruolo chiave nel regolare i livelli locali di diversi peptidi bioattivi. Il ruolo fisiologico dell’ACE è quello di rilasciare per azione proteolitica l’angiotensina II, uno dei più potenti agenti vasocostrittore. INIBITORI DELL’ACE angiotensinogeno angiotensina I ACE - renina angiotensina II (ERVYIHPF) (YLLF) β (YGLF) α (YQQPVLGPVR) β ACE-inhibinotory (YPFPGPI) β OPPIOIDI 14 Si tratta di peptidici derivati dalla degradazione della caseina che hanno un’azione stimolante nei confronti dei macrofagi e mostrano effetti protettivi nei confronti di infezioni batteriche (Klebsiella pneumonie. Possono avere azione immunostimolante anche gli innibitori dell’ACE e gli opioidi. IMMUNOMODULANTI CARRIERS DI MINERALI ANTICOAGULANTI Molti fosfopeptidi possono formare sali con differenti minerali ma soprattutto con il calcio. Il 30 % del fosforo del latte è legato a residui di Ser della caseina. I peptidi che derivano dalla porzione C-terminale della kcaseina sono inibitori dell’aggregazione delle piastrine e del legame tra piastrine e fibrinogeno. La sequenza di questi peptidi è caratterizzata dalla presenza di alcuni residui amminoacidici (Ile-108, Lys-112, Asp-115) analoga a quella presente nella sequenza della catena γ del fibrinogeno. Si pensa quindi che questi peptidi svolgano la loro azione anticoagulante competendo con il fibrinogeno per il legame alle piastrine. ANTIMICROBICI Si tratta di peptidi derivati dalla degradazione della lattoferrina, una glicoproteina legante il ferro ad attività antibatterica. Il frammento N-terminale di questa proteina, originato dall’azione idrolitica della pepsina, è caratterizzato dalla presenza di un ponte disolfuro intramolecolare e mostra una forte attività antibatterica. La modalità di azione battericida e la natura peptidica di queste molecole è molto simile a quella delle più note batteriocine batteriche. 15