Abstract tesi
Sintesi di peptidi fluorescenti per lo studio della specificità di substrato della proteasi NS2BNS3 del virus Dengue
Durante il mio lavoro di tesi, svolto presso il Dipartimento di Chimica Farmaceutica e
Tossicologica dell'Università degli Studi di Napoli “Federico II”, mi sono interessata allo studio
della specificità di substrato della proteasi NS2B/NS3 del virus Dengue, agente eziologico della
febbre Dengue.
I saggi condotti sui peptidi tesi a sondare la sensibilità all’idrolisi di peptidi contenenti 2 o 3
amminoacidi basici in sequenza avevano dimostrato che tutte le combinazioni di Arg e Lys
risultano essere idrolizzate con valori di Km sistematicamente più alti di quelli osservati con
l’idrolisi di peptidi derivati dalla poliproteina.
Queste informazioni ci indicano che oltre alle interazioni tra residui basici del substrato con i
sottositi da S1 a S3 dell’enzima, l’affinità per il substrato e i possibili inibitori richiede altre
interazioni in posizioni diverse da queste. Tutti i peptidi contenenti Lys in P1 sono substrati
idrolizzati con Kcat più basse, ma se i peptidi con Lys in P1 presentano una Arg in P2 sono idrolizzati
con la più bassa Km.
La miglior combinazione di amminoacidi basici è stata ottenuta con Abz-AKRRSQ-EDDnp che
viene idrolizzato con il più alto valore di Kcat. E’ da notare che tutti i substrati che contengono tre
residui basici sono sempre idrolizzati dopo l’ultimo amminoacido basico dal lato carbossi terminale,
il che indica che l’Arg e la Lys non sono accettati nel sottosito S1.
Questo dato è supportato dalla resistenza all’idrolisi operata da CF40glyNS3pro dei peptidi AbzAGRRPAQ-EDDnp e Abz-AKRRRPQ-EDDnp anche se il peptide conteneva la sequenza KRR,
presente anche nel miglior substrato.
Questi peptidi inibiscono significativamente l’enzima, perciò è possibile che l’ultima Arg di questi
peptidi entri nel sottosito S1 dell’enzima ma il legame Arg-Pro sia resistente all’idrolisi a causa della
funzione imminica della Pro.
I peptidi della serie di formula generale Bz-X-Arg-MCA, nei quali X è un amminoacido basico non
naturale con una funzione amminica o guanidinica legata ad un gruppo alifatico o aromatico, sono
idrolizzati da CF40glyNS3pro con valori Kcat/Km inferiori rispetto Boc-Arg-MCA. Le eccezioni
sono rappresentate dai peptidi contenenti una funzione amminica primaria come sostituente in
posizione 4 di un gruppo fenilico (Amf) o un gruppo alifatico quale il cicloesile (Ama ed Aca).
I risultati ottenuti con i primi peptidi sintetizzati indicavano che la funzione guanidinica dell’Arg si
adatta meglio al sottosito S2 del CF40glyNS3pro rispetto alla funzione amminica primaria della
Lys. L’inverso avviene quando il sostituente basico è attaccato ad un anello aromatico o alifatico.
Un altro risultato interessante è la Km relativamente bassa per l’idrolisi del peptide contenente la 3piridil-Ala (Pya) in cui la funzione amminica è deprotonata a pH 9. Tutte queste osservazioni sono
probabilmente importanti per una futura sintesi di inibitori della proteasi NS2B/NS3 del virus
Dengue.
I profili di pH di idrolisi ottenuti con i peptidi presentati in questo lavoro di tesi mostrano un valore
ottimale intorno a 9; tale valore non cambia anche modificando la componente salina dei buffer o
addizionando vari detergenti.
L’elevata attività di CF40glyNS3pro a pH alcalino non può sussistere nell’ambiente fisiologico
della cellula ospite e il comportamento osservato della CF40glyNS3pro potrebbe non essere quello
effettivo della proteasi native. .
I risultati ottenuti con i derivati pseudopeptidici più recenti indicano che l’incorporazione di
amminoacidi basici non naturali in brevi sequenze peptidiche modificano l’affinità e l’efficienza
catalitica.
Ulteriori disserzioni sugli effetti potrebbero permettere di usare questi e altri amminoacidi non
naturali per sviluppare inibitori efficienti per questo enzima virale.
