Corso di laurea BIOTECNOLOGIE
UNIVERSITA’
DEGLI STUDI
DI TERAMO
Fisiologia cellulare e
Laboratorio di Colture
cellulari
Prof.ssa Luisa Gioia
CdL BIOTECNOLOGIE - II anno
- C.I. FISIOLOGIA CELLULARE ED
IMMUNOLOGIA (11 CFU)
Modulo: Fisiologia cellulare e Laboratorio
Colture Cellulari (6 CFU) Prof.ssa L. Gioia
Modulo: Immunologia e Tecniche
Immunologiche (5 CFU) Prof. P.G. Tiscar
Libri di testo per Fisiologia cellulare
Zanichelli
Zanichelli editore S.p.A.
via Irnerio, 34 - 40126 Bologna
tel. +39 051 293.111/245.024
fax +39 051 249.782
B. ALBERTS - A. JOHNSON - J. LEWIS M. RAFF - K. ROBERTS - P. WALTER
BIOLOGIA MOLECOLARE
DELLA CELLULA
(esiste anche la V edizione)
Libri di testo per Fisiologia cellulare
FISIOLOGIA
Molecole, cellule e sistemi
Egidio D’Angelo e Antonio Peres
Edi-Ermes Editore
Volume 1: Principi e Fisiologia
cellulare
(per background generale e ulteriore approfondimento:
Volume 2: Funzioni d’organo e integrazione sistemica)
Libri di testo per il Lab di COLTURE CELLULARI
INTRODUZIONE ALLE COLTURE
CELLULARI
G.L. Mariottini, V. Capicchioni, L. Guida, F. Mattioli, S. Penco,
P. Romano, L. Scarabelli
II edizione - Tecniche Nuove
"Culture of animal cells: a manual of basic
technique and specialized applications"
6th Ed. book. R. Ian Freshney, Wiley-Liss, Inc., New York, NY, 2010
Alcune indicazioni pratiche…
Prenotazione esame finale on line obbligatoria all’appello del C.I.
Fisiologia cellulare e Immunologia (NON PRENOTARSI
ALL’APPELLO DI FISIOLOGIA CELLULARE I né di STRUTTURA E
FUNZIONE CELLULARE perché sono appelli relativi ad insegnamenti
di precedenti ordinamenti!)
Modalità di svolgimento esame finale di Fisiologia cellulare e Laboratorio
Colture cellulari:
-verifica orale per la parte di Fisiologia cellulare
-verifica orale o scritta per la parte di Laboratorio di Colture cellulari
Piattaforma
e-learning
PATTO
prove di
valutazione
intermedie
Corso di laurea BIOTECNOLOGIE
Fisiologia cellulare e
Laboratorio di Colture cellulari
UNIVERSITA’
DEGLI STUDI
DI TERAMO
IL MATERIALE CONTENUTO IN QUESTE
DIAPOSITIVE E’ AD ESCLUSIVO USO DIDATTICO PER
L’UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI TERAMO.
ALCUNE IMMAGINI CONTENUTE SONO STATE TRATTE DAI
SEGUENTI LIBRI:
“Biologia molecolare della cellula” – Bruce Alberts et al. (Ed. Zanichelli)
“FISIOLOGIA Molecole, cellule e sistemi” – Egidio D’Angelo e Antonio
Peres (Edi-ermes)
“Introduzione alle colture cellulari” - G.L. Mariottini et al. (Ed. Tecniche
nuove)
“Cell Biology: a short course” – S.R. Bolsover et al.
(Ed. Wiley-Blackwell)
Oggi sulla Terra vi sono da 10 a
100 milioni di specie viventi
Gli organismi viventi appaiono straordinariamente
diversi tra loro eppure tutti sono fatti di CELLULE
The cell is the basic unit of life
CELLULE
La conoscenza della struttura e delle funzioni delle
cellule è stata resa possibile dallo sviluppo delle tecniche
microscopiche
Generalmente di dimensioni dell’ordine dei µm (poche
eccezioni)
Una singola cellula può costituire un organismo vivente
(microrganismi: batteri, lieviti, amebe) o milioni di cellule
insieme possono essere organizzate in tessuti
(organismi pluricellulari)
Nei tessuti le cellule specializzate originano da cellule
non specializzate (stem cells)
In base alla struttura cellulare gli organismi
viventi si dividono in 2 gruppi principali:
Vibrio cholerae
PROCARIOTI
Batteri
E. coli
EUCARIOTI
Vegetali
Funghi
Animali
Cellula eucariotica animale
Organizzazione delle cellule procariotiche ed eucariotiche
From: Cell Biology A short
course
SR Bolsover et al.
Wiley-Blackwell
DIMENSIONI DELLE CELLULE
Cellule procariotiche: dimensioni 1-2 µm
Cellule eucariotiche: dimensioni da 5 a100µm (mediamente 20µm)
From: Cell Biology A short course
SR Bolsover et al.
Wiley-Blackwell
DIMENSIONI DELLE
CELLULE E DEI LORO
COMPONENTI
100
100
Scala tra cellule viventi e atomi e
tipi di microscopio per la loro visualizzazione
La cellula osservata al microscopio ottico o al microscopio elettronico
Il microscopio ottico usa luce
visibile di lunghezza d’onda di circa
500 nm ed ha un potere di
risoluzione di circa 250 nm, pertanto
consente di visualizzare solo i più
grandi organelli intracellulari della
cellula
Il microscopio elettronico usa
un fascio di elettroni ed ha un
potere di risoluzione pari a circa
0,2 nm, pertanto consente di
visualizzare l’ultrastruttura degli
organelli cellulari
From: Cell Biology A short course
SR Bolsover et al.
Wiley-Blackwell
In tutti gli esseri viventi le STRUTTURE della
cellula sono in stretta relazione con le loro
FUNZIONI
«Una struttura senza la funzione è un cadavere,
mentre la funzione senza una struttura è un
fantasma»:
questa simbiosi avviene a tutti i livelli di
organizzazione, da quello molecolare a quello
dell’individuo
ogni sistema biologico è il risultato di
struttura, funzione e dinamica
Nelle cellule i parametri chimico-fisici
fondamentali (temperatura, pH, composizione dei
liquidi intra ed extracellulari) devono essere
mantenuti pressochè costanti affinchè vengano
mantenute le funzioni cellulari fisiologiche
OMEOSTASI
animali meno avanzati nella scala evolutiva
hanno minore capacità omeostatica
La cellula ed il genoma
• Gli esseri viventi si riproducono trasmettendo la
loro informazione genetica alla progenie
• La cellula è l’unità minima che si riproduce
• Ogni cellula esistente sulla Terra conserva tutte
le sue informazioni nella stessa forma chimica, il
DNA, una molecola a doppio filamento
Gli esseri viventi si riproducono trasmettendo
la loro informazione genetica alla progenie
Ogni cellula esistente sulla Terra conserva tutte le sue informazioni nella stessa
forma chimica, il DNA, una molecola a doppio filamento
Il DNA nelle cellule eucariotiche
è contenuto nel nucleo e può
essere evidenziato mediante
colorazioni specifiche
alcune informazioni….
• La molecola a doppia elica del DNA se
srotolata sarebbe lunga 1,8 metri!
in essa sono scritte sotto forma di geni le
istruzioni necessarie a determinare tutte le nostre
caratteristiche
Il genoma degli Eucarioti è ricco di porzioni di DNA
che hanno solo funzioni di regolazione
• I geni umani sono 30.000-40.000
geni
(batteri: 1000-6000 geni)
Più di 200 famiglie di geni sono in comune tra
carattere
tutti gli organismi viventi
•Alcuni geni evolvono rapidamente, altri sono altamente conservati
proteine
ambiente
ORGANISMI PLURICELLULARI
sono organizzati in modo progressivamente più complesso
cellula
tessuti
organo
apparati
organismo
La cellula è l’unità minima che si riproduce
CICLO CELLULARE
duplicazione
DNA
2 cellule figlie
aventi le
stesse
informazioni
genetiche
della cellula
madre
Tutte le cellule di un organismo derivano da un’unica
cellula (zigote) da cui si sviluppa l’embrione
Tutte le cellule dell’organismo possiedono pertanto
lo stesso patrimonio genetico eppure….
differenziamento
FLUSSO DELL’INFORMAZIONE GENETICA
DNA
RNA
Tutte le cellule trascrivono porzioni
del proprio materiale genetico in una
stessa forma intermedia: l’RNA
proteine
Tutte le cellule allo stesso
modo traducono l’RNA in
proteina
Il frammento di informazione genetica corrispondente ad una
proteina è il GENE
•
Le cellule contengono 4 famiglie di piccole molecole
organiche:
1.
2.
3.
4.
zuccheri (fonte di energia e subunità dei polisaccaridi)
acidi grassi (componenti delle membrane cellulari)
amminoacidi (subunità delle proteine)
nucleotidi (subunità del DNA ed RNA)
•
Le macromolecole sono costituite da queste piccole
molecole legate insieme in lunghe catene
zuccheri
polisaccaridi
acidi grassi
Grassi, lipidi, membrane
amminoacidi
proteine
nucleotidi
Acidi nucleici (DNA, RNA)
Le caratteristiche universali delle cellule
La vita richiede energia libera
Le cellule funzionano come fabbriche biochimiche che
utilizzano le stesse unità molecolari di base
zuccheri
polisaccaridi
acidi grassi
grassi, lipidi, membrane
amminoacidi
proteine
nucleotidi
acidi nucleici (DNA, RNA)
macromolecole
Una macromolecola è
formata da più molecole
organiche (monomeri)
legati insieme da legami
covalenti in lunghe catene
Le caratteristiche universali delle cellule
Tutte le cellule…
Contengono 4 famiglie principali di
piccole molecole organiche
zuccheri (fonte di energia e subunità dei polisaccaridi)
acidi grassi (componenti delle membrane cellulari)
amminoacidi (subunità delle proteine)
nucleotidi (ATP; subunità del DNA ed RNA)
•Le piccole molecole organiche sono basate sul carbonio ;
•sono essenzialmente le stesse per ogni specie vivente;
•sono tutte costituite da una piccola serie di atomi legati tra loro con legami covalenti.
Una macromolecola è dissociata per IDROLISI dei legami che la
tengono unita (reazioni catalizzate da enzimi specifici)
idrolisi
rottura di un
legame per
intervento
dell’acqua
reazioni catalizzate da enzimi specifici
Tutte le cellule sono fatte principalmente di acqua
Le proteine svolgono diverse funzioni nella cellula
•
•
•
•
Catalizzatori delle reazioni
Componenti strutturali
Produzione di movimento
Diffusione piccole molecole fuori
e dentro la cellula
• Comunicazione cellula/cellula e
cellula/ambiente
• Sistema immunitario
• Altro
La forma di una
proteina è
determinata dalla
sequenza dei suoi
amminoacidi
-ENZIMI
-TUBULINA, ISTONI
-MIOSINA/ACTINA (muscolo)
-CANALI E POMPE DI
MEMBRANA
-NEUROTRASMETTITORI
-RECETTORI
-ANTICORPI
-ORMONI, TOSSINE,…
Le proteine si
ripiegano nella
conformazione con
energia libera più
bassa
LA MEMBRANA
CELLULARE
Tutte le cellule sono delimitate da una
membrana plasmatica attraverso la quale
devono passare nutrienti e materiali di rifiuto
continui processi di trasporto
bidirezionali
Tutte le cellule sono racchiuse da una
MEMBRANA PLASMATICA
(membrana cellulare)
Struttura comune generale: film di molecole lipidiche e proteiche
tenute insieme principalmente da interazioni non covalenti
I lipidi di membrana più abbondanti
sono i fosfolipidi
Le membrane delle cellule eucariote contengono anche COLESTEROLO
Struttura dei FOSFOLIPIDI
Orientamento dei
fosfolipidi nelle
membrane
Struttura di un ACIDO
GRASSO
(acido palmitico)
Struttura di
un ACIDO
GRASSO
(acido
palmitico)
Le membrane biologiche sono come liquidi
bidimensionali
Fluidità di membrana
•
Rapida diffusione laterale spontanea dei fosfolipidi
Flip-flop raro in assenza dei traslocatori dei
fosfolipidi
Traslocatori dei fosfolipidi: catalizzano il trasferimento
enzimi
attraverso il bilayer
Le membrane biologiche sono come liquidi
bidimensionali
Fluidità di membrana
• Colesterolo → regola la plasticità delle membrane
• La composizione della M. è varia: diversi fosfolipidi
con ruolo strutturale (fosfatidilserina carica negativa);
inositol fosfolipidi (ruolo importante nel signaling)
Il doppio strato lipidico di molte membrane cellulari
contiene anche COLESTEROLO
struttura del colesterolo
aumenta le proprietà di barriera di
permeabilità del doppio strato lipidico
Le membrane plasmatiche dei batteri non contengono
colesterolo
MEMBRANA CELLULARE
asimmetria del bilayer
domini specializzati
Asimmetria del bilayer
Molte molecole sono localizzate prevalentemente su uno dei versanti del
bilayer (ad es. alcuni fosfolipidi); i GLICOLIPIDI si trovano solo sul versante
extracellulare;
alcuni enzimi sono legati solo sul versante citosolico (es. la PKC)
molti animali sfruttano l’asimmetria dei fosfolipidi per distinguere
cellule vive e morte
apoptosi
Asimmetria della membrana cellulare
Saggio con l’Annexin V
Gadella and Harrison, (2002)
A seguito
dell’incubazione con
Annexin V nelle cellule
vengono marcate in
verde la PS e la PE
esposte sul versante
extracellulare (in questo
esperimento un altro
colorante rosso marca
l’intera membrana)
L’esposizione della
PS e PE
rappresenta un
marker di cellula
apoptotica
Le cellule
apoptotiche vengono
riconosciute ed
eliminate da cellule
specializzate
dell’organismo (es.
macrofagi)
Asimmetria del doppio strato lipidico:
molti enzimi, ad es. PLC, PKC sono legati solo sul versante citosolico e sono
generalmente coinvolti nei meccanismi di trasduzione della cellula
Fosfolipasi
(importanti per il signaling)
Zattere lipidiche (raft
lipidici): piccole aree
specializzate della membrana
in cui si concentrano alcuni
lipidi (soprattutto colesterolo
sfingolipidi e gangliosidi) e
proteine
Caveole: sottoclasse di raft
lipidici che contengono
caveolina e dirigono la
formazione di vescicole
cellulari
Nella M. plasmatica sono presenti zone specializzate dalle quali originano
VESCICOLE:
le vescicole pinocitiche possono formarsi da fosse rivestite di clatrina; in altri
casi le vescicole possono formarsi da zone dette CAVEOLE (piccole cavità)
pharmrev.aspetjournals.org
Asimmetria del bilayer
I GLICOLIPIDI sono localizzati
esclusivamente sul versante
extracellulare del bilayer
La superficie cellulare è rivestita da residui di zuccheri
(glicoproteine, glicolipidi, proteoglicani)
GLICOCALICE
•
•
•
Funzione protettiva contro danni meccanici e chimici
Tiene a distanza corpi estranei e altre cellule, impedendo
interazioni proteina-proteina non desiderate
Alcune delle catene oligosaccaridiche sono riconosciute dalle
LECTINE (proteine che legano carboidrati di membrana) che
aiutano a mediare eventi di adesione cellulare
Funzioni della membrana cellulare
• Delimita la cellula
• Trasporto: attraverso la membrana avviene il trasporto
di sostanze tra l’interno della cellula e l’ambiente esterno
• Raccoglie segnali dall’esterno (recettori) e trasferisce
le informazioni alla cellula
Ruolo funzionale
fondamentale
proteine
Le PROTEINE possono essere associate con il doppio strato
lipidico in diversi modi
questo tipo di conformazione si presta
a cambiamenti conformazionali
barile β
conformazioni
α elica
proteine
transmembrana
questo tipo di conformazione è rigida
e poco si presta a cambiamenti
conformazionali
Molte proteine
transmembranarie sono
glicosilate (i residui di
zuccheri vengono aggiunti nel
lume del RE e nel Golgi)
L’ambiente citosolico è
riducente (bassa probabilità
che si formino ponti S-S)
Le proteine di membrana possono essere solubilizzate
con un DETERGENTE (distruggono il doppio strato lipidico e portano
le proteine in soluzione come complessi detergente-lipide-proteina)
• I detergenti sono
molecole anfipatiche
che in acqua
formano micelle
•
I 2 detergenti più usati
sono il TRITON X-100
(blando detergente non
ionico) e il SDS (forte
detergente ionico)
