Diapositiva 1

TIRF-M: Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy
Tecnica di Microscopia a fluorescenza
Consente di eccitare molecole fluorescenti che si trovano in ambiente acquoso (cellula)
vicine ad una superficie solida (vetro) e ad una distanza molto piccola (meno di 100 nm)
L’eccitazione della fluorescenza in questa regione (campo di evanescenza) consente di ottenere:
Immagini con basso rumore di fondo
Fluorescenza ben focalizzata
Minima esposizione alla luce in altri piani della cellula (cellule vive)
Frigeri, 22-3-2011
Frigeri, 22-3-2011
Teoria della TIRF
Esaminiamo il caso in cui la luce attraversa un materiale trasparente
(per esempio vetro) dopo aver attraversato il vuoto o l'aria.
Il percorso subisce una rottura come mostra il disegno sottostante.
θ(2)
θ(1)
Questo fenomeno è noto come rifrazione.
n1.senθ(1)=n2.senθ(2)
La legge di Snell è una formula che
descrive le modalità di rifrazione di
un raggio luminoso nella transizione
tra due mezzi con indice di
rifrazione diverso
Un altro fenomeno molto noto è
quello della riflessione della
luce da parte di specchi piani.
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acqua
n=1.33
vetro
n=1.52
θ(2)
θ(2)
θ(2)
θ(1)
θ(1)
se:
n(1)> n(2)
θ(1) = θ(c)
θ(c)
n(1). sen θ(c) =n(2)
sen-1 θ(c) = n(2) / n(1)
θ (c)= sen-1 n(2) / n(1)
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> θ(c)
Quando θ > θcrit non appare alcun raggio rifratto: la luce incidente
subisce una riflessione interna totale ad opera dell'interfaccia.
Esso è dato dalla relazione:
,
dove θc è l'angolo critico, n2 è l'indice di rifrazione del mezzo meno denso ed n1 è l'indice di rifrazione del mezzo più denso.
Nota: la riflessione interna totale si ottiene solamente se il raggio
luminoso incidente si trova nel mezzo più denso. Se il raggio incidente è
esattamente all'angolo critico, il raggio rifratto è tangente all'interfaccia
nel punto di incidenza.
considerando un raggio di luce che si propaga
dal vetro al vuoto si ottiene un angolo critico di
circa 41°.
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TIRF: cavi a fibre ottiche
Le fibre ottiche sono costituite
da un filo di vetro circondato
da un altro vetro con indice di
rifrazione poco diverso dal
primo
Un raggio luminoso che entra nella fibra
entro un certo angolo caratteristico
della fibra viene fatto rimbalzare per
riflessione totale lungo tutta la
lunghezza del cavo e così facendo
arriva alla estremità opposta della fibra
da dove esce
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Indici di rifrazione
•
Materiale n a λ=589,3 nm
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
elio1,000 036
aria in condizioni normali1,000 292 6
anidride carbonica1,000 45
ghiaccio1,31
acqua (20°C)1,333
etanolo1,36
n è funzione della lunghezza d'onda della
glicerina1,472 9
radiazione elettromagnetica e della natura
sale1,516
del materiale attraversato, la sua misura in
bromo1,661
condizioni controllate può essere usata per
vetro (tipico)da 1,5 a 1,9
identificare il materiale stesso
diamante2,419
silicio3,4
fosfuro di gallio3,5
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In TIRF si genera un'onda di superficie, o onda evanescente (evanescent
wave), che decade esponenzialmente all'interno del mezzo con indice di
rifrazione n2.
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Intensità del campo di evanescenza
all’interfacie (z=0)
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Profondità di penetrazione e angolo
d’incidenza
La penetrazione è molto più alta ad angoli appena superiori a quello critico
Frigeri, 22-3-2011
Frigeri, 22-3-2011
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TIRF con obiettivi ad alta NA
Numerical Aperture (NA) = n • sin a/2
a= apertura angolare dell’obiettivo
Cellule con n=1.38
NA= 1.38
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Applicazioni della TIRF
Visualizzazione delle regioni contatto cellula substrato
Visualizzazione di singole molecole fluorescenti vicine alla membrana (movimenti molecolari)
Analisi cinetica dei granuli di secrezione (granuli dispersi di 2nm)
Cinetica delle interazioni tra proteine extracellulari con recettori di superficie
Turnover delle proteine
Cinetica di variazione del volume cellulare( trasporto di acqua e soluti)
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Imaging of single molecules
Frigeri, 22-3-2011
(a) Selective visualization of cell/substrate contact regions
Protein interactions at the cell membrane surface
Vinculin-GFP
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Rac-GFP
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Texas red
GFP-actin
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EPI
Tubulin
TIRF
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Cinetica di variazione del volume cellulare mediante TIRF
Calcein-AM
labs\lem--(calcein) = 494/517 nm (pH 8).
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Cinetica di variazione del volume cellulare mediante TIRF
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HELA cells
at 10 °C
0
20
40
60
80
100
120
Rat astro at 10 °C
0
10 s
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140
Henrietta Lacks
TIRF su fibre muscolari
Frigeri, 22-3-2011
Solute transport
Frigeri, 22-3-2011