ISS, 15 ottobre 2008
Pesticidi organofosforici ed effetti neuroendocrini e
comportamentali in modelli animali: rilevanza per la
valutazione dei rischi per la salute neuropsicologica in età
evolutiva.
G. Calamandrei, A. Olivieri, A, Venerosi, L. Ricceri
Dipartimento di Biologia cellulare e Neuroscienze,
Istituto Superiore di Sanità,
Roma
.
Pesticidi
sostanze o i prodotti chimici capaci di controllare, limitare, respingere o
distruggere gli organismi viventi (microrganismi, animali o vegetali)
considerati come nocivi, o di opporsi al loro sviluppo
Evidenze di interferenza con il sistema endocrino per
molti insetticidi ( o,p´-DDT, endosulfan, dieldrin, methoxychlor, kepone,
dicofol and toxaphene);
alcuni erbicidi (alachlor, atrazine and nitrofen);
fungicidi (benomyl, mancozeb and tributyl tin);
nematocidi (aldicarb e dibromochloropropane).
Neurotossicità potenzialedella maggioranza degli insetticidi:
Effetti sul SN mediati da meccanismi neuroendocrini?
LIMITI DEI PARAMETRI STIMATI PER LA VALUTAZIONE
DEI RISCHI
PER LA SALUTE UMANA
NOAEL (not osservable adverse effect level) livello di concentrazione di
un principio attivo assumibile da un animale di laboratorio nel lungo
periodo senza mostrare effetti avversi.
ADI (acceptable daily intake)
dose giornaliera di fitofarmaco accettabile per l’uomo
NOAEL/100
Questo modello non tiene in considerazione fattori molto importanti
quali la compresenza di più principi attivi contemporaneamente
(multiresiduo), spesso con analogo meccanismo d’azione,
e, per quanto riguarda il valore del singolo residuo,
gli effetti calcolati su organismi diversi da quello “tipico”
(maschio adulto di circa 70 kg)
RICONSIDERAZIONE DEI PROCESSI DI VALUTAZIONE DEL RISCHIO
VIE DI ESPOSIZIONE A UN PESTICIDA:
PECULIARITA’ DELL’ORGANISMO IN
SVILUPPO
• Periodo fetale: attraverso la placenta in
seguito ad esposizione materna
occupazionale/residenziale/attraverso la dieta
• Periodo neonatale: attraverso l’allattamento, il
contatto cutaneo, l’espirazione
• Periodo infantile: direttamente
dall’alimentazione, o esposizione a polveri in
ambiente domestico, terreno contaminato,
etc.
Il bambino non è un adulto in miniatura
ma ha specifiche caratteristiche
eto-ecologiche, che lo espongono a
maggiori rischi
• Statura: più vicino al terreno, più esposto alle
polveri
• Comportamento: portare gli oggetti e le mani
alla bocca aumenta il rischio di esposizione ai
tossici
• Dieta meno variata e più ricca di frutta
• Sistemi enzimatici di detossificazione ancora
immaturi
Scenario reale: esposizione protratta e a basse dosi
durante tutto il corso dello sviluppo pre e postnatale
RISCHIO PIU’ ELEVATO CHE PER L’ORGANISMO
ADULTO di perturbazione di molteplici processi
maturativi nel sistema nervoso, endocrino, immunitario
Fonte Eurostat 2007
INSETTICIDI ORGANOFOSFORICI
•
Inibitori dell’enzima acetilcolinesterasi, azione neurotossica
determinata dall’accumulo del neurotrasmettitore
acetilcolina nello spazio sinaptico con conseguente
sovrastimolazione della trasmissione colinergica
•
Effetti acuti da esposizione occupazionale: convulsioni,
paralisi, neuropatie legati ad inibizione AChE superiori al
60% dei valori di controllo
•
Relativamente privi di effetti avversi sull’uomo (adulto) per
esposizioni a basse dosi
Dalla seconda metà degli anni ‘90, dati sperimentali
animali indicano la possibilità di una maggiore
suscettibilità dell’organismo in sviluppo agli effetti degli
OP, e in particolare del CPF (EPA, 1996)
Gurunathan al, Environ Health Perspect, 1998: calcolando la
molteplicità delle fonti di esposizione e le caratteristiche etologiche di
bambini sotto i tre anni di età, si arriva a un’esposizione reale al clorpirifos
almeno 10 volte superiore all’ADI (0.03 mg/kg/day) stabilito per
l’organismo adulto.
Ostrea et al., Neurotoxicology, 2002: nel meconio riscontrate
concentrazioni di CPF di circa 5 mg/kg
Nel 2001, sulla base della revisione dei dati, l’impiego
residenziale
del CPF viene vietato negli Stati Uniti, così come l’uso
dello stesso insetticida nei parchi e nei luoghi pubblici
frequentati dai bambini
Dati clinici ed epidemiologici (2000-2006):
gli organofosfati interferiscono negativamente
con il neurosviluppo nell’uomo
•
•
•
•
High maternal levels of CPF in association with low
maternal levels of PON associated with significant
reduction in head circumference at birth (Berkowitz
et al., EHP, 2004)
Impaired short-term memory and attention in
children exposed to methyl-parathion (Ruckartz et
al., EHP, 2004)
Abnormal reflexes as assessed in the Brazelton
scale in neonates exposed in utero to
organophosphorous pesticides: higher levels of OP
metabolites in the mother’s urine are associated
with hyporeflexia after 3 days from birth (Young et
al., Neurotoxicology, 2005).
High chlorpyrifos levels in umbilical cord plasma
are predictive of lower neuropsychological scores
at 3 years of age: deficit in attention,
hyperactivity, low psychomotor and mental
development indexes (Rauh et al., Pediatrics,
2006)
Studi su modelli animali:effetti avversi
del CPF sul neurosviluppo
Anche in assenza di significativa inibizione AcHE,
esposizione perinatale al CPF
• altera trascrizione genica e sinaptogenesi
• colpisce sistemi di neurotrasmettitori diversi dal
colinergico(noradrenergico, serotonergico)
• neuroni bersaglio preferenziale nella fase prenatale,
cellule gliali in quella postnatale
Protocollo sperimentale di esposizione neonatale al CPF
a dosi prive di tossicità sistemica e comparabili
all’esposizione umana
Developmental stage
Postnatal day
1 4 5
Treatment
CPF
Behavioral testing
ULTRA
SOUNDS
Infancy
8 10 11
HOMING
Weaning
Adolescence
Adulthood
25
45
60
LOCOMOTOR
ACTIVITY
SOCIAL
INTERACTIONS
PASSIVE
AVOIDANCE
25
45
60
11 14
Postnatal day
CPF
Trattamento giorni 1-4: % inibizione AChE= 20%
Trattamento giorni 11-14: nessuna inibizione
Weaning
Locomotor activity
(pnd 25)
CPF 1-4
Allo svezzamento (giorno 23)
gli animali esposti al CPF nel
periodo neonatale avanzato (1114) mostravano una più elevata
attività motoria ed esplorativa,
un effetto dose dipendente.
80
Distance travelled (m)
60
40
20
CPF 11-14
*
Vehicle
CPF 1 mg
CPF 3 mg
Ricceri et al., 2003. Toxicol Appl Pharmacol
Adolescence
Total aggressive responses
(pnd 45)
CPF 1-4
15
10
Number of responses per min
All’adolescenza (giorno 45), gli animali
esposti al CPF, sia ai gg 1-4 che ai gg 1114, erano più attivi nell’esplorazione di un
nuovo ambiente (test di novelty seeking)
e
mostravano una prevalenza di interazioni
aggressive con un conspecifico non
familiare, ad un’età alla quale di solito
prevalgono i comportamenti di tipo
affiliativo
*
*
1
2
Vehicle-m
CPF 1 mg-m
CPF 3 mg-m
5
0
4
CPF 11-14
*
*
15
10
3
*
*
5
0
1
2
3
5-min-blocks
Ricceri et al., 2003. Toxicol Appl Pharmacol
4
Esposizione prenatale + neonatale al CPF
Disegno sperimentale
PLUS MAZE
Prenatal
GD15
GD18
CPF
Postnatal
Birth
PND11 PND14
2 months
4 - 5 months
CPF
SOCIAL
RECOGNITION
LOCOMOTOR
ACTIVITY
MATERNAL
BEHAVIOUR
Le dosi di clorpirifos utilizzate sono dosi al di
sotto della soglia di tossicità (inibizione
dell’acetilcolina esterasi < del 50% nel siero,
assenza di inibizione significativa nel
cervello)
e paragonabili alla massima esposizione
umana attraverso dosi subtossiche
AGONISTIC
BEHAVIOUR
Attività cerebrale e sierica della Ache
PND 0
200
Serum
% of change from Control
% of change from Control
100
80
**
60
40
20
Brain
150
100
50
0
0
3
6
3
6
Prenatal treatment CPF (mg/kg)
140
% of change from control
% of change from control
PND 15
Brain
120
100
80
60
40
20
0
veh
1
3
120
Serum
100
*
80
*
#*
60
*
*
*
40
Prenatal CPF
mg/kg
20
0
veh
Postnatal CPF (mg/kg)
1
3
veh
3 mg/kg
6 mg/kg
Open field, valutazione dell’attività
spontanea in un ambiente nuovo
Prenatal CPF
mg/kg
Frequency of Crossing
#
400
350
veh
#
*
300
3
6
*
*
250
*
*
*
*
200
150
0
1
2
3
veh
4
1
2
3
4
1
1
2
3
4
3
Postnatal CPF (mg/kg)
L’esposizione alle dosi alte di CPF
in fase prenatale e/o postnatale
determina un aumento dell’attività
locomotoria nei maschi adulti
Comportamento Agonistico
Attack response
5
8
*
Duration (s)
4
3
2
1
0
*
6
4
2
0
veh
1
veh
3
1
Postnatal CPF (mg/kg)
Submissive upright
posture
4
3
Duration (s)
Frequency
L’esposizione alle dosi alte di CPF in fase
prenatale induce un comportamento proaggressivo durante un incontro sociale
tra maschi adulti
2
1
0
veh
3
6
Prenatal CPF (mg/kg)
3
Comportamento Agonistico
Offensive upright
posture
*
Frequency
7
6
5
4
3
2
1
0
veh
3
6
Prenatal CPF (mg/kg)
7
6
Frequency
L’esposizione alle dosi alte di CPF in fase
postnatale induce un comportamento
pro-aggressivo durante un incontro
sociale tra maschi adulti
Defensive upright
posture
5
4
3
2
1
0
veh
1
3
Postnatal CPF (mg/kg)
Induzione del
comportamento materno
L’esposizione alle dosi alte di CPF in
fase postnatale aumenta i
comportamenti “materni” durante un
test di induzione materna in femmine
vergini
Sniffing
Frequency
9
7
5
3
1
0
veh
*
*
1
3
Postnatal CPF (mg/kg)
14
12
10
8
6
4
2
0
*
veh
1
Duration (s)
Frequency
Licking
3
120
100
80
60
40
20
0
veh
*
*
1
3
Postnatal CPF (mg/kg)
Frequency
3
*
*
1
3
2
1
0
veh
Duration (s)
Crouching response
50
40
30
20
10
0
*
veh
Postnatal CPF (mg/kg)
1
*
3
Riconoscimento sociale
Social Isolation (4
days)
SOCIAL INVESTIGATION
Number of episodes/min
R
T= Training (3 min)
P1
45 min
= Retest Same (3
min)
R
P1
(Anogenital,
nose and
body
sniffing)
45 min
= Retest Different (3
min)
R
Resident
P2
12
USVs
**
**
**
Veh
CPF3
CPF6
8
4
USVs
+
Social
investig
T
T
RS
Veh
RS
CPF1
T
RS
CPF3
Postnatal Treatment
ULTRASOUND VOCALIZATIONS
a
Number of call/min
Resident
R
Prenatal
Treatment
16
80
a
*
**
a
**
**
40
*
T
RS
Veh
RD
T
RS
CPF1
RD
T
RS
CPF3
Postnatal Treatment
R = resident
P = partner
RD
Plus Maze
% Time spent in the open arms
70
*
*
60
50
40
30
20
10
0
veh
1
3
Female
veh
1
Male
Postnatal treatment (mg/kg)
Latency (s)
DARK-LIGHT TEST
200
*
100
0
Veh
CPF
3
L’esposizione alle dosi alte di
CPF in fase postnatale induce
un comportamento meno
‘ansioso’ nelle femmine
Plus Maze
Head dipping
35
frequency
30
*
25
20
15
10
5
0
veh
3
6
Female
veh
3
6
Male
Prenatal treatment (mg/kg)
L’esposizione alla dose
intermedia di CPF in fase
prenatale induce un
comportamento meno
esplorativo nei maschi
Aggressivita’ Materna: difesa del nido in presenza di un
maschio adulto intruso, femmine adulte esposte al CPF pnd 11-14
Attacks
30
50
40
30
*
20
Frequency
Duration (s)
Defensive Postures
20
10
10
0
0
Investigative behaviour
Digging *
(Mutual Circling, Social Sniffing and Follow )
20
200
100
0
Duration (s)
Duration (s)
*
15
10
5
0
CPF 3 mg/kg
Veh
9Esiste un’ampia finestra di vulnerabilità del sistema nervoso
centrale all’esposizione al CPF
9Le alterazioni del profilo comportamentale osservato non
appaiono riconducibili alla inibizione dell’acetilcolina esterasi.
Ciò suggerisce che tale parametro è insufficiente nella
valutazione del rischio da esposizione a clorpirifos
9In particolare il quadro di alterazione comportamentale ottenuto
in questo studio suggerisce una selettiva suscettibilità dei
comportamenti di tipo sociale/parentale ed emozionale
9Quali i target neurali dell’azione del CPF? E’ possibile ipotizzare
un’interferenza con la maturazione di meccanismi neuroendocrini
che sono tra i regolatori più importanti delle funzioni sociali e
riproduttive?
L’esposizione perinatale al CPF aumenta la densità dei
recettori 5HT1 e 5HT2 e del trasportatore presinaptico per la
serotonina nel cervello di ratto (Aldridge et al. 2005; Slotkin
2007). La serotonina è significativamente implicata negli stati
affettivi/emozionali e nella regolazione dei comportamenti
agonistici nei mammiferi.
Aree limbiche (5HT)
oxy
avp
I neuropeptidi ipotalamici ossitocina e vasopressina,
oltre controllare importanti funzioni fisiologiche legate
alla riproduzione, hanno anche un ruolo centrale nella
modulazione dei comportamenti sociali e degli stati
emozionali. Dati recenti indicano che la sintesi di
ossitocina nell’ipotalamo è sotto controllo
serotoninergico (Ho et al. 2007; De Magalhaes Nunes et
al. 2007).
Ipotesi: il CPF interferisce con questo
meccanismo neuroendocrino
di regolazione del comportamento?
Livelli ipotalamici di ossitocina in topi adulti CD1 esposti a CPF
in fase prenatale e neonatale
Prenatal CPF
main prenatal effect p=0.01
1.8
OT level [A450 nm]
1.6
0 mg/kg
3 mg/kg
6 mg/kg
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0 mg/kg
1 mg/kg
Postnatal CPF
3
3 mg/kg
3
OT level [A450 nm]
Males
Females
2.5
2.5
2
2
1.5
1.5
1
1
0.5
0.5
0
0
0 mg/kg
1 mg/kg
Postnatal CPF
3 mg/kg
0 mg/kg
1 mg/kg
Postnatal CPF
3 mg/kg
Incremento dose-dipendente e più marcato nei maschi
Livelli ipotalamici di vasopressina in topi adulti CD1 esposti a CPF
in fase prenatale e neonatale
a)
60
Prenatal CPF
main prenatal effect p<0.01
AVP level [OD*mm2]
50
0 mg/kg
3 mg/kg
6 mg/kg
40
30
20
10
0
0 mg/kg
1 mg/kg
Postnatal CPF
3 mg/kg
b)
60
60
Males
AVP level [OD*mm2]
50
Females
50
40
**
**
40
30
30
20
20
10
10
0
0
0 mg/kg
1 mg/kg
Postnatal CPF
3 mg/kg
0 mg/kg
1 mg/kg
3 mg/kg
Postnatal CPF
Decremento dose-dipendente e più marcato nei maschi
Iperattività e aumentata risposta agli stimoli
ambientali e sociali negli animali esposti al CPF:
effetti sul funzionamento della tiroide?
Conception 12wks Birth
Maternal TH
Fetal/neonatal TH
Cerebral neurogenesis, migration
Cerebral neurogenesis
Neuronal differentiation,
synaptogenesis
gliogenesis
myelinogenesis
2yrs
FIG. 1: Distribution of serum T4 levels detected in pregnant dams at GD 18 (Panel A)
and follicular cell height (expressed as follicular external area/ follicular internal area:
FEA/FIA) measured in dams at PND 23 (Panel B). Lines indicate mean values.
Panel A
Panel B
P=0.04
P=0.02
P=0.02
35
30
T4 (ng/ml)
25
20
15
10
5
0
0
1
M0
2
M3
3
M6
4
M0
M3
M6
FIG. 2: Mean ± SD of serum T3 levels in F1 males (panel A) and females (panel B) at PND150
ANOVA: sex × post-natal treatment, P=0.05
ANOVA: post-natal treatment, P=0.03
ANOVA: post-natal treatment, P=0.02
Panel A
Panel B
P<0.05
P<0.05
1,4
P<0.05
1,4
1.23±0.38
1.18±0.27
1,2
1,2
1.02±0.22
1
T3 (ng/ml)
T3 (ng/ml)
1
0,8
0,6
0.84±0.18
MxP0 (n=28)
MxP1 (n=25)
0,8
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0
0.91±0.15
0.81±0.18
0
MxP0 (n=28)
MxP1 (n=28)
Male post-natal exposure
MxP3 (n=29)
Female post-natal exposure
MxP3 (n=26)
FIG. 3: serum T4 mean levels in F1 males (panel A) and females (panel B) at PND150
ANOVA: sex x pre-natal treatment x post-natal treatment, P=0.04
pre-natal treatment x post-natal treatment, P=0.03
100
T4 (ng/ml)
80
60
40
20
P<0.05
140
140
P<0.05
M0P0
M3P0
M6P0
P0
M0P1
M3P1
M6P1
P1
M0P3
M3P3
M6P3
P3
post natal exposure
120
120
100.78±22.36
100
97.1±16.38
100
T4 (ng/ml)
86.34±16.62
T4 (ng/ml)
0
80
60
84.86±15.45
84.07±10.65
MxP0 (n=29)
MxP1 (n=28)
MxP3 (n=29)
80
60
40
40
20
20
0
83.15±14.48
0
MxP0 (n=27)
MxP1 (n=29)
MxP3 (n=29)
Male post-natal exposure
Panel A; ANOVA: post-natal treatment, P=0.01
Female post-natal exposure
Panel B; ANOVA: post-natal treatment, P=NS
FIG. 4: F1 male’s thyroid mice at PND 150. A:
Control group (M0P0)
B: Necrotic cells exfoliated into the colloid in MxP3
group. (32×, HE, 5μm section).
A
B
Effetti significativi sulla morfologia della tiroide
e sui livelli di T3 e T4 della esposizione neonatale a CPF
in topi maschi adulti
Prospettive di ricerca ed implicazioni
per la valutazione del rischio :
•Il clorpirifos si comporta da
interferente endocrino con meccanismi
inediti: è possibile che altri pesticidi
producano effetti simili?
•I parametri tradizionali di tossicità
possono non essere appropriati a
valutare il rischio associato a esposizioni
prolungate e a basse dosi
•Necessari nuovi biomarcatori di
esposizione e di effetto: indicazioni dalla
ricerca di base per gli studi clinici ed
epidemiologici
PESTICIDI E RISCHIO DI DISORDINI AUTISTICI
Environmental Health Perspectives, feb. 2006
HENVINET:
Health and
ENVironment
NERwork
Focus su allergie
tumori,
effetti endocrini
disordini neurocomportamentali
E ELABORAZIONE DI
NUOVI STRUMENTI DI VALUTAZIONE
DEL RISCHIO
Activities /
Processes
Natural and
anthropogenic
(production, storage,
dumping, leakage,
etc.
Physical
processes
Dispersion &
transformation
Population
behaviour
Transport, Climate,
Area of use
Occupation, activity (age),
diet, consumer use,
environment
Sources
Indoor and
residential
use
Agriculture
and
gardening
Emission/Release
hazardous agents
Source strength and
physical form, Season,
Location
OPs :(chlorpyrifos)
Environmental matrix
Soil
Water
Air (house
dust)
Solid food
Surfaces
Concentration
Composition, load,
magnitude, application
frequency
dietary uptake,
pharmaco-kinetics,
absorption, distribution
Exposure route
Dermal
(2)
Oral (diet)
Oral
(nonfood
(1)
dietary)
Respiratory
Placental
Breast milk?
Exposures
duration, frequency,
Intensity of contact,
biological matrix
(sampling)
Physical
processes
metabolism, enzyme
function, barrier function
(placenta)
Pathophysiol.
Processes
Pharmacodynamics,
. Toxico-kinetics
Human
Valuation &
weighing
Severity, value of life,
productivity,
Timing of
interventional
measures.
body
Age
Genetic/aquired
predisposition
Dose
Body burden,
dose at target organ,
effective dose,
metabolites, enzymes
OP scheme, part 2
Health effects
Impaired motor
development, neuro
development, attention
deficit, ADHD, impulsivity,
hyporeflexia, reduced
head circumference
Appraisal,
Ethical decision
framing
Multi-criteria, risk-benefit,
cost-effectiveness, etc.
Social, cultural, political,
economical &
judicial settings
Impacts
Policy deficits,
Disease burden,
Societal costs,
Economic costs
Perceptions, etc.
Optimal scenario
RINGRAZIAMENTI
Dipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze, ISS
Aldina Venerosi Pesciolini
Laura Ricceri
Flavia Chiarotti
Maria Luisa Scattoni
Angela Rungi, Valentina Sanghez
Antonella Olivieri
Simona DeAngelis
Reparto di Metabolismo ed Endocrinologia
molecolare e cellulare
Dipartimento di Sanità Pubblica
Veterinaria e Sicurezza Alimentare, ISS
Sabrina Tait
Francesca Maranghi
Alberto Mantovani
Reparto Neurotossicologia
e Neuroendocrinologia
Dipartimento del Farmaco, ISS
Annarita Meneguz
Francesca Cometa
