TECNICHE DI DIAGNOSTICA

Principali classi di mutazioni
Regole per valutare la patogenicità
di una mutazione I
- Delezioni dell’intero gene, mutazioni non senso e
anomalie della cornice di lettura molto probabilmente
distruggono la funzione del gene e sono quindi
patogenetiche.
- Mutazioni che cambiano i siti di splicing GT……AG che
fiancheggiano gli introni molto probabilmente avranno un
effetto sullo splicing e quindi solitamente portano ad
un’abolizione della funzione del gene e quindi alla malattia.
Gli effetti dei cambiamenti nucleotidici a carico delle altre
regioni introniche sono difficili da predire e dovrebbero
essere verificati con tecnologie alternative (ad es RT-PCR).
Regole per valutare la patogenicità
di una mutazione. II
- Una mutazione missenso ha più probabilità di
causare una malattia se si trova in una porzione del
gene che è funzionalmente importante (Ex DNA
binding domain PAX3).
- Se cambia un amminoacido che è molto conservato
tra specie diverse (ortologhi) o tra membri della stessa
famiglia di geni (paraloghi) ci sono più probabilità che
la mutazione sia patogenetica.
Regole per valutare la patogenicità
di una mutazione. III
- Le sostituzioni aminoacidiche hanno più probabilità
di annullare la funzione di un gene se sono non
conservative (sostituzione di una aa polare con uno
non polare o viceversa, o di uno acido con uno basico
e viceversa).
- Un cambio nella sequenza di un gene che è presente
per la prima volta in un paziente affetto in una
determinata famiglia (de novo) e non è presente nei
genitori non malati ha alte probabilità di essere
patogenetico.
Gli effetti di un allele mutante
Come capire se un cambio nella sequenza del DNA e’ patogenico
-  se il cambio e’ stato’ gia osservato in pazienti affetti dalla stessa
malattia
- una mutazione de novo assente nei genitori di una persona con
una malattia de novo
- un nuovo cambio assente in un numero di almeno 100
cromosomi sani
- il tipo di cambio
-  studi funzionali
Validazione di un gene candidato ad
essere responsabile di una malattia
genetica
-  Analisi di Mutazioni
–  Analisi funzionale di una mutazione
–  Generazione di un modello animale per
una malattia genetica
Biotecnologie per la diagnosi
genetica molecolare
Malattie cromosomiche (cariotipo, FISH, CGH)‫‏‬
Altre Malattie geniche
– RFLP (restriction fragment length polymorphisms)‫‏‬
– Southern blotting - DNA
– Northern blotting - RNA
– PCR (polymerase chain reaction) – amplificazione del DNA
– SSCP
- DGGE
– DHPLC
– DNA Sequencing
- MICROARRAY (CHIP)
ANALISI DEL CARIOTIPO (Piastra metafasica
preparata da linfociti umani di sangue periferico)
Campione sangue periferico+ fitoemoagglutinina (agglutina globuli rossi e
stimola linfociti). Cellule vengono bloccate in mitosi con inibitore
microtubuli (es. colchicina). Cellule vengono lisate e e cromosomi
metafasici colorati ed esaminati al microscopio.
Bandeggio Giemsa o bandeggio G1(G-bands trattamento bland con
tripsina seguito da colorazione Giemsa). Bande chiare e scure alternate
Sonde (probes) molecolari
- Reagenti usati per identificare una sequenza specifica di DNA o
RNA in un miscuglio complesso in cui è avvenuta una ibridazione
(accoppiamento di basi complementari tra il filamento singolo della
sonda ed il filamento singolo bersaglio di DNA o RNA). Le sonde
sono comunemente marcate da materiale radioattivo o fluorescente.
- Sonde cDNA- sequenze di DNA complementare a RNA
(originariamente prodotte mediante trascrizione inversa di RNA), in
grado di identificare sequenze di esoni (espressi).
- Sonde oligonucleotidiche- sequenze di DNA prodotte
sinteticamente lunghe 14- 25 nucletidi.
- Sonde RNA- RNA marcato in grado di identificare sequenze di DNA
o RNA complementari.
FISH (Fluorescence In
Situ hybridization):
A) SONDE CHE
VISUALIZZANO
SINGOLI CROMOSOMI
B) SONDE CHE
VISUALIZZANO TUTTI
I CROMOSOMI
Α
C) SONDE CHE
VISUALIZZANO
SPECIFICHE BANDE
“CHROMOSOME
BARR CODE”
C
Β
Chromosome painting probes
Piastra metafasica dopo ibridazione con sonde per i 24 differenti cromosomi
Analisi cariotipica spettrale
Ibridazione In Situ
Fluorescente
(FISH)‫‏‬
24 sonde DNA
cromosomaspecifiche,
ciascuna marcata
con una
combinazione
differente di 5
fluorocromi
Locus-specific probes.
Esempio Prader- Willi
Diagnosi mediante
FISH di una
delezione
interstiziale nella
sindrome di PraderWilli utilizzando una
sonda specifica per
la regione critica
sul cromosoma 15.
Ch 15 centromere
(verde)‫‏‬
Ch 15 PWS critical
region (rosso)‫‏‬
Biotecnologie per la diagnosi
genetica molecolare
– RFLP (restriction fragment length polymorphisms)‫‏‬
– Southern blotting - DNA
– Northern blotting - RNA
– PCR (polymerase chain reaction) – amplificazione del DNA
– SSCP
- DGGE
– DHPLC
– DNA Sequencing
- MICROARRAY (CHIP)
Endonucleasi di restrizione
Enzimi che tagliano il DNA a doppia elica in siti specifici
Endonucleasi di restrizione
EcoRI non taglierà questa sequenza
Mutazioni puntiformi
Variazioni nucleotidiche (Mutazioni puntiformi) possono cambiare
la sequenza nucleotidica e cambiare quindi il sito di restrizione.
EcoRI non è in grado di tagliare le due sequenze mutate.
Southern Blotting (DNA)‫‏‬
Polimorfismi RFLP e Southern Blot
Si possono identificare solamente i frammenti di DNA che ibridizzano con
la sonda molecolare (probe)
Diagnosi molecolare
dell’anemia falciforme
La sonda non ibridizza con il frammento MstII di 0.2 Kb
Diagnosi della sindrome da
androgeno resistenza per mezzo
dell’analisi del Southern blot
Il DNA dal gel di agarosio è stato
trasferito su nitrocellulosa ed
ibridizzato alla sonda cDNA di un
recettore androgenetico. Si osservano
3 frammenti genomici nel DNA di
entrambi i genitori ma non in quello
del figlio.
Conclusione: Il gene per il recettore
androgenetico (AR) è X-linked. La
madre ha solo un gene AR intatto
(l’intensità delle bande è simile a
quella della padre). Il figlio ha ereditato
dalla madre il cromosoma X che ha
una delezione nel gene AR.
Il “Northern blot” è una tecnica usata per determinare in
quale tessuto o tipo cellulare è espresso un gene, ed anche
la lunghezza e la quantità di mRNA. I livelli di mRNA sono
spesso correlati ai livelli di proteina presente nel tessuto.
Biotecnologie per la diagnosi
genetica molecolare
– RFLP (restriction fragment length polymorphisms)‫‏‬
– Southern blotting - DNA
– Northern blotting – RNA
Test di screening
– PCR (polymerase chain reaction) – amplificazione del DNA
– SSCP
- DGGE
– DHPLC
– DNA Sequencing
- MICROARRAY (CHIP)
AMPLIFICAZIONE IN
VITRO DEL DNA
“REAZIONE A CATENA
DELLA POLIMERASI
(PCR)”
L’invenzione della PCR
•  Ideata da Kary
Mullis nel 1983
•  La prima
pubblicazione è
apparsa nel 1985
•  Premio Nobel per
la chimica nel
1995
Polymerase Chain Reaction - PCR
La PCR rappresenta la seconda rivoluzione
nelle tecniche di manipolazione del DNA.
E’ essenzialmente una tecnica di
amplificazione del DNA.
DNA
PCR
(singola molecola)‫ ‏‬amplificazione
Molte
molecole
Polymerase Chain Reaction
•  Metodo per l’amplificazione esponenziale di
sequenze di DNA
•  Ingredienti di base
–  Stampo di DNA o RNA
–  2 primers complementari a differenti regioni dello
stampo
–  DNA polimerasi termostabile
–  4 nucleotidi
–  il buffer appropriato
Applicazioni della PCR
• Diagnostica (per la ricerca di mutazioni)‫‏‬
• Ricerca
• Genetica forense
Thermal cycler,
AppliedBiosystems
Thermal Cyclers, MJ Research
Thermal Cyclers, MJ Research
TIPICA MISCELA DI REAZIONE
25 o 50µl in una provetta micro Eppendorf (0.2 o 0.5 ml)
COMPONENTE
VOLUME
Concentrazione
finale
10 X PCR Buffer
5µl
1X
10 X dNTPs (2mM)‫‏‬
5µl
200µM
Forward primer (5 pmols/µl)‫‏‬
5µl
0.5µM
Reverse primer (5 pmols/µl)‫‏‬
5µl
0.5µM (25pmols/50µl)‫‏‬
DNA genomico stampo
2µl
1µg
polimerasi termostabile (5U/µl)‫‏‬
0.2µl
1 unità
H2O (a 50µl di volume finale)‫‏‬
27.8µl
•  Synthesis by DNA polymerase
5’
3’
-T A C G T A C G T A
-A T G C A T G C A T G C * *
Uno specifico DNA a singola elica (primer o
innesco) ibrida con l’elica che deve essere
copiata
I cicli della PCR
•  30–35 cicli ciascuno
comprendente:
–  denaturazione
(95°C), 10-40 sec
–  annealing (50–65°C),
30-120 sec
–  polimerizzazione
(68-72°C),
il tempo dipende
dalla lunghezza del
frammento
Quante copie?
•  Nessun prodotto fino al 3° ciclo
•  Dopo 32 cicli ci dovrebbero essere
max 1,073,741,764 copie di lunghezza
definita (~1×109)‫‏‬
Elettroforesi su gel: visualizzazione diretta delle molecole
separazione orizzontale --> Agarosio = DNA ed RNA
Elettroforesi su gel : Separa le molecole per dimensione
separazione orizzontale --> Agarosio = DNA ed RNA
separation verticale --> Acrilamide = DNA, proteine ed RNA
Le molecole più piccole migrano nel gel più velocemente.
Il DNA colorato con bromuro di etidio
emette una fluorescenza di colore rosso-arancio
se sottoposto a luce UV.
Quanto puo’ essere grande
il prodotto da amplificare?
•  I prodotti di amplificazione sono di
solito grandi 100-1500 bp.
•  E’ possibile amplificare prodotti piu’
grandi — >25 kb.
•  Questo richiede particolari
accorgimenti tecnici (buffers, tipi di
polimerasi, tempi di estensioni piu’
lunghi).
Quanto è potente la PCR?
•  La PCR può amplificare fino ad ottenere una
quantità utilizzabile di DNA (visibile su gel) in
meno di 2 ore.
•  Lo stampo di DNA non necessita di particolari
purificazione se il frammento da amplificare è
di dimensioni ridotte (fino a 1000bp).
•  Il prodotto della PCR può essere digerito con
enzimi di restrizione, sequenziato o clonato.
•  La PCR può amplificare una singola molecola
di DNA (es. uno spermatozoo).
Come disegnare i primers
per la PCR
•  Devono essere lunghi ~20 basi.
•  Il contenuto G/C dovrebbe essere 45–55%.
•  La temperatura di annealing dei due
primers dovrebbe essere paragonabile.
•  Il 3´(parte finale dell’oligo) -dovrebbe
essere G o C.
•  I primers non devono annilare tra di loro.
•  I primers non devono contenere regioni
ripetute.
Ottimizzazione della
reazione di PCR
•  Temperatura di Annealing dei
primers.
•  Concentrazione di Mg2+ nella
reazione.
•  Tempo di estensione.
•  Concentrazione del templato
Falsi positivi in PCR
•  Possibili fonti di contaminazione
–  Quando e’ stato collezionato il campione
–  Durante il trasporto
–  In laboratorio da altri campioni di pazienti o da personale di
laboratorio
•  Sarebbe auspicabile un controllo interno
•  Primers non sono abbastanza specifici
–  Migliorare le condizioni di amplificazione
•  Cambiare primers
Multiplex PCR
•  Le reazioni di PCR possono essere
ingegnerizzate in modo da
amplificare simultaneamente
frammenti di diversa lunghezza spesso utilizzato in diagnostica.
Denaturing High-Performance Liquid
Chromatography (dHPLC)
La tecnica si basa sulla differente
velocità di eluizione in una colonna
cromatografia per gli eteroduplex e gli
omoduplex. Questi duplex si formano
quando frammenti amplificati di DNA
vengono denaturati termicamente e
lasciati ricombinare. Una qualsiasi
variazione (mutazione o polimorfismo)
tra le due forme alleliche di un
frammento porta alla formazione di un
eteroduplex (combinazione di due
catene di DNA a singola catena, non
perfettamente corrispondenti,
caratterizzata dalla presenza di una
“bolla” a livello della quale si trova il
mismatch).
L’ e t e r o d u p l e x s i c o m p o r t a
cromatograficamente in modo differente
sia dall’omoduplex non mutato che
dall’omoduplex mutato: l’eteroduplex è
solitamente più veloce (meno trattenuto)
degli omoduplex e da ciò si può
caratterizzare la presenza di una
variazione nucleotidica in un campione.
La presenza di una mutazione o di un
polimorfismo si evidenzia quindi,
mediante picchi ulteriori o con un
profilo diverso rispetto al “wild type”.
Single Strand
Conformation
Polymorphism
(SSCP)‫‏‬
Molecole di DNA a
singolo filamento
migrano in un gel di
poliacrilammide non
denaturante in maniera
dipendente dalla
struttura tridimensionale
e quindi della loro
sequenza.
Denaturing
Gradient Gel Electrophoresis
(DGGE)‫‏‬
Denaturazione
Migrazione elettroforetica su gel di
poliacrilammide con gradiente di
sostanze denaturanti di frammenti di
DNA che rallentano la corsa quando
raggiungono una concentrazione di
denaturante che corrisponda alla T di
fusione. La separazione avviene in
base a differenze nella temperatura di
fusione delle molecole che è
dipendente dalla sequenza nucleotidica.
Omoduplex più
veloci
Sequenziamento del DNA:
il metodo di Sanger
pozzetti
autoradiogramma
Sintesi enzimatica di una nuova catena di DNA sullo stampo, usando dNTP e
didesossi nucleotidi (senza 3’OH) marcati con fluorocromi diversi. L’assenza di
3’OH impedisce la formazione di un legame fosfodiesterico con il successivo
precursore e quindi all’interruzione della sintesi. La concentrazione dei ddNTP è
1/100 dei dNTP
Automated
DNA sequencing
I frammenti tra loro differiscono
per una sola base e separati in
base alla loro lunghezza tramite
elettroforesi capillare con
sequenziatore automatico
(rilevatore sistema ottico)
DNA CHIPS
Il termine di “chips” di DNA riferisce a
campioni miniaturizzati di frammenti
di acidi nucleici che sono fissati su
supporti di vetro non più grandi di un
vetrino da microscopio.
DNA CHIPS
√  OLIGONUCLEOTIDI ARRAYS (seq nota,
matrice ordinata)
√  TARGET PREPARATION (marcatura con
sostanze fluorescenti)
√  HYBRIDISATION
√  SIGNAL DETECTION (scanner per la
misura della fluorescenza, la cui intensità è
proporzionale al numero di molecole presenti
sullo spot)
L’innovazione tecnologica:
il Gene-chip
Frammenti di PCR contenenti gli esoni DMD sono spottati in triplicato su ogni array (altosinistra: esoni 1-24, alto destra esoni 25-48, basso-sinistra esoni 49-72, basso-destra
esoni 73-79. Parte superiore = controllo sano. Parte inferiore = paziente DMD con
delezione esoni 3-20
Analisi di mutazione
Qualsiasi sia il test di screening utilizzato SSCP (Single Strand
Conformation Polymorphism), DGGE (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis), DHPLC (Denaturing High Performance Liquid
Chromatography) o altri il segmento anomalo dovra’ essere
analizzato mediate sequenziamento diretto che confermerà il
cambiamento nucleotidico e ne determinerà l’esatta natura.
Quest’analisi può rivelare mutazioni deleterie (codoni di stop),
indicando il ruolo patogenetico della mutazione oppure può rivelare
mutazioni missenso. Per escludere la possibilità che il cambiamento
nucleotidico identificato corrisponda ad un polimorfismo è
necessario verificare che la variazione segreghi con la malattia nelle
famiglie (in caso di mutazione ereditata) e che non sia presente in
una popolazione normale di controllo. La presenza di mutazioni de
novo in pazienti è un’indicazione piuttosto forte del ruolo causativo
nella malattia. In caso di mutazioni missenso è anche utile valutare
se il cambio nucleotidico potrebbe essere responsabile di
cambiamenti drammatici nella struttura della proteina (cambiamenti
amminoacidici non conservativi) o anche se gli aminoacidi soggetti
a mutazioni sono molto conservati durante l’evoluzione.