Antracicline

ANTRACICLINE
Le antracicline sono farmaci antitumorali appartenenti alla categoria degli
antibiotici citotossici, ovvero un gruppo di farmaci, isolati per lo più da fonti
naturali, la cui azione antineoplastica è dovuta ad interazione con il DNA, con
conseguente introduzione di danni all’acido nucleico che innescano l’apoptosi.
Sono molto efficaci ma anche molto tossici dal momento che non sempre
riescono a discriminare tra le cellule maligne e le sane 1 .
I primi derivati antraciclinici ad essere scoperti ed utilizzati in terapia,
sono stati la daunorubicina (o daunomicina) e la doxorubicina (o adriamicina)
che, nei primi anni ’60, vennero isolati da ceppi di Streptomyces peucetius. La
daunorubicina è attualmente commercializzata con i nomi di Daunoblastina e
Daunoxome, mentre la doxorubicina come Adriblastina, Caelyx e Myocet.
Dal punto di vista strutturale, gli antibiotici antraciclinici sono
caratterizzati da una porzione tetraciclica planare, legata glicosidicamente ad un
amminozucchero (daunosamina).
Le strutture molecolari della daunorubicina e della doxorubicina
differiscono solamente per uno dei sostituenti terminali (fig. 1). Seppure piccola,
tale differenza strutturale ha importanti conseguenze sullo spettro di attività dei
due antibiotici citotossici. La doxorubicina, infatti, ha applicazioni cliniche di
rilievo soprattutto nei tumori solidi (carcinoma mammario, dell’endometrio,
delle ovaie, dei testicoli, della tiroide, dei polmoni), mentre la principale
indicazione clinica della daunorubicina è la leucemia acuta 2 .
Altri derivati antraciclinici utilizzati sono epirubicina e idarubicina
(fig.1),
commercializzati
con
i
nomi
rispettivamente3 .
1
di
Farmorubicina
e
Zavedos
L’epirubicina è un derivato semisintetico della doxorubicina, ottenuto
tramite epimerizzazione da assiale ad equatoriale del gruppo idrossilico al C4’
della daunosamina; tale modificazione fa diminuire l’emivita del farmaco 4 .
L’idarubicina deriva dalla daunorubicina per eliminazione del gruppo
metossilico al C4; tale antraciclina ha uno spettro d’attività più ampio rispetto
alla daunorubicina e ciò potrebbe essere attribuito alla maggiore lipofilicità.
L’idarubicina può inoltre essere somministrata per via orale e gli studi in vitro
hanno indicato che essa potrebbe essere più efficace della daunorubicina nei casi
di MDR (Multi Drug Resistance).
O
O
11
9
D
B
C
A
14
OH
4
O
O
O
4'
O
OH
3'
O
O
OH
O
CH2OH
CH3
OH
4
4
OCH3
OH
O
OH
O
OCH3
O
DOXORUBICINA H3C
4'
DAUNORUBICINA
O
OH
O
H3C
NH2
NH2
HO
HO
2
O
O
OH
O
O
OH
O
CH2OH
CH3
OH
4
OCH3
OH
4
O
OH
EPIRUBICINA
O
O
IDARUBICINA
O
HO
OH
O
O
H3C
4'
NH2
NH2
HO
Fig.1
Mentre in passato si riteneva che il meccanismo con cui le antracicline
esplicano la loro attività citotossica fosse dovuto alla sola intercalazione di tali
molecole nella struttura del DNA, con conseguente inibizione delle normali
attività dell’acido nucleico, attualmente la tendenza è quella di ritenere
l’intercalazione sì necessaria ma non sufficiente all’azione antitumorale.
Risultati recenti hanno infatti indicato nella topoisomerasi II eucariotica un
bersaglio dell’azione citotossica delle antracicline. Ciò è stato dimostrato usando
ceppi di lievito mutati nell’espressione della topoisomerasi II che risultavano
resistenti alle antracicline.
Le topoisomerasi sono enzimi nucleari che rilassano il DNA superavvolto
attraverso tagli reversibili o ad un singolo filamento del duplex, come fa la
topoisomerasi I, o ad entrambi, come fa invece la topoisomerasi II. In entrambi i
casi l’elica viene reversibilmente interrotta attraverso la formazione, in modo
ATP-dipendente, di un legame fosfodiestereo tra l’OH della tirosina dell’enzima
(Tyr805 nella topoisomerasi umana) e il gruppo fosforico del DNA. Il taglio
consente all’estremità libera dell’acido nucleico di ruotare, risolvendo il
superavvolgimento. A questo punto l’OH dell’estremità libera del DNA può
ripristinare la continuità dell’elica attaccando il fosfato attivato.
3
Attualmente si sa che le antracicline, dopo essersi intercalate nella doppia
elica, vanno a localizzarsi all’interfaccia tra il sito attivo della topoisomerasi II e
il sito di cleavage del DNA, interagendo pertanto sia con l’uno che con l’altro e
ricoprendo una regione di quattro coppie di basi che vanno dalla posizione –2
alla +2 rispetto al legame fosfodiestereo tagliato.
La loro azione si esplica stabilizzando un complesso di cleavage detto ternario
perché formato dal DNA, dall’enzima e dal farmaco, in cui le eliche del DNA
sono tagliate e legate all’enzima. Pertanto l’azione del farmaco porta a tagli
irreversibili nel DNA che aprono la strada al programma di morte cellulare nelle
cellule tumorali. In tal modo le antracicline, trasformando una proteina utile in
una tossina che “avvelena” irreversibilmente il DNA, sono anche definite
“veleni” della topoisomerasi II per distinguerle dagli inibitori veri e propri
dell’enzima come il dexrazosano, per esempio, che inibisce a monte l’intero
ciclo catalitico.
Una peculiarità dei veleni è che la loro azione mostra una netta specificità
di sequenza e pertanto veleni chimicamente simili stimolano cleavage agli stessi
siti del DNA. Per esempio la doxorubicina, la daunorubicina e l’idarubicina
richiedono necessariamente un’adenina in posizione –1 e una timina in
posizione –2.
E’ stato visto però che una piccolissima modificazione a livello della
daunosamina, ovvero l’epimerizzazione del gruppo NH2 in posizione 3’ cambia
completamente la specificità di sequenza. In tal modo, il derivato 3’epidaunorubicina (fig.2) preferisce una guanina al posto della timina in
posizione –2.
4
Farmaco
-3
-2
-1
+1
Doxorubicina
A
T
A
A
Daunorubicina
A
T
A
A
Idarubicina
A
T
A
A
3’epidaunorubicina
A
G
A(G)
A
O
OH
O
H
OCH3
O
OH
O
NH2
H3C
O
3'
OH
Fig.2: 3'-epidaunorubicina
Tale modificazione però non è clinicamente significativa poiché la 3’epidaunorubicina è meno attiva dei lead compounds.
Tuttavia da questi dati si può dedurre che la daunosamina è la parte di molecola
che interagisce con il DNA fino alla posizione –2 5 .
Inoltre si è visto che un analogo privo di sostituenti in posizione 3’ è in grado di
stimolare cleavage tanto alle sequenze preferite dai farmaci progenitori quanto a
quella preferita dalla 3’-epidaunorubicina. Quindi è proprio l’amminogruppo
dello zucchero che, in base al suo orientamento, stabilisce il sito di cleavage.
D’altra parte è stato dimostrato che il sostituente al 3’ non è indispensabile
all’attività del farmaco, dal momento che composti non sostituiti (come quello
rappresentato in figura 3) mantengono la medesima attività degli analoghi
sostituiti 6 .
5
O
OH
O
9
OH
O
O
OH
H3C
H2N
O
3'
Fig.3: 3'-deamino-4'-deossi-4'-epi-amino-idarubicina
Dal momento che la 9-deossi-doxorubicina (rappresentata in figura 4) è
molto meno attiva dei lead compounds, si può dedurre che l’OH al C9
dell’anello A è coinvolto nell’interazione con il complesso enzima-DNA.
O
OH
O
OH
9
A
OCH3
O
H
O
OH
H3C
O
H2N
3'
OH
Fig.4: 9-deossi-doxorubicina
Inoltre, dall’osservazione che l’idarubicina è addirittura più attiva della
daunorubicina, si è dedotto che il gruppo 4-metossi non sia fondamentale per
l’attività antitumorale.
In definitiva la sintesi di derivati delle antracicline e la successiva analisi di
tali molecole su campioni biologici, ha permesso di dedurre le seguenti relazioni
struttura-attività:
6
 Il sostituente idrossilico al carbonio 9 è un determinante strutturale importante
per avere attività citotossica.
 La daunosamina svolge un ruolo chiave nell’identificazione del sito di cleavage
e quindi è fondamentale nell’interazione con il DNA .
 Il gruppo 4-metossi non è fondamentale per l’attività antitumorale.
Tali studi struttura-attività hanno lo scopo di distinguere tra i determinanti
molecolari indispensabili per l’attività del farmaco e le parti strutturali che
possono invece essere modificate, con l’obiettivo di migliorare le caratteristiche
cliniche delle antracicline. Infatti, un limite al loro utilizzo è rappresentato dalla
loro intrinseca cardiotossicità. Pertanto, il bisogno di migliorare l’indice
terapeutico ha spinto la ricerca a indagare su analoghi delle antracicline più
maneggevoli 1.
La ricerca si è mossa su due differenti binari: da una parte sintetizzare
analoghi dei lead compounds con piccole sostituzioni nell’ossatura principale,
nel tentativo di trovare una struttura che presentasse un migliore profilo
farmacodinamico e tossicologico rispetto ai farmaci genitori; dall’altra
comprendere meglio il target di questi antibiotici in modo che, noto il bersaglio,
fosse più facile risalire ai determinanti strutturali in grado di colpirlo
selettivamente.
Per quanto riguarda il primo approccio, negli ultimi vent’anni sono stati
sintetizzati circa duemila analoghi, ma solo pochi sono stati approvati per l’uso
clinico . Un lavoro importante in questo contesto ha portato alla sintesi di
derivati 4-metossi o 4-demetossi di antracicline disaccaridiche, in cui il primo
zucchero è legato ad un secondo attraverso un legame glicosidico. Studi
struttura-attività hanno dimostrato che tale sostituzione nella serie 4-metossilata
fa ridurre drammaticamente la potenza citotossica, mentre nella serie 47
demetossi l’attività antitumorale si è dimostrata di gran lunga maggiore rispetto
ai lead compounds se e solo se la configurazione al C4’ è di tipo assiale 7, 8, 9 .
Si è arrivati così alla sintesi di MEN10755 (chiamata anche sabarubicina, fig 5).
Indagini condotte su tumori umani hanno rivelato che MEN 10755 è più efficace
della doxorubicina nell’avvelenare la topoisomerasi II e sembra avere inoltre
una minore cardiotossicità.
O
OH
O
OH
OH
O
O
OH
H3C
O
HO
3'
O
O
H3C
Fig.5: MEN 10755
H2N
OH
Per quanto riguarda il secondo approccio, studi recenti hanno fornito
informazioni importanti riguardo al target.
Infatti si è visto che esistono almeno due isoenzimi della topoisomerasi II nelle
cellule umane: la topoisomerasi II α e la topoisomerasi II β che differiscono nel
peso molecolare (170 e 180 kDa rispettivamente) e nella localizzazione tissutale
ma non nella sensibilità alle antracicline. L’enzima è costituito da tre domini: un
dominio all’estremità N-terminale con il sito di legame all’ATP, una regione
8
centrale che interagisce con il DNA e un dominio al C-terminale che sembra
essere importante per la regolazione dell’attività enzimatica.
La recente determinazione della struttura cristallina della porzione
centrale (amminoacidi 410-1202) della topoisomerasi II di Saccharomyces
Cerevisiae ha rivelato come questo enzima sia una proteina omodimerica a
forma di cuore con grossi buchi di 5,5 nm entro cui poterebbero adattarsi le
eliche di DNA durante la reazione di rottura e risaldatura (fig. 6).
Fig. 6
Le Tyr catalitiche (simboleggiate in figura 6 dagli anelli aromatici) si trovano in
un sottodominio compreso nel lievito tra gli amminoacidi 702-790, di struttura
simile a quello di CAP, una nota proteina di E.Coli che lega il DNA. Indicate
con le frecce, sono le glicine748 le cui mutazioni in glutammato conferiscono
resistenza alle antracicline, confermando come la topoisomerasi II sia il
bersaglio dell’azione citotossica di questi farmaci 10 .
9
Analizzando un frammento della topoisomerasi II umana sono state individuate
altre mutazioni associate all’acquisizione di resistenza alle antracicline come
quella della Ser740 in Trp, della Thr744 in Pro e di Ala642 in Ser 11 .
Studi condotti utilizzando proteine mutanti umane hanno permesso di
riconoscere anche il segmento da Arg793 fino a Thr808 come fondamentale per
l’attività catalitica e per la sensibilità ai farmaci (fig. 7).
Fig. 7
In figura 7 individuiamo in rosso la Tyr805 catalitica, la quale è fondamentale per
l’attività enzimatica e non può essere sostituita con nessun altro amminoacido ed
in viola gli amminoacidi Leu794(L), Asp799(D), Ala801(A), Arg804 (R) che possono
essere rimpiazzati solo da amminoacidi con caratteristiche chimico-fisiche
simili: la Leu con un altro amminoacido alifatico, l’Asp con uno acido come il
Glu, l’Ala con uno di piccole dimensioni come la Gli e infine l’Arg con un
amminoacido a catena laterale basica come la Lys 12 .
10
Procedendo su questa linea di studio, recentemente (2004) dal gruppo di
ricerca dei professori Moro e Beretta è stato delineato al computer un modello di
interazione delle antracicline nel complesso DNA-topoisomerasi II (fig. 8).
Il modello mostra come l’antraciclina interagisca da una parte con il DNA,
intercalandosi tra le coppie di basi –2 e +1, e dall’altra con il dominio CAP-like
dell’enzima. Nell’interazione con la topoisomerasi II giocano un ruolo
fondamentale legami a idrogeno che si stabiliscono tra i sostituenti dell’anello
aromatico del farmaco (gruppi idrossilico e carbonilico) e specifici residui
amminoacidici che, se mutati, conferiscono infatti resistenza al farmaco.
Nel modello rappresentato in figura 8 si vede come la doxorubicina si intercala
perpendicolarmente all’asse del DNA. La daunosamina si posiziona nel solco
minore mentre l’anello D nel solco maggiore.
La doxorubicina entra in contatto con il dominio CAP-like della topoisomerasi
II attraverso legami a idrogeno proprio con la Ser740 e la Thr744, le cui mutazioni
come abbiamo già detto erano causa di resistenza alle antracicline. Secondo tale
modello la mancanza del gruppo idrossilico al C11 risulta nella perdita di attività
delle antracicline.
Un altro legame a idrogeno infine coinvolge la Glutammina750 e l’idrossile al
C14 che però è presente solo nella doxorubicina e nell’epirubicina e quindi è
tipico solo di questi derivati.
Il gruppo idrossilico al C9 è coinvolto in un legame a idrogeno con l’atomo di N
del nucleotide in posizione –1, spiegando in tal modo come i derivati privi del
gruppo idrossilico al C9 siano inattivi.
Per quanto riguarda l’amminozucchero, il gruppo ammino al 3’ interagisce con i
nucleotidi del DNA, in accordo con quanto detto precedentemente.
Come si era anche dedotto dagli studi di relazione struttura-attività prima visti, il
gruppo metossi al C4 dell’anello D non è richiesto per l’attività anticancro e ciò
è sperimentalmente dimostrato dall’elevata efficacia antitumorale dell’
idarubicina. Questo è in accordo con il presente modello, poiché l’anello D si
11
proietta verso l’ esterno del complesso, e pertanto il gruppo metossile non ha
alcuna interazione né con il DNA e né con l’enzima.
Fig.8
L’epimerizzazione della posizione 4’ non influenza negativamente l’attività del
farmaco e infatti l’epirubicina è attiva quanto la doxorubicina, poiché
l’interazione con il DNA è ancora favorevole (fig. 9).
Inoltre, in accordo con quanto detto prima, il gruppo NH2 si estende fino alla
posizione –2, come si può apprezzare meglio dalla figura 9 in cui si vede
chiaramente come l’amminogruppo protonato interagisca elettrostaticamente
con la corrispondente base azotata. Questo spiega anche l’importanza del gruppo
NH2 nel determinare la sito-selettività delle antracicline, dal momento che in
base al suo orientamento cambia la preferenza del nucleotide proprio in
posizione –2 13.
12
Fig. 9
In conclusione, si può dire che la conoscenza del bersaglio, oltre a
confermare e a spiegare quelle relazioni struttura-attività dedotte esclusivamente
in via sperimentale, potrà essere in futuro di enorme vantaggio nella
progettazione e nella ricerca razionale di inibitori dell’enzima più efficaci e
meno tossici.
Dott.ssa Emanuela Summaria
13
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