Stress biotici
•Stress imposto da altri organismi
Patogeno vegetale:
Organismo che, per completare parte o tutto il
suo ciclo vitale, cresce all’interno della pianta e
nel fare ciò causa un effetto dannoso alla
pianta stessa.
I patogeni vegetali sono agenti infettivi
che causano malattie nelle piante
-I patogeni vegetali causano annualmente il 10 – 30%
di perdita di prodotto ma possono essere molto più
devastanti: es. Phytophtora infestans (peronospora
della patata-Irlanda 1845 e 1846)
-La maggior parte delle piante sono resistenti
alla maggioranza dei patogeni; la malattia è
una eccezione , non la regola
(es. Meno del 2% delle circa 100.000 specie
fungine note sono in grado di causare
malattia nelle piante).
-Numerosi geni di una pianta possono
essere coinvolti nella risposta all’infezione
di un patogeno
-La “battaglia” tra le piante e i patogeni
determina diversità nei geni di difesa e di
patogenicità
Molti tipi di organismi causano malattie nelle piante
Nematodi sono
animali
Virus non sono
cellulari ma
semplici acidi
nucleici
impacchettati
Funghi e
Oomiceti sono
eucarioti
Batteri sono
procarioti
Large, E.C. 1940. Advance of the Fungi. Jonathan Cape, London.
Una pianta può essere
attaccata da più patogeni
che possono prediligere
tessuti specifici.
Ciascun patogeno può
dare origine a sintomi
caratteristici della
malattia.
Malattia causate da funghi: Powedy mildew – oidio o mal bianco - Oidium
neolycopersici, Erysiphe orontii, e Leveillula taurica.
Malattie causate da virus: Tomato spotted wilt - virus dell'avvizzimento maculato Tomato spotted wilt topovirus (TSW)
Malattie causate da batteri: Bacterial speck - maculatura batterica - Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria, Pseudomonas syringae pv. tomato
Malattie causate da nematodi: root-knot nematode- nematodo galligeno Meloidogyne incognita
Malattie causate da batteri: crown gall – Galla del colletto - Agrobacterium tumefaciens
Plants are exposed to countless microbes, but very, very few
of these interactions lead to disease
What makes an interaction into a disease?
The pathogen must
be able to overcome
plant defenses
The host plant
must be
susceptible to the
pathogen
The disease
triangle
(it takes three)
Environment
The environment must
tip the balance in favor of
the pathogen
(Disease triangle)
Strategie del patogeno per colonizzare la pianta:
•Pressione meccanica o produzione di enzimi litici
•Penetrazione attraverso aperture naturali
•Penetrazione attraverso le ferite
Strategie del patogeno per utilizzare la pianta come
substrato di crescita
Necrotrofi
Biotrofi
Emibiotrofi
Come si difendono le piante dai patogeni?
Difese costitutive:
-barriere strutturali: es., cuticola, periderma, parete
cellulare
-metaboliti secondari tossici
Difese indotte:
- risposta locale: induzione di una serie di reazioni
metaboliche al sito di infezione mirate a bloccare
l’ingresso del patogeno
-risposta sistemica (Resistenza sistemica acquisita, SAR)
Difese costitutive delle piante:
Protezione delle superfici
La cuticola è formata
da cutina e cere
Il periderma, il
tessuto che forma la
corteccia esterna del
fusto e radici durante
l’accrescimento
secondario delle
piante, contiene la
suberina
Cutina, cere e suberina:
lipidi associati alla parete per ridurre le perdite di acqua e impedire
l’ingresso di patogeni (in quanto ne rallentano la germinazione per
carenza di umidità)
Cuticola
Parete cellulare
cuticola
Strato cuticolare
Parete cellulare
primaria
Membrana
plasmatica
Ruggine del fagiolo,
Uromyces appendiculatus
Parete cellulare vegetale:
una barriera contro numerosi patogeni
Pectine
Emicelulose
Proteine
Cellulosa
Lignina
Polimero di composti fenolici,
specialmente fenilpropanoidi
Alcol p-cumarilico
Rinforza la parete cellulare
Aumenta la resistenza
all’attacco dei funghi/patogeni
La sintesi di lignina elimina H2O dalla parete e forma una trama
idrofobica che lega la cellulosa e previene l’estensione cellulare
Proteine strutturali e funzionali della
parete cellulare vegetale
Le proteine strutturali formano legami nella parete
•In generale, sono
delle glicoproteine,
ricche in aminoacidi
idrossiprolina, prolina o
lisina.
•Sono idrofiliche e possono formare
legami H.
•NH3 della lisina può legarsi con COOdegli ac. pectici.
•Possono formare legami covalenti (estensina) tra
residui di tirosina
HRGP, GRP e PRP
• Appena secrete sono relativamente solubili
• Diventano sempre più insolubili durante la maturazione cellulare o a
seguito di ferite e attacco dei patogeni
• Si ritiene che il processo di insolubilizzazione sia dovuto a legami
intramolecolari di difeniletere fra le tirosine
• Vengono indotte durante le ferite o attacco dei patogeni
AGP
•Sono proteine arabinogalattaniche altamente glicosilate: il
90% della massa puo’ essere degli zuccheri!
•Potrebbero essere importanti nella segnalazione durante il
differenziamento
Proteine con attività enzimatica
•Enzimi ossidativi – perossidasi
•Enzimi idrolitici – pectinasi, cellulasi
•Enzimi per l’estensione cellulare – espansine
•Inibitori degli enzimi secreti dal patogeno
Patogeni
producono enzimi capaci di degradare la
parete
GLU
PL
XIL
Inibitore proteico della poligalatturonasi (PGIP)
Riduce l’attività macerante della PG
Favorisce l’accumulo di OG
Difese costitutive delle piante:
Metaboliti secondari tossici
Metaboliti secondari
Le piante producono una vasta gamma di composti chimici
organici che non sembrano avere una funzione diretta
sulla loro crescita e sviluppo.
Queste sostanze sono note come metaboliti secondari
o prodotti naturali.
Distinzione tra Metaboliti primari e secondari
In assenza di una distinzione basata sulla
struttura o sulla biochimica, si può effettuare
solo una distinzione di tipo funzionale:
Metaboliti primari: Partecipano nella
nutrizione e nei processi metabolici essenziali
della pianta.
Metaboliti secondari: Influenzano le
interazioni ecologiche tra la pianta e il suo
ambiente.
I metaboliti secondari a differenza
dei metaboliti primari si ritrovano
soltanto in singole specie vegetali o in
un gruppo di specie vegetali
tassonomicamente affini.
RUOLI FISIOLOGICI
Influenzano le interazioni ecologiche tra la
pianta e il suo ambiente.
·Difesa delle piante contro microrganismi
patogeni e erbivori
·Attrazione per animali impollinatori e che
partecipano alla dispersione del seme
·Competizione tra specie di piante (allelopatia)
Esistono 3 gruppi principali di metaboliti secondari
•Terpeni
•Composti fenolici
•Composti contenenti azoto
Terpeni
Sintetizzati a partire dall’acetil CoA o da intermedi della
glicolisi
Si formano per fusione di unità isopreniche a 5 atomi di
carbonio
Si classificano in base al numero di unità isopreniche:
• monoterpeni (2 unità, es. piretroidi)
• sesquiterpeni (3 unità, es. gossipolo)
• diterpeni (4 unità, es. acido abietico contenuto
nelle resine)
• triterpeni (6 unità, saponine)
• politerpeni (n unità, gomma)
Comprendono circa 25.000 differenti composti
Esempio di monoterpene
Le
zone
chiare
indicano le regioni di
attacco
degli
scarafaggi
della
corteccia sul tronco di
un pino.
La resina prodotta in
seguito
all’attacco
contiene terpeni (a- e
bpinenemonoterpeni) tossico
per l’insetto.
Monoterpene
Monoterpene
Piretroidi (esteri monoterpenici)
Piretro della Dalmazia (Tanacetum
cinerariifolium (Trevir.) Sch.Bip. Famiglia
delle Asteracee
Es: deltametrina
Esempio del meccanismo d’azione dei piretroidi come insetticidi
Similitudini………………
Modello per il meccanismo di
attivazione della H+-ATPasi da
parte della fusicoccina prodotta
dal fungo patogeno Fusicoccum
amygdali (patogeno del pesco,
mandorlo)
Composti fenolici
Sostanze aromatiche che si formano attraverso la via
dell’acido scichimico o dell’acido mevalonico.
La fenilalanina è un intermedio nella via biosintetica della
maggior parte dei fenoli vegetali
es. lignina, antocianine, fitoalessine, tannini
Comprendono circa 8.000 differenti composti
Es. Stilbeni tra cui
il resveratrolo
(es. allelopatia)
(fitoalessine)
(fitoalessine)
fitoalessine
Composti a basso peso molecolare con attività
antimicrobica. Vengono anche indotte in seguito ad
infezione di patogeni
Componenti della lignina
Alcohol coumaryl
CH2OH
Struttura parziale della lignina
Tannini
Si distinguono in due classi sulla base del percorso biosintetico:
•Tannini condensati
•Tannini idrolizzabili
Modalità d’azione dei tannini con le proteine
È stato dimostrato che in
molti tessuti vegetali sono
presenti enzimi che
nell’intestino degli
erbivori ossidano i fenoli
nella corrispondente
forma chinonica
Diventano difficilmente
assimilabili per gli erbivori
Composti contenenti azoto
Sono sintetizzati a partire da amminoacidi
Sono molto tossici per gli erbivori e, se ingeriti in quantità
sufficienti anche per l’uomo (es: la stricnina, l’atropina e la
coniina contenuta nella cicuta)
Comprendono circa 12.000 differenti composti
-Alcaloidi, l’atomo di azoto è presente normalmente
in un anello eterociclico
-I glucosidi cianogenetici liberano acido cianidrico (HCN)
-I glucosinolati, contengono S, principalmente presenti
nelle crucifere
La degradazione dei glucosidi cianogenetici e dei
glucosinolati è un processo enzimatico a 2 tappe
Nel tessuto intatto non avviene perché il substrato
e l’enzima sono accumulati in differenti comparti
cellulari
Glucosidi cianogeni
O glucose
CH3
C
CH3
CN
glucosidasi
CH3
OH
CH3
CN
Linamarina
in Trifolium, Lotus
L’HCN è un veleno, interviene a livello della
catena di trasporto degli elettroni nel
mitocondrio
(CN- reagisce con Fe+++ della CITOCROMO
OSSIDASI e forma un complesso CNCITOCROMO OSSIDASI, relativamente stabile
con conseguente INIBIZIONE DELLA CATENA
RESPIRATORIA MITOCONDRIALE (blocco
della fosforilazione ossidativa e della
produzione di ATP))
+ glucose
C
Spontaneamente
o idrossinitrile liasi
CH3
C
CH3
O +
HCN
L'amigdalina è un glucoside cianogenetico contenuto nei semi di
diverse Rosacee (in gran quantità in quelli di mandorle amare).
La beta-glucosidasi non si riscontra nei tessuti dei mammiferi, ma la flora
batterica intestinale umana appare in grado di degradare in parte l'amigdalina
(tramite enzimi simili alla beta-glucosidasi);
Una eccessiva ingestione di semi di uva, mele, pere o il nocciolo della pesca,
dell'albicocca è sconsigliata perché causa liberazione nell'organismo di acido
cianidrico che può portare a morte per asfissia.
glucosinolati
Contengono zolfo e azoto
Questi prodotti aqiscono da difesa in quanto sono tossici
per gli erbivori e hanno un gusto repellente.
R N—C S
isotiocinato
S—glucosio
mirosinasi
R—C
N—O—SO3
SH
spontanea
mente
R-C
N-O-SO3-
–
R-C=N
+ glucosio
SO4
–
nitrile
Amminoacidi non proteici
Modalità d’azione
La canavanina viene legata al tRNA dell’arginina
determinando la non funzionalità della proteina
Lectine
Proteine che si legano ai carboidrati o
alle glicoproteine.
In seguito ad ingestione si legano alle
cellule dell’epitelio del tratto digerente
interferendo con l‘assorbimento delle
sostanze nutritive
Inibitori dei processi digestivi degli erbivori
-Inibitori delle a-amilasi: impediscono la digestione
dell’amido
-inibitori di proteinasi: bloccano l’azione degli enzimi
proteolitici legandosi al loro sito catalitico (es. legandosi
alla tripsina o chimotripsina)
Le piante transgeniche sovraesprimenti inibitori di
proteinasi sono più resistenti all’attacco degli insetti
Gli inibitori di proteasi sono un esempio di
risposta indotta
Come avviene?
polipeptide di 18 aa
La sistemina rappresenta l’unico ormone
proteico finora noto nelle piante
Risposte di difesa inducibili
Le piante posseggono numerosi
meccanismi di difesa indotti
•Risposta di ipersensibilità (HR)
•Produzione di ROS
•Sintesi di NO
•Sintesi di proteine PR
•Fortificazione della parete cellulare
•Sintesi di sostanze ad attività antimicrobica
Attivazione
temporale
delle difese
indotte
Terminologia da ricordare………..
Interazione compatibile e incompatibile
Descrive l’interazione ospite-patogeno dal punto di vista
del patogeno.
Interazione incompatibile: indica una interazione in cui
l’ospite è resistente e quindi il patogeno non colonizza la
pianta ospite
Interazione compatibile: indica una interazione in cui
l’ospite è suscettibile al patogeno e quindi il patogeno
colonizza la pianta ospite.
Risposta ipersensibile (HR)
La risposta HR consiste in una rapida e localizzata morte cellulare
Foglie di tabacco infettate con TMV
che mostrano la risposta HR
Tentativo di invasione di un nematode su radici di pomodoro
Interazione incompatibile: risposta HR a livello della zona di
migrazione (A) e dei siti di tentata penetrazione (B)
Interazione compatibile (C): è evidente la colonizzazione del tessuto
ospite e le maggiori dimensioni del nematode
Produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS)
Uno dei primi eventi che seguono l’attacco del patogeno è
l’accumulo apoplastico e citosolico
di specie reattive dell’ossigeno (ROS)
- perossido di idrogeno (H2O2)
- anione superossido (O2)
- radicale idrossile (OH )
ROS possono essere generate da una serie di
meccanismi enzimatici nell’apoplasto:
- NADP(H) ossidasi
- ammino ossidasi
- ossalato ossidasi (ossalato + O2 + 2 H+ ⇄ 2 CO2 + H2O2)
- perossidasi
Questo fenomeno è chiamato “scoppio ossidativo”
(oxidative burst)
Ruoli proposti per le ROS nella risposta di difesa:
•H2O2 tossica per il patogeno
•In presenza di Fe, produzione del radicale
idrossile (OH ) altamente reattivo
•Rafforzamento della parete cellulare (cross-linking di
HRGP e PRG ai polisaccaridi di parete; aumento della
velocità di formazione del polimero di lignina
incrementando l’attività perossidasica)
•Ruolo nella segnalazione e induzione della autofagia
(induce l’acido benzoico 2-idrossilasi, la glutatione Stransferasi)
•Alterazione del bilancio redox (molti fattori di
trascrizione dei mammiferi sono regolati dallo stato
redox cellulare)
Produzione di ROS in una cellula vegetale (coltura in vitro)
al sito di penetrazione da parte di un patogeno avirulento
Colorazione istochimica dell’anione superossido/perossido di idrogeno
Piante transgeniche di patata che sovraesprimono la
glucosio ossidasi di Aspergillus niger per la produzione di
H2O2. E’ evidente che le piante transgeniche sulla destra
non sono attaccata dal fungo Verticillium dahliae.
La produzione di NO viene indotto durante l’interazione incompatibile
L’ossido nitrico è una molecola
segnale che nei mammiferi regola
diversi processi biologici dei sistemi
immunitario, nervoso e vascolare.
Nelle piante viene indotta una
rapida sintesi de novo di NO in
seguito al riconoscimento di batteri
avirulenti.
Intensifica l’induzione della morte
cellulare causata da ROS (ROS da solo
è insufficente ad indurre morte
cellulare)
Induce numerosi geni implicati nella
risposta di difesa
Il rafforzamento della parete cellulare e attività extracellulari
contribuiscono alla risposta di restenza
•Formazione di papillae di callosio e lignina
•Rapido cross-linking delle HRGP extracellulari
•Modulazione dell’attività idrolitica delle PG fungine ad opera
della PGIP
Induzione di Proteine PR “Pathogenesis-Related proteins”
Families
PR-1
Type member
Tobacco PR-1a
Properties
antifungal
PR-2
Tobacco PR-2
b-1,3-glucanase
PR-3
Tobacco P, Q
chitinase type I,II, IV,V,VI,VII
PR-4
Tobacco 'R'
chitinase type I,II
PR-5
Tobacco S
thaumatin-like
PR-6
Tomato Inhibitor I
proteinase-inhibitor
PR-7
Tomato P69
endoproteinase
PR-8
Cucumber chitinase
chitinase type III
Tobacco 'lignin-forming
PR-9
peroxidase'
peroxidase
PR-10
Parsley 'PR1'
'ribonuclease-like'
PR-11
Tobacco 'class V' chitinase
chitinase, type I
PR-12
Radish Rs-AFP3
defensin
PR-13
Arabidopsis THI2.1
thionin
PR-14
Barley LTP4
lipid-transfer protein
PR-15
Barley OxOa (germin)
oxalate oxidase
PR-16
PR-17
Barley OxOLP
Tobacco PRp27
'oxalate oxidase-like'
unknown
Aumento di enzimi idrolitici
Co-espressione della glucanasi e chitinasi in tabacco
produce i migliori risultati per la resistenza al fungo
Cercospora nicotianae
Aumento di enzimi idrolitici
Piante transgeniche di tabacco che esprimono la glucanasi
in antisenso.
I sintomi dell’infezione da TMV sono minori nella pianta transgenica
(foglia superiore) rispetto alla pianta di controllo.
In questo modo si è ridotta l’attività glucanasica che il TMW induce
in tabacco per rimuovere il callosio dai plasmodesmi.
Aumento di fitoalessine
Sovraespressione della stilbene sintasi in tabacco che
porta alla formazione della fitoalessina rasveratrolo
(conferisce resistenza alla B. cinerea)
Le piante posseggono numerosi
meccanismi di difesa indotti
•Risposta di ipersensibilità (HR)
•Produzione di ROS
•Sintesi di NO
•Sintesi di proteine PR
•Fortificazione della parete cellulare
•Sintesi di sostanze ad attività antimicrobica
Risposta sistemica acquisita (SAR)
Risposta sistemica acquisita (SAR)
Virus, funghi e batteri
sono in grado di attivare
in modo sistemico uno
specifico sottogruppo di
risposte di difesa nota
come SAR, che implica la
produzione locale di SA
e un segnale floemamobile.
Acido salicilico (SA) (e acido benzoico (BA)) intervengono in
numerose risposte di difesa
BA e SA si accumulano ad elevate concentrazioni nelle
immediate vicinanze del sito di infezione in una reazione
incompatibile
SA è coinvolto nella risposta di difesa
Piante di tabacco e
Arabidopsis
contenenti il
transgene nahG
(codificante la salicilato
idrossilasi, che converte
SA in catecolo) hanno
una ridotta risposta di
resistenza (es: al
TMW) e non
presentano l’induzione
di numerosi geni di
difesa
Induzione sistemica degli inibitori di proteasi (e da
stress da ferita) ad opera della sistemina
Via di segnalazione della sistemina per l’induzione degli inibitori delle
proteasi in pomodoro
Fig. 13.25 TAIZ
Come si attivano le risposte di difesa inducibili?
L’attuazione delle risposte di difesa inducibili
presuppone una capacità della pianta a:
1
percepire la presenza del patogeno (evento che
viene definito di ‘riconoscimento’)
2 trasmettere l'informazione all'interno della cellula
infettata e alle cellule limitrofe il sito d'infezione
3 indurre una serie di modificazioni, sia a livello del
sito d'infezione che sistemiche, in grado di limitare
l'invasione del patogeno
Percezione del patogeno (evento di ‘riconoscimento’)
Capacità della pianta di distinguere molecole self da
molecole non-self
• analogie con l’auto-incompatibilità gametofitica che
previene l’autofecondazione in pianta ermafrodite
Impollinazione
Granello pollinico
Meccanismi di auto- e
‘allo’- incompatibilità che
impediscono la auto- o
‘allo’- impollinazione
Stigma
Papilla stigmatica
Stilo
Impollinazione
Impollinazione
Riconoscimento
Percezione del segnale
Modello gene-per-gene proposto da Flor
Ora conosciamo alcuni dettagli in più sulla risposta di difesa…
•Le piante utilizzano i “pattern recognition receptors
(PRRs)” presenti sulla membrana plasmatica per percepire
dei potenziali patogeni presenti nell’ambiente.
•PRRs riconoscono delle specifiche strutture
conservate presenti nei microrganismi che sono
chiamate “pathogen-associated molecular patterns
(PAMPs)”
•Questo riconoscimento conduce alla “PAMP-triggered
immunity (PTI)”, che previene efficacemente la
colonizzazione della pianta ospite dai non-patogeni.
•Il sistema meglio studiato di PTI è la via dipendente
dall’FLS2. Il PRR FLS2 riconosce il PAMP flg22 che è
un componente della flagellina batterica.
Meccanismo di
rimozione di
FLS2 attivato
•I patogeni posseggono dei fattori di virulenza o
effettori (“effectors”) che sopprimono la PTI. Questo
conduce alla “effector-triggered susceptibility (ETS)”
e il patogeno causa la malattia.
•Di conseguenza alcune piante hanno evoluto dei geni
di Resistenza (R) che riconoscono gli effettori o la
loro attività. Questo conduce alla “effectortriggered immunity (ETI)” e la pianta non si ammala.
•Sia la PTI che ETI determinano l’induzione dei geni
di difesa.
A zigzag model illustrates the quantitative output of the plant immune system
PRR
From: The plant immune system
Jonathan D. G. Jones & Jeffery L. Dangl
Nature 444, 323-329(16 November
2006). doi:10.1038/nature05286
•Uno dei sistemi meglio studiati dell’azione degli
effettori e dei geni R è il sistema AvrPto/Pto
Model for PTI-inhibition and ETI-induction by AvrPto
(FLS2)
Susceptibility: Pseudomonas syringae secretes the effector protein AvrPto and block ETI
Resistance: Tomato plants carrying R gene Pto interact with AvrPto triggering ETI
PRR
PTI
ETI
La struttura LRR è tipica dei prodotti dei geni R
Struttura dei prodotti dei geni R e di alcune proteine
coinvolte nello sviluppo
Il motivo LRR è stato dimostrato mediare le interazioni proteinaproteina e recettore-ligando.
Tre possibili modi per riconoscere il patogeno
Gli effettori sono codificati dai geni di Avirulenza
o geni Avr
• Un patogeno che possiede geni Avr è considerato
nonvirulento (Avirulento) su una pianta che possiede
un gene R corrispondente; I prodotti dei geni Avr sono
effettori.
• L’associazione tra i geni Avr e R sono descritti nella
interazione gene-for-gene di Flor.
Tipi principali di organizzazione dei geni R
Meccanismi genetici che generano nuovi geni R
Meccanismi genetici che generano nuovi geni R
Alcuni dettagli sulla struttura dei geni R
Trasmissione del segnale di
riconoscimento
Fig. 13.26 TAIZ
Induzione delle risposte di difesa delle piante
Trasmissione del segnale
Molti segnali
regolano
l’espressione
genica
attraverso una
cascata di
proteine chinasi
I mutanti di Arabidopsis ndr1 e eds1 dimostrano
l’esistenza di distinte vie di segnalazione a valle
del riconoscimento R-Avr
Il mutante di arabidopsis eds1 è resistente allo P. syringe
Il mutante di arabidopsis ndr1 è resistente allo P. parasitica
Vie di segnalazioni parallele coordinano la complessa e localizzata risposta di difesa
