Applicazioni biochimiche della cromatografia
su gel di destrano
G. B. MARINI-BETTùLO
Capo dei Laboratori di Chimica Biologica, Istituto Superiore di Sanità , Roma, Italia
Questa rassegna sulla cromatografia su supporto di destrani r ientra
quelle messe a punto di problemi di attualità nel ca mpo delle separazioni
chimiche che ho tenuto da alcuni anni e che ser vono a trarre un bilancio
ùei risultati e soprattutto a prevedere quali applicazioni pratiche po!.'sono
d e rivare dalle nuoYe tecniche ( 1' 4) .
D esidero qui illustrare alcune possibilità pratiche c he ci offre, p er risol,·cre taluni problt>mi di ordine biologico e biochimico, un nuovo tipo di se·
parazione fondato sul principio già noto della g{'l filtrazione applicato con
s ucce!"so da ricercatori sved esi (6 ' 7 ) con l'impiego di nuovi colloidi come
supporto.
Se si considera la cromatografia secondo la definizione di Gordon, Martin e Syn ge ( 8) com e un qualsiasi tipo di separazione che avYiene per percolazionc in una colonna indipendentem ente dai fenome ni che si ,-erificano,
a nche le se pa razioni su colonne di colloidi di polidestrano si possono comprendere nd quadro più vasto d ella cromatografia.
tn
PRI NCIPI
Quando si disp onga di un composto macromolecolare do ta to di un s uf!iciente numero di legami trasversali (cross lìnking) quali i polidestrani,
le poliacrilammidi, i polivinilpirrolidoni e tc., che si ri gonfia co n acqua per
dare un gel, e questo materiale si utilizzi in una colonna, si ottiene un siste ma ca pace p er il suo stato fisico di realizzare un certo numero di S(•parazioni, allorchè venga attraver sato da una nùscela di du e o più sostanze.
Il numero dei legami trasversali d el material e di supporto rappresenta
il fatture piìt importante p~:r queste se para zioni, i11 qu anto è in r elazione diretta con le dimensioni d ei pori delle particelle. I n fatti la presenza di pochi
lt>gami trasversali indica pori l a rghi e quindi forte capacità di rigonfia mento.,
mentre molti lega mi trasversali indicano pori stretti e minore capacità di
. 11111.
! st. Super. Sanil<ì (1966) 2 , 2l l ·2t3 .
212
!H:~U
ARI 1>1 CROM ATOGRAFIA
rigontiamcuto. In tal moJo le singo le particelle dd colloide nella colonua
sono rigonfie di liquido ma sono altresì circondate da altro liquido trattC'ntlto.
Se a questo punto si fa passare per la colonna una soluzione con tenen t tuna sostanza a basso peso molecolare, può avvenire che, se Jt. dimen sioni
delle molecol1· sono più piccole di quelle d ei pori delle particelle del gel,
la !:'ostanza può entrare n el !!cl e ,-enire trattenuta, m entre, se si ha una sostanza ad alto peso molecolare, le cui dimensioni s uperano quelle dci pori,
tale sostanza, non pote ndo penetrare all'interno del gel, non sarà trattenuta,
ma passerà rapidamente ndi'eluato (Fig. l). In questo modo sarà possibile
realizzare una efficace separazione di sostam:e sulla bas1· d ella lor o diversa
complessità ruolecolare.
%
:\
.%
~
~
~
%
%
~
~
~
~
~
~
Fig. l . -
~ ~
Principio d elle separazioni di •Ostanze n diverso p eso molecolarr
attraverso gel filtra:ion c. Le moll'cole più piccole (piccoli cerchi
neri) penetrano nel gel (cer chi
bianchi) e vi vengono trattenute.
mentre le molecole più grandi
rimangono all'est erno e passano
nell' elua t o.
È noto che questo sistema, conosciuto con il nome di gel filtrazione ,
ha sostituito in molti casi la dialisi per la separazioni' delle proteine dagli
elettroliti. In questo caso le IJrime frazioni dcll'eluato di una colonna saranno costituite dalla sosta:nza ad alto peso molecolare, cioè dalla proteina
non trattenuta per le sue dimensioni dal gel, mentre le frazioni che passano
dopo m1 certo intervallo, saranno costituite dall'elettrolita.
Am•. Jsl . .Supcr. i';(l ll i l ù (19GGl 2, 211 · 22:!.
:!13
MARINI· DETTÒ LO
A ques to S COfHJ si dispone in commercio dei des trani polimt:rizzati
con epicloridrina a diverso grado di legami trasversali pre parati da Porath,
Flodin e Gelotte (5" 7) a Uppsala, che ne hanno anche p er primi studiato le
proprietà e l' impiego.
Dal caso limite della gel filtrazione si può, variando il grado di polimerizzazione trasversale, ottenere Jel materiale con pori rli rliverse dimensioni, capace di separare non solo grandi molecole da picco!e molecole, ma
altresì di frazionare sostanze di peso molecolare abbastanza vicino. Si r ealizza così un sistema di separazione che si potrebbe riavvicinare a quello
dei setacci di diversa dimensione e ch e appunto p er questa somiglianza è
!ltato c hiamato « setacci molecolari ,, (molecular sieves).
P er realizzare quest e separazioni esistono in commercio già preparati
dei polidestrani a diver so grado di legami trasversali con caratteristiche determinate (Tab. l e 2). È così possibile con tale sistema procedere al frazionamento di sostanze macromolecolari di diversa complessità.
TABELLA
l.
Separazione di macromolecole di diverso peso moiecolare (PM)
mediante gel di polldestranl (Sephadex) di diverso tipo
T ipo d i Scphnd cx
G -
25.
G -
Limite ùi esclusione PJ\1
5. 000
Limiti di P)l e ntro i qua li
le m olecole possono cssorc
sepa rate in baso a lle
<ilrnc nsio ni
100 -
5.000
50.
10 .000
500 -
10 .000
G- 75.
50.000
1.000 -
50 .000
G - 100.
100 .000
5 .000 - 100 .000
G - 200.
200.000
5. 000 - 200 .000
Va tenuto presente che in una colonna di gel di questo tipo la separazione che a v viene non può essere attribuita, come in altri processi cromatografici. ad una sola funzione, quella di setaccio molecolare, in quanto, oltre
alla diffu~ione d elle molecole attraverso le particelle del gel, esist e an ch e il
liquido adsorbito rhe può a rigore considerarsi la fase star.ionaria di una cromatografia di partizione: in questo caso intervien e un fenom~::no che è det e rminato dal volume di solvente dentro e fuori le particelle dd gel.
Se si considerano le due fasi, il coefficiente rli partizione di una sos tanza
tra l'acqua che si trvva dentro le particelle di gel e quella es terna aHà un
. 111 11 .
f sl. /S I! Jl<' r. &a11 i l à (1966) 2, 21 1·22:!.
214-
SEMINARI DI CROM ATOGRAFIA
TABELLA
2.
l
l
Separazione di particelle di varie dimensioni mediante gel
di polldestrani (Sephadex) di diverso tipo
Tipo di S<)Jlhndc x
Volume ml/g
di Sopbadux secco
l
l
g di Sephndux
sccco/100 mi di gt·l
l
l
l
Dimensioni dello
Particelle
fL
-
G- 25
5
20
G-
50
10
10
G-
75
12 - 15
7
4-0 - 120
G - 100
15 - 20
6
4-0 - 120
G - 200
30 - 4-0
3
40 - 120
----
valore K D eh<' è anche una funzione della grandezza molecolar c della sostan za impiegata . Se si considera a questo punto il volume totale Vt di
una colonna di particelle di gel, esso sar à eguale alla somma del volume dcii!•
particelle v g più il volume vi dentro alle particelle più il volume esterno vo
QueE:to \'Olume esterno, V0 , equivale al volume necessario per eluire la sostanza attraverso la colonna nel caso che le molecole non penetrino dentro le particelle di gel.
Il volume di eluizione, ve, di una sostanza dipenderà pertanto dal valore del volume esterno alla parti cella, V0 , e dal coefficient e di distribuzione,
K 0 , moltiplicato per il volume interno alle particelle, V1, cioè per la p arte
accessibile alle molecole di una particolare sostanza :
dato che K 0 possiede un valore caratteristico per ogni sostanza indipendentemente dalla forma del ge:l si avrà
Il valore di K 0 può essere uguale a zero n el caso di molecole che non
possono entrare nel liquido dentro le particelle di gel, cioè nella fase stazionaria (ad rsempio n el caso delle proteine) o uguale ad l nel caso di molrcole piccole che entrino completamente nel gel (come nd caso di sali).
A nn. I st. Super. Sanità (1966) 2, 211·223.
MARINI-BETTÒLO
215
È possibile a questo punto calcolare il valore del volume di liquido
necessario per la separazione, V8 • Esso sarà, secondo l'elaboraziOne di Gelotte ('), eguale alla differenza tra il valore di Ve' e di Ve" delle due sostanze
da separare e cioè
pertanto per una buona separazione è necessario che il campione venga
portato sulla colonna in soluzione in un volume che non sia maggiore di
VB (Fig. 2).
i
c
- V0
V;-- - - -
--
1 -Vs--1
Volume di eluzione, v.
Fig. 2. -
Separazione di molecole di varia grandezza attraverso colonna di gel, in funzione del coefficiente di ripartizione (Kd) . Kd = O, per molecole che non
possono entrare nel gel; K d = 0,5, per molecole che entrano per metà nel
gel; K d = l per molecole che entrano completamente nel gel (schematico).
Vo= volume esterno, Vs = volume di separazione, Vt = volume interno. In
ordinate la concentrazione (C) deUe molecole neU'eluato.
Per riassumere si può dire che una colonna di particelle di gel organico
può essere utilizzata per le sue proprietà non solo di setaccio molecolare,
ma anche mettendo a profitto la possibilità di una ripartizione tra le due
fasi acquose entro e fuori delle particelle, che sono caratteristiche delle singole sostanze da separare (Tab. 3 e Fig. 3). Inoltre, dato che su un supporto
non si ha mai un solo fenomeno come si è visto nel caso già della cromatografia di adsorbimento, di partizione e di scambio ionico, anche in questo
caso, accanto al processo principale sopradescritto, abhiamo fenomeni di
adsorbimento che possono talvolta interferire od essere utilizzati in queste
separazioni.
Volendo d'altra parte associare il fenomeno di setaccio molecolare e di
scambio ionico presentato da questi speciali polimeri, sono stati preparati
dei particolari polidestrani contenenti, come nel caso della DEAE-cellulosa,
dei gruppi dietilammino-etilici capaci di conferire a questi gel capacità
scambiatrici, che nelle colonne consentono di utilizzarll il processo dello
scambio ionico assieme a quello del s«.>taccio molecolare.
Ann. Isl. Super. Sanità (1966) 2, 211-223 -
2](•
Sl:MINAill Ul CRO}IATOGRAFIA
TABELLA
3.
Caratteristiche di vari tipi di gel di polldestrani (Sephadex)
~-~-~J'ipo d l !'4<•Vh nd l·X
Vohmw
totnlt•
(V,>
1-l
Volu m e
c• terno
( \'o>
Volum<•
lnk•l'IIU
Jlcn si tA
(umido)
( \ ';)
l
G -
2.)
l
5
2
G -
.'io
l
w
4
G -
75
l
l
2,S
l' 13
5
l ,07
13
5
7
l ,05
G - 100
17
6
LO
1,04
G - 200
30
9
20
1 ,02
l
l_
Dall'esposizione di questi principi ci si rende subito conto dellr pos·
sibilità che può offrire l'impiego di colonne di setacci molecolari nelle sepa·
razioni d elle sostanze or ganiche. Oltre ch e n ella gel filtrazione, che consente
la separazione di sostanze a basso p eso molecolar<' e il frazionamento di
proteine, si possono impiegare qu este tecnichr n ello studio di una serie di
.500
r------------------------------------------,
.400
.300
.200
.100
o
Fig. 3. -
l
10
: 20 l l
: I : :
30
II
40
60
50
l
70
o
Tubocuro r ino
Separazione mediante colonna Sephadex G-100 di una miscela di tubocura·
rina e proteine del plasma (I e Il). In ordinate: assorbimento aii'U.V. ; in
ascisse, fr azioni dell.' eluato. La netta separazione dei massimi indica assenza
di legami.
Amt. / s i. :Supu. :Saltili& (1966) 2, 2 11 ·223 .
~IARI N I·BETTÒLO
217
problemi di particolare interesse biochimico e biologico. Desidero soflennarmi appunto su alcuni di questi punti che investono direttamente problemi
particolari quali lo studio dei complessi tra ~acromolecole e la separazione
e la caratterizzazione dei sieri immuni.
STUDIO DEI COMPOSTI DI ASSOCIAZIONE
TRA SOSTANZE A BASSO PESO MOLECOLARE E MACROMOLECOLE
Lo studio di composti tra macromolecole e sostanze a basso peso molecolare può essere di grande utilità per stabilire le combinazioni tra farmaci
e proteine, per avere una misura dell'affinità degli enzimi per i substrati
e dei coenzimi per gli apoenzimi, e per altri analoghi problemi di interesse
fondamentale pe r la biochimica e per lo studio del meccanismo d'azione
dci farmaci.
Il primo di questi punti è di particolare interesse al fine d'avere una
idea sulle combina:lioni tra i farmaci €Ò i recettori specifici. Infatti è noto
che p t'r spiegare l'azione specifica d ei farmaci si suppone l'esistenza rli r ecettori specifici costituiti da det~:rminate proteine facenti parte di diversi tessuti, ad esempio n elle sinapsi neuro-muscolari, etc. Sulla base di una maggiore o minore affinità dei farmaci per questi recettori di cui si hanno numerose prove indirette, si vuole oggi interprf'tare il meccanismo d'azione dei
farmaci.
Non è possibile entrare nella discussione ed esposizione di queste teorie per le quali rimandiamo ai lavori E. J. Ariens (~) e che costituiscono
la base della mod erna farmacologia biochimica. È tuttavia interessante
vedere quali metodi il chimico ed il biologo hanno a disposizion e per sta·
hilire direttamente l'esist enza di complessi o composti labili tra recettori
specifici proteici e farmaci.
Uno dei metodi largamente impiegati è la dialisi: essa consente di dimostrare l'esistenza di legami tra proteine e farmaci, nonchè di misurare
la forza di questi legami. Inoltre è stata studiata a questo scopo la possi·
bilità di determinare pe r via elettroforetica , su di un supporto, la formazione
di questi composti. A questo sco po Bickel e Marini-Bettòlo ( 10) proposero
alcuni anni or sono la elettroforesi incroctata, basata sul principio di far
migrare in un campo ele ttrico, su di un supporto come la carta, una proteina e un farmaco in modo ch e qu esti vengano ad incontrarsi. A parte i
fe nomeni <li adsorbimento, la proteina che viene disposta su di una linea
continua verticale sulla carta, all'incontrarsi con il farmaco può d eformarsi
in un senso o n ell'altro, oppure può rimanere inalterata: nel primo caso si
può ammettere che vi sia stata formazione di un c:'omposto che ha pl'rtanto
diversa velocità di migrazione, mentre nel secondo caso si deve supporre
ch e non vi sia nessuna reazione tra i due componenti.
A nn. !st. Super . Sanità (1966) 2, 2 11 ·223.
2111
SEMINARI DI CROMATOGRAFIA
Anche la gel filtrazione può consentire la ca ratteri zzazione de lla formazione di un complesso tra prot eina c una sostanza a basso peso molecolare. Infa tti , m escolando un farmaco con una proteina, sr questi non si
combinano, dovrà effluire prima la proteina e poi il farma co formando dur
ma!>simi distinti, m entre n el caso di combinazione si avrà in un primo tempo il composto protr ina-farmaco e quindi eventualmente il farma co solo.
È facile rendersi conto di questo fenomeno quando il compost o a basso
peso molecolare sia colorato, o facilmente riconoscibile co n una r eazione
chimica o con m etodi fisici. Lee e Debro ( 11 ) hanno effettuato l'esperirnza
con Sephadex , rosso fenolo cd albumina mettendo appunto m evidenza con
una sem plice misura colorimctrica la formazion e del complesso tra proteina
e colorante.
Non è tuttavia sempre facile stabilire con m etodi a nalitici semplici
la presenza dd fa rmaco accanto a quella d ella proteina o d ella proteina legata al farmaco: si ri corre gener almente per questo scopo a reazioni cromatiche che si possono seguire spettrofotometricamente, o alla misura dir etta d ell'assorbimento n ell'U. V. oppure all'impiego di sostanze marcate
con un radioisotopo .
Alcuni risultati di interesse indubbio sono stati ottenuti d a H a rd y t"
Mansford {1 2 ) ch e n el ] 962, u sando Sephadex G-25 con d ei deri vati d ell'acido
salicilico e con delle p enicilline semisintctich e dimostrarono la possibilità
che queste sostanze hanno di legarsi con le proteine del siero.
A questo scopo il siero veniva incuhato con il farmaco e quindi fatto
passare sulla colonna . Gli eluati venivano saggiati Fpettrofotometricamcntc
dopo trattamento con nitrato ferrico per rivelare i derivati salicilici; nel caso
delle penicilline veniva invece impiegato il m etodo biologico, m entre la concentrazione delle proteine v eniva misurata p er via spettrofotometrica a
280 mf.L·
Gli Autori hanno osservato ch e n el caso di combinazion e si avevano
due massimi n el grafico costruito in funzione della concentrazione d ei prodotti n ell'eluato e del numero delle frazioni : un o di questi m assimi er a costituito da proteina e da farm~co e il secondo dal solo composto non combinato.
In alcuni casi il complesso è così stabile ch e si può ulteriormente purificare ripet endo l'operazione con il frazionamento attraver so Sephadex
G-50 DEAE con tampone a pH 6,6.
In una serie di esperienze in corso effettuate con il Dr. Porcelli (13} p er
studiare l'eventual e legame tra sostanze curarizzanti c proteine del plasma è stato impiegato cloridrato di tubocurarina e plasma umano. Come
supporto nella colonna si è u sato Scphadex G-1 00, che m eglio d egli altri
si presta per la sua caratteristica di separare molecole molto diver se pe1·
p eso molecola re; la tuhocurarina vif!nc lasciat a a contatto con il plasma
Ann. 181. SttJJer. Sa11ilà (1966) 2, 211 ·223.
ì
MARINI·BETrÒLO
219
per qualche tempo prima di essere disposta sulla colonna. Negli eluati si
procede al dosaggio quantitativo della tubocurarina e delle proteine plasmatiche impiegando il r eattivo di Lowry-Folin.
Tuttavia, dato che la tubocurarina è sensibile a quest 'ultimo, è difficile disporre di una r eazione quantitativa differ enziale tra i due componenti ;
ciononostante si può constatare la presenza di òue massimi ben differenziati
delle proteine del plasma e della tubocurarina (Fig. 3).
Questo risultato è in accordo con quanto era stato osservato con la elettroforesi incrociata che non rivelava la formazione di composti tra t ubocurarina e albumina (1 0 ) .
Bisogna tuttavia tenere presente che in questo caso, data la non assoluta specificità delle r eazioni, sarebbe necessario efl'ettuare questo studio
quantitativo con l'impiego di tubocurarina marcata, il che d'altra parte
può presentare ancora nuove difficoltà .
La formazione di un complesso stabile e facilmente separabìle su colonna Sephadcx, ed eventualmente capace di essere successivamente purificato e separato, è un caso abbastanza particolare che si verifica solo quando farmaco o proteina si combinano molto fortemente. Generalmente questo legame può essere molto debole così che non sarebbe facile riconoscere
in base alle considerazioni sopra espost e la formazione di molti composti.
Barlow e collaboratori ( 1') hanno proposto per questi casi come misura
quantitativa il valore dei K 0 . Impiegando la fenitoina e plasma essi ottentengono con tampone fosfato 0,1 M a pH 7,4 un massimo A corrispondente
alle prot eine e un massimo C corrispondente alla fenitoina caratterizzati rispet·
tivam ente dai valori di K 0 O e di K"D 1,38. Potrebbe in quest o caso sembrare che non vi sia alcuna intera zione tra proteine e farmaco. Tuttavia,
se si elui!lce la fenitoina con lo st esso t ampone contenente il 50 % di plasma, si ha uno spostamento della curva di eluizione e si può calcolarç per
questa frazione un K 0 intermedio tra i due precedenti che va attribuito
al composto formatosi. Pertanto questi Autori propongono che la misura
delle variazioni del valore di K 0 sia considerata come una misura, sia pure
non assoluta, della capacità che tali sostan ze hanno di legarsi con le proteine
o con composti ad alto peso molecolare. A conferma di ciò sta il fatto che
alcune sostanze, che notoriament e non si combinano con le pr oteine del
plasm a, non subiscono variazioni de1 valori di K 0 al variare della concentrazione delle proteine.
Le differenze di comportamento che si hanno tra farmaci e coloranti
sono dovute al fatto che con i secondi il legame è molto più forte e si r ag·
giungono valori di K 0 = O sia eluendo con tampone che con plasma.
Sotto questo profilo la gel filtrazione costituisce un not evole vantaggio
per lo studio delle combinazioni tra farmaco e substrato in vitro perchè
evita la presen:r.a di membran e ch e possono adsorbire i composti e quindi
Ann . I st . l'luper. Sanità (1966) 2. 2 11 ·223 .
220
SEMINARI DI CROMAT OGRAFlA
falsan· i risultati e perchè consente di dare una valida indicazione sulla
forza del legam e che si forma. La possibilità inoltre di usar~ il substr ato
come eluente offre un metodo pe r la separazione di sostanze ch e hanno
una capacità diversa di combinazione con il substrato stesso.
Tale via può p ertanto aprire numerose possibilità di studio dei legami
tra farmaci e recettori specifici ed aspecifici. L'unica limitazione è dovuta
alla sen sibilità dei metodi analitici per il ri conoscim t'nto d ei co mposti n egli cluati. diffi coltà ch e può essere sormontata, per evitare interfe renze,
con l'impiego di farmaci marcati. È possibil<' con questo sistema portare
un a note vole luce ad una serie di problemi le!Za ti al meccanismo d 'azione
d ei farmaci ed ai rapporti tra la stl'nttura st erica di t)uesti e la struttura dd
r ecettore pro• eico.
Oltre ch e p er lo studio dei complessi tra farmaci e proteine, l' impiego
d ella gel filtrazione pu ò essere prezioso p er studiare la formazione rli complessi diffi cili a mettersi in evidenza direttamente, come i complessi enzimasubstrato.
Ad esempio, Coleman e Yallee ('~) con l'impiego di taluni metallo-enzimi,
co me la Carhossipeptidasi A che contiene Zinco, ed usando 86Zn + + , hanno
ealcolato le costanti di equilibrio per substra t o ch e si idrolizzi lentamente, ed
hanno così messo in evidenza l'influenza d el substrato stesso n ella formazione
nell' enzima dall 'apoenzima in presenza di Zn ""-+ . Qu esto esempio sta a mostrar<.>
come la gel filtrazion e possa consentire di seguir e m olti aspetti d ella chimica
rl egli enzimi e d elle relazioni tra enzimi c suhstrato. Tale v ia sicurame nte
potrà a ncora trovare numerose applicazioni in campo enz1mologico .
Un altro esempio ci è dato dai lavori di Kakei e Glass (1 6 ) sull a possibilità di separ a re la Vitamina B 12 , il cui p eso molecolare è di 1300, da p olip eptidi che si trovano n el su cco gastrico e che hanno un peso superiore a
5000, con l 'impiego di Sephadex G-25 ch e consente di escludere sostanze a
p eso JUolecolarc superiore a 5000. Questo sistema ha consentito di studiare
la separazione della Vita mina B,t da sostanze presenti n el succo gastrico
e dal così detto •< fattore intrinseco "· Anch e dall'acqua di mare con questo
m etodo è stata separata la B 12 •
Attualmente un problema che inter essa la t ecni ca farma ceutica è di
stabilire se la vitamina B 12 è libera o legata n egli estratti e patici: tale via
potrebbe oftrirc uno spunto p er risolvere questo problema.
È inter essante ricordare che per le proprietà generali d ella gel filtrazione
le molecole appaiono n ell'effluente secondo un ordine ch e è strettamente
legato al decrescere d elle loro dimensioni m olecolari.
Tale proprietà fu proposta fin dal 1956 da Lathe e Ruthven (") come
m ezzo per studiare le dimen sioni delle macromolecole.
R ecentemente Andrews ha m esso a punto un m etodo ( 18) per la d et erminazione d el peso rnolecolare delle protein e basato appunto sull'impiego
A1111.
Jsl. Su]Jrt'. 8cmiltì (11166) 2, 211·22:1.
MARINI--BETTÒI.O·
221
d ella gel filtrazione . La tecnica è stata messa a punto impiegando proteine
a peso molecolare noto e facilmente dosabili quali alcuni enzimi proteici
come la ribossinucleasi.
L e esperienze condotte dall 'Andrews (18) stanno a dimostrare ch e è
possibile avere una funzione lineare tra volume d'eluizione Ve e peso molecole (PM) p er d eterminati tipi di destrani e precisamente per PM compresi tra 300 e 3500 p er iJ Sephadcx G-25 e per PM tra 5000 e 60000 per il
Sephadex G-100. Questi limiti possono raggiungere i valori di 110 e 300.000.
È interessante osservare che questo metodo richiede per una determinazione 10 (lg di proteina, se questa è dotata di attivi tà enzimatica, oppure 100 (lg se non l1a attività.
Un altro esempio della versatilità del m etodo della gel filtrazione n el
campo dello Rtudio degli enzimi ci è offerto da un recente studio di Stonehill
e Balis (11'), che dimostrano come sia possibile mt>ttere in evid enza minime
quantità di enzimi presenti non solo allo stato puro ma anche n ei t essuti.
Essi impiegano a questo scopo una colonna di gel destrano equilibrata con
una soluzione del substrato dell'enzima: ad esempio, volendo m ettere in
evidenza la xantin-ossidasi, si equilibra la colonna con una soluzione di
xantina, quindi si fa passare nella colonna stessa o l'enzima puro o un suo
estratto grezzo da un tessuto. In queste condizioni avviene la reazione tra
enzima e suhstrato e si forma il prodotto della r eazione (nel caso sop ra riportato l'acido uri co), che si ritroverà nell'effluente separato dalle proteine
d ell'estratto e c he potrà essere tra l'altro di!ltinto dal suhstrato (xantina)
impiegato ; comunque la quantità di prodotto formato sarà naturalmente
proporzionale alla quantità di enzima impiegato. Tale metodo consente
di rivelare quantità di enzimi molto piccole ed è stato a pplica to a scopo
diagnostico nelle cellule tumorali. Oltre che alla xantin-ossidasi il metodo
è stato con successo applicato alle fosfatasi, alla adenilosuccinasi e all'inositodeidrogenasi.
La gel filtrazione non è tuttavia limitata all' impiego di particelle di
gel disposte in una colonna per r ealizzare la separazione di proteine.
Nel 1963 sono apparsi diversi lavori che est endono alla t ecnica dello
strato sottile la gel filtrazione, che dopo i primi tentativ i di Determan (20 )
e di Johansson e Rymo (21) consentono la separazione di proteine di peso
molecolare fino a 2.000.000.
A questo scopo Fasella, Giartosio e Turano (22 ) hanno impiegato Sephadex G-100 e G-200 su lastre di vetro in strato di cir ca l mm mantenuto
in a mbiente chiuso ed impiegando come liquido di eluizione un ta mpone
fosfato 0,05 M a pH 7,4.
Si ottengono in questo modo delle separazioni molto efficaci. Le sostanze a peso molecolare più elevato come l'emocianina (PM 2.000 .000)
possiedono una velocità di migrazione più elevata della siero-albumina
Ann. l sl. Super. !:;md lft ( 19Co6) 2, 2 11 · 223 .
222
SEMINARI DI CROMATOGRAFIA
{PM 140.000) c della emoglobina, come era d'altra parte da attendersi in
perfetta analogia con i processi su colonna.
Morris (13}, ch e ha successivamente ripreso il probl!'ma, ha introdotto,
siccome l: impossibile riferirsi al fronte del solvente per la misura del valore
di migrazione, una sostanza di riferimento quale l'emoglobina l'd ha calcolato per var ie sostanze i valori dello !<postamento r elativo, chiamato RHb•
per il Sephadex G-1 00 c G-200. Questo metodo consente di rilevar e quantità
di proteine dell'ordine di l-20 fLg ed è anche molto utile per il riconoscimento rapido di macroglobuline, ad esempio nei sieri in casi di macroemoglobinemia.
Non vorrei t erminare questa mia esposizione sullt• applicazioni biochimiche della gel filtrazione senza ricordare alcune applicazioni che riguardano la immunochimica, disciplina che si sta evolvendo rapidamente e che
ha bisogno di nuove e rapide m etodologie per darci nuovi risultati.
J,a gel filtrazione si presta p~r le sue caratteristiche particolarmente
alla purificazioue c quindi alla caratterizzazione degli anticorpi ed al frazionamento di sieri immuni. Ad esempio Salvi ed Angeletti (1U 6) hanno
preparato un stero immune iniettando ad un cavallo del NGF (Nerve-GrowthFactor) : in questo siero, dopo la determinazione degli anticorpi, è possibile
procedere alla separazione delle varie frazioni .proteiche : ottimi risultati si
hanno con DEAE Sephadex.
L 'esame dell'eluato, mediante il metodo di Lowry, indica un r ecupero
del 95 % e mostra l'esistenza di varie frazioni che si possono riconoscere
rispettivamente come y-, ~-, oc.-globuline ed infine come siero-globuline.
L'associazione delle proprietà filtranti e scambiatrici consente in tal
modo una separazione molto più efficace di quanto non si poteva realizzare
con altri sist emi sia pure con la DEAE-cellulosa, in quanto rende possibile
la separazione di proteine tra loro vicine come peso molecolare.
Anche lo studio delle proteine attive sulla crescita del sist em a nervoso
(NGF) è risultato molto efficace con l'impiego d~lla gel filtrazione.
Con colonne di Sephadex G-200 si può m ettere in evidenza la complessità di quest e frazioni proteiche che contengono accanto a fattori di crescita
_a nche enzimi proteolitici. Tali sostanze possono essere nuovamente frazionate e purificate ripetendo l'operazione della gel filtrazione sul Sephadex G-200.
Per concludere si può dire che le t ecniche della gel filtrazione ampliano
notevolmente le possibilità di studio di sostanze molecolari complesse, consentono di studiare le reazioni di sostanze a basso peso molecolare tra di
loro ed in particolare con proteine, offrendo al chimico, al biologo ed al medico uno strumento prezioso per affrontare lo studio di taluni problemi
tuttora rimasti insoluti e aprendo nuove prospettive allo studio del meccanismo d'azione dei farmaci, ·allo studio degli enzimi e alla immunochimica.
Ann . /81 . Suptr. Sanità (1966) 2 , 211 ·223.
MARINl-BETTÒLO
223
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Aggiornamento sulle Tecniche Microanalitiche (•)
SECONDO CONVEGNO DEI MfCROA NALISTI
IsTITUTO SuPERIORE DI SANITÀ
28-29 maggio 1965
W. ScHoNIGER (Basilea) : Erfahrungen auf dem Gebiet der organischen Mik.roelem entaranalyse {28 maggio) .
S. CAIROLI (Casatenovo) : Sulla microdeterminazione dell'azoto in un laboratorio industriale (28 maggio).
A. CAMPIGLIO (Pavia) : Impiego del cromato di bario nella micr oanalisi
organica elementare (28 maggio).
E. PELLA (Milano) : Miglioramento del metodo per la determinazione diretta
dell'ossigeno m ediante introduzione di argo come gas portante. Comunicazione preliminare (28 maggio).
A. PIETROGRANDE (Padova) : Determinazioni di analisi quantitativa orga·
nica su scala decimilligrammica (28 maggio) .
M. MARZADRO (Roma) : R ecenti sviluppi della microdeterminazione degli
alogeni (28 maggio) .
(• ) Promosso dalla Società Italiana di Scie nze Farmaceutiche. Presieduto dalla Prof.ssa
M. Marzadro.
NP.i giorni 28 e 29 maggio 1965 ha avuto luogo a Roma, nell'Aula dei
Convegni dell'Istituto Superiore di Sanità, il secondo Convegno dei Microana·
listi promosso dalla Società Italiana di Scienze Farmaceutiche.
Il Prof. G. B. Marini-Bettòlo, Direttore dell'Istituto, ha dato il benvenuto
ai partecipanti, ricordando poi lo sviluppo della microanalisi in Italia e rile·
vando l'importanza dei micrometodi analitici specialmente nello studio delle
sostanze naturali e nelle sintesi in serie. Ha poi presentato il Dr. W. Schoniger,
chimico di fama internazionale, Capo del Reparto di Microanalisi del Laboratorio di Ricerche della Sandoz di Basilea.
È seguita la conferenza del Dr. W. Schoniger che ha porto il saluto della
Società dei Microanalisti Svizzeri e della Commissione p er LP. Tecniche Microa·
nalitiche della Unione Internazionale di Chimica Pura ed Applicata, ed ha
poi esposto i recenti progressi nella strumentaziorte, dai vari tipi di ultra·
micro bilance ai vari C-H-N-Analyzer.
Dopo la conferenza, sono iniziati i lavori del Convegno presieduto dalla
Prof.ssa M. Marzadro. Hanno partecipato al Convegno, oltre ai Capi dei Re·
parti di Microanalisi di vari Istituti Universitari e di Laboratori di Ricerche,
numerosi Soci della Società Italiana di Scienze Farmaceutiche.
Le comunicazioni riguardavano : le micro· ed ultramicro- determinazioni
dell'azoto, del carbonio e dell'idrogeno, degli alogeni e dei gruppi ossialchilici.
A l termine delle comunicazioni è seguita un'ampia discussione sui vari argo·
menti trattati, con animati interventi specialmente sull' uso dei vari apparec·
chi automatici per la determinazione del carbonio, dell'idrogeno e dell'azoto
e sulla convenienza dell'uso di detti apparecchi, con particolare considerazione
dell'eventuale risparmio di personale così come della spesa iniziale di esercizio
e di manutenziorte.
Ha chiuso i lavori il Prof. A. Soldi, Segretario Generale della Società fta·
tiana di Scienze Farmaceutiche, ringraziando il Prof. G. B. Marini-Bettòlo
per l'ospitalità ed i partecipanti al Convegno, ed in special modo il Dottor
W. Schoniger, per le loro comunicazioni e per essere intervenuti così numerosi.
Ha poi comunicato il gentile invito del Prof. Pratesi, vice Presidente della So·
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cietà Italiana di Scienze Farmaceutiche, di tenere il prossimo Convegno dei
Microanalisti nell'Istituto di Chimica Farmaceutica dell'Università di Pavia.
Il giorno 29 mattina i convenuti si sono recati presso il Reparto di Microanalisi dei Laboratori di Chimica dell'Istituto Superiore di Sanità dove sono
continuate le discussioni sui vari metodi microanalitici. Il Convegno ha avuto
termine con una visita al Museo e ai Laboratori di Chimica Biologica e Chimica Terapeutica dell'Istituto.
