Presentazione attività svolta

Stage PLS settembre 2014
Elisa Rocchelli
Sara Camorali
MONOSSIDO DI AZOTO REDUTTASI (NOR)
Le NOR sono proteine di membrana, che
hanno una notevole importanza in campo
clinico e farmaceutico, in quanto sono in grado
di disintossicare l’organismo dalla produzione
citotossica di NO.
Sito catalitico:
• gruppo eme
• His 347 (posizione assiale)
• FeB con 3 His
MECCANISMO D’AZIONE
Reazione compiuta dall’enzima:
Ciascuno dei due ferri coordina
una molecola di NO, le quali si
dispongono in posizione Trans,
facilitando l’iterazione tra i due N.
MODELLI SINTETICI BIOMIMETICI ISPIRATI AL SITO
DELLA NOR GIA’ PRESENTI IN LETTERATURA
(J.P.Collman et al.)
Eme sostituito in posizione meta,
diverso dalle sostituzioni fisiologiche.
(Karlin et al.)
Assenza dell’Istidina assiale
4
IL NOSTRO MODELLO SINTETICO
secondo atomo di Fe
coordinato a 3 azoti
 sostituzione sui pirroli
 gruppo eme
 coordinazione assiale con
un’Istidina
PRIMA PARTE MIMETICO: EMINA-GLICINA-ISTIDINA
PRIMA PARTE MIMETICO: EMINA-GLICINA-ISTIDINA
TITOLAZIONE pH-SPETTROFOTOMETRICA HMGH
Equilibrio analizzato:
L’HMGH coordina, in posizione assiale, una
molecola d’acqua che si deprotona aumentando il
pH. Questo è facilitato dalla presenza dell’Istidina in
posizione assiale.
120000
Condizioni sperimentali:
110000
• [HMGH] = 8 µM
• soluzione portata a pH 2.5
con HClO4 1 M
ε (cm-1 M-1)
• miscela MeOH : H2O = 8 : 2
100000
90000
80000
70000
• titolato con NaOH 0.1 M
60000
2
3
4
5
6
7
pH
8
9
10
11
12
SECONDA PARTE MIMETICO
COMPLESSO [Fe(1-BBH)]3+
Condizioni reazione:
• peso 173,4 mg di Fe(NH4)(SO4)2×12H2O da sciogliere in
acqua acida (H2O+HClO4)
• peso 100 mg di 1-BBH (legante) da sciogliere in MeOH
• unisco le due soluzioni e le lascio in agitazione per circa 30
minuti, successivamente aggiungo etere per favorire la
precipitazione, e poi filtro la soluzione ottenuta, tramite pompa
da vuoto, per ricavare il solido precipitato.
TITOLAZIONE pH-SPETTROFOTOMETRICA
HMGH + [Fe(1-BBH)]3+
La presenza del secondo atomo di Fe favorisce la
deprotonazione dell’acqua coordinata a pH inferiori.
HMGH
HMGH + [Fe(1-BBH)]3+
120000
110000
Condizioni sperimentali:
• [HMGH] = 8 µM
• [[Fe(1-BBH)]3+] = 40 µM
• soluzione portata a pH 2.5
con HClO4 1 M
• titolato con NaOH 0.1 M
ε (cm-1 M-1)
• miscela MeOH : H2O = 8 : 2
100000
90000
80000
70000
60000
50000
40000
2
3
4
5
6
7
8
pH
9
10
11
MIMETICO STRUTTURATO
(PRIMO STEP)
MIMETICO STRUTTURATO
(SECONDO STEP)
Un ringraziamento speciale a
Valentina, Eliana, ed Aurora, che ci
hanno guidato in questo progetto
nel migliore dei modi.