Stage PLS settembre 2014 Elisa Rocchelli Sara Camorali MONOSSIDO DI AZOTO REDUTTASI (NOR) Le NOR sono proteine di membrana, che hanno una notevole importanza in campo clinico e farmaceutico, in quanto sono in grado di disintossicare l’organismo dalla produzione citotossica di NO. Sito catalitico: • gruppo eme • His 347 (posizione assiale) • FeB con 3 His MECCANISMO D’AZIONE Reazione compiuta dall’enzima: Ciascuno dei due ferri coordina una molecola di NO, le quali si dispongono in posizione Trans, facilitando l’iterazione tra i due N. MODELLI SINTETICI BIOMIMETICI ISPIRATI AL SITO DELLA NOR GIA’ PRESENTI IN LETTERATURA (J.P.Collman et al.) Eme sostituito in posizione meta, diverso dalle sostituzioni fisiologiche. (Karlin et al.) Assenza dell’Istidina assiale 4 IL NOSTRO MODELLO SINTETICO secondo atomo di Fe coordinato a 3 azoti sostituzione sui pirroli gruppo eme coordinazione assiale con un’Istidina PRIMA PARTE MIMETICO: EMINA-GLICINA-ISTIDINA PRIMA PARTE MIMETICO: EMINA-GLICINA-ISTIDINA TITOLAZIONE pH-SPETTROFOTOMETRICA HMGH Equilibrio analizzato: L’HMGH coordina, in posizione assiale, una molecola d’acqua che si deprotona aumentando il pH. Questo è facilitato dalla presenza dell’Istidina in posizione assiale. 120000 Condizioni sperimentali: 110000 • [HMGH] = 8 µM • soluzione portata a pH 2.5 con HClO4 1 M ε (cm-1 M-1) • miscela MeOH : H2O = 8 : 2 100000 90000 80000 70000 • titolato con NaOH 0.1 M 60000 2 3 4 5 6 7 pH 8 9 10 11 12 SECONDA PARTE MIMETICO COMPLESSO [Fe(1-BBH)]3+ Condizioni reazione: • peso 173,4 mg di Fe(NH4)(SO4)2×12H2O da sciogliere in acqua acida (H2O+HClO4) • peso 100 mg di 1-BBH (legante) da sciogliere in MeOH • unisco le due soluzioni e le lascio in agitazione per circa 30 minuti, successivamente aggiungo etere per favorire la precipitazione, e poi filtro la soluzione ottenuta, tramite pompa da vuoto, per ricavare il solido precipitato. TITOLAZIONE pH-SPETTROFOTOMETRICA HMGH + [Fe(1-BBH)]3+ La presenza del secondo atomo di Fe favorisce la deprotonazione dell’acqua coordinata a pH inferiori. HMGH HMGH + [Fe(1-BBH)]3+ 120000 110000 Condizioni sperimentali: • [HMGH] = 8 µM • [[Fe(1-BBH)]3+] = 40 µM • soluzione portata a pH 2.5 con HClO4 1 M • titolato con NaOH 0.1 M ε (cm-1 M-1) • miscela MeOH : H2O = 8 : 2 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 2 3 4 5 6 7 8 pH 9 10 11 MIMETICO STRUTTURATO (PRIMO STEP) MIMETICO STRUTTURATO (SECONDO STEP) Un ringraziamento speciale a Valentina, Eliana, ed Aurora, che ci hanno guidato in questo progetto nel migliore dei modi.