Progetto e sviluppo di un prototipo per applicazioni della

Università degli Studi Roma Tre
Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
Corso di Laurea in Ottica e Optometria
Tesi di Laurea Triennale
Progetto e sviluppo di un prototipo per applicazioni della
Spettroscopia Raman all’oftalmologia: Sistema ottico di
puntamento.
Candidato:
Relatore:
Pio Alfonso Russo
Prof.ssa Maria Antonietta Ricci
Matricola 257182
Correlatore:
Dott.ssa Armida Sodo
Anno Accademico 2008-2009
Abstract
La degenerazione maculare senile (AMD da Age-related Macular Degeneration) è nel mondo occidentale la prima causa di cecità tra la popolazione con età superiore ai 60 anni. La
AMD viene spesso diagnosticata in modo casuale nel corso di comuni visite di controllo.
La zona retinica colpita è quella centrale, chiamata macula lutea dal colore giallo arancio dovuto alla presenza di pigmenti appartenenti alla famiglia dei carotenoidi, quali ad
esempio, la luteina e la zeaxantina. La mancanza di cure eﬃcaci che possano far regredire
o rallentare la patologia AMD, ha focalizzato l’interesse sulla possibilità di intervenire
preventivamente. Infatti è stato veriﬁcato che nelle persone aﬀette da questa patologia, la
concentrazione di carotenoidi nella macula è più bassa della media. A tale scopo si ritiene
necessario stimare la concentrazione dei due carotenoidi di interesse. Riuscire a quantiﬁcare e conoscere la distribuzione spaziale dei livelli di luteina e zeaxantina, in maniera
accurata e riproducibile, è fondamentale per capire il ruolo che svolgono i due carotenoidi
nel diminuire il fattore di rischio verso la patologia. L’interesse si è quindi spostato verso
tecniche ottiche specialistiche, che fornissero con un esame oggettivo dati riproducibili.
Una di queste è la spettroscopia Raman, che presenta indiscutibili vantaggi essendo non
distruttiva e ad alta risoluzione spaziale. Questa tesi ha come obiettivo il progetto e la
realizzazione di un nuovo sistema di puntamento con scansione ottica della zona maculare
da accoppiare a uno spettrometro Raman di nuova generazione. Lo scopo è di ricostruire una mappa della distribuzione e delle concentrazioni dei pigmenti e rendere le misure
riproducibili con un’adeguata tecnica di imaging. Nel corso di questo lavoro sono stati
sviluppati e realizzati i seguenti obiettivi: la rilevazione e l’acquisizione dell’immagine retinica con buon contrasto; l’implementazione di un software che gestisca il gruppo ottico di
scansione per eﬀettuare la misura della distribuzione dei pigmenti maculari; lo sviluppo di
un software graﬁco che interfacci lo strumento e l’operatore; un software di simulazione che
veriﬁchi l’idea della mappatura ripetuta n volte, come soluzione per migliorare il rapporto
S/N durante la misura per il calcolo della distribuzione dei pigmenti.
1
La teoria è quando si sa tutto e niente funziona.
La pratica è quando tutto funziona e nessuno sa il perché.
Noi abbiamo messo insieme la teoria e la pratica:
non c’è niente che funzioni... e nessuno sa il perché!
Albert Einstein
Indice
Introduzione
1
1 Maculopatie Degenerative
3
1.1
Forme degenerative . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
1.2
Ruolo dei Carotenoidi nell’AMD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
2 Metodologie di misura
10
2.1
Fotometria Flicker Eterocromatica (HFP) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.2
Autoﬂuorescenza (AF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.3
Spettroscopia Raman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
3 Progetto DODRAS
18
3.1
Descrizione generale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3.2
Sistema ottico di ingrandimento e illuminazione. . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.3
Sistema ottico di puntamento e raccolta. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.4
Graphical User Interface (GUI). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.5
Energia massima somministrata, tempo di stabilità e stabilità dell’immagine 30
3.6
Strategia software per migliorare il rapporto S/N. . . . . . . . . . . . . . . . 32
4 Appendice
37
4.1
Richiami di Anatomia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.2
Patogenesi AMD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.3
Sintomatologia e diagnosi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.4
Trattamenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Bibliograﬁa
46
i
Introduzione
La Degenerazione Maculare Senile (AMD)
La degenerazione maculare senile ( o AMD da Age-related Macular Degeneration) è nel
mondo occidentale la prima causa di cecità tra la popolazione con età superiore ai 60 anni.
La AMD viene diagnosticata spesso in modo casuale nel corso di comuni visite di controllo
in pazienti adulti, che accusano diminuzione visiva generica. La zona retinica colpita
è quella centrale, chiamata macula lutea dal colore giallo arancio dovuto alla presenza
di pigmenti appartenenti alla famiglia dei carotenoidi, quali ad esempio, la luteina e la
zeaxantina.
Alcuni di questi, presenti in natura nelle verdure a foglia larga di colore verde scuro e nella
frutta di colore principalmente giallo e arancione, sono stati messi in correlazione con la
patologia AMD. Infatti è stato veriﬁcato che nelle persone aﬀette da questa patologia, la
concentrazione di questi carotenoidi nella macula è più bassa della media. Inoltre è stata
riscontrata una correlazione tra una dieta povera di alimenti ricchi di luteina e zeaxantina
e la concentrazione di questi pigmenti a livello maculare.
La mancanza di cure eﬃcaci, che possano far regredire o rallentare la patologia AMD,
ha focalizzato l’interesse sulla possibilità di intervenire preventivamente agendo su modelli
di rischio. A tale scopo si ritiene necessario poter eﬀettuare la misura della concentrazione
dei due carotenoidi nella macula. Riuscire a quantiﬁcare e conoscere la distribuzione
spaziale dei livelli di luteina e zeaxantina, in maniera accurata e riproducibile, è fondamentale per capire il ruolo che svolgono i due carotenoidi nel diminuire il fattore di rischio
verso la patologia.
Uno dei più comuni metodi per la quantiﬁcazione dei pigmenti maculari è l’HFP (Heterochromatic Fliker Photometry). Questo è un test psicoﬁsico soggettivo che richiede una
buona acutezza visiva del soggetto e che è quindi poco utilizzabile per pazienti con avanzata patologia. L’HFP non considera errori dovuti alla presenza di aberrazioni cromatiche
1
2
oculari e alla risposta soggettiva del paziente nell’interpretazione degli stimoli luminosi.
Tutto ciò rende i risultati poco riproducibili. L’interesse si è quindi spostato verso tecniche
ottiche più specialistiche che fornissero con un esame oggettivo dati riproducibili. Queste
sono state individuate nella spettroscopia Raman[1] e nell’autoﬂuorescenza[2].
Verso la ﬁne degli anni ’90 Bernstein e Gellerman [1] [3] [4], hanno iniziato ad eﬀettuare
i primi studi sulla possibilità di impiegare la spettroscopia Raman per l’identiﬁcazione e
la quantiﬁcazione di questi carotenoidi. La spettroscopia Raman presenta indiscutibili
vantaggi essendo una tecnica non distruttiva e con alta risoluzione spaziale. Un prototipo
nato da questi studi è utilizzato in fase sperimentale presso un ospedale del nord Italia,
ma le misure che si ottengono presentano problemi di riproducibilità.
Dopo contatti tra l’Exall, una PMI del Lazio attiva nel campo dei prodotti medicofarmaceutici e il Gruppo Liquidi del Dipartimento di Fisica dell’Università degli Studi di
RomaTre è nata l’idea di sviluppare un progetto di innovazione tecnologica per sopperire
a questi inconvenienti.
Questa tesi ha come obiettivo il progetto di un nuovo sistema di puntamento con scansione ottica della zona maculare con lo scopo di ricostruire una mappa della distribuzione e
delle concentrazioni dei pigmenti e rendere le misure riproducibili con un’adeguata tecnica
di imaging.
Capitolo 1
Maculopatie Degenerative
1.1
Forme degenerative
Le degenerazioni maculari sono un gruppo eterogeneo di malattie, caratterizzate da una
progressiva degenerazione delle cellule della regione maculare retinica, zona che permette
la visione centrale distinta. Le patologie che colpiscono la macula portano inevitabilmente alla progressiva ed irreversibile perdita della visione. La causa più frequente della
degenerazione è dovuta alla Degenerazione Maculare Senile (più conosciuta come AMD
dall’inglese: Age-related Macular Degeneration), patologia che interessa principalmente
persone con età superiore ai 50 anni ed è la principale causa di cecità ‘legale’ (ovvero visus
inferiore a 1/10). Altre patologie non meno importanti della macula sono la degenerazione
maculare miopica, la maculopatia diabetica e le maculopatie eredofamiliari.
La degenerazione maculare senile può assumere due forme:
∙ Forma atroﬁca o secca
∙ Forma essudativa o umida
FORMA ATROFICA
I quadri clinici dell’AMD nella forma atroﬁca possono presentarsi sotto varie forme:
drusen, atroﬁa a carta geograﬁca o areolare. Le drusen o corpi colloidi sono formazioni
degenerative di forma rotondeggiante, giallastre, presenti soprattutto al polo posteriore.
Istologicamente si distinguono in drusen dure, piccole, a margini netti e drusen soﬃci a
margini non ben deﬁniti, che tendono a conﬂuire e a diventare più grandi (ﬁg.1.1).
3
1.1 Forme degenerative
4
Nel corso dell’indagine ﬂuorangiograﬁca le drusen presentano aspetti diﬀerenti: quelle
dure diventano iperﬂuorescenti nei primi angiogrammi mentre quelle soﬃci sono ipoﬂuorescenti. Nelle fasi tardive, le drusen dure perdono la loro iperﬂuorescenza mentre le
drusen soﬃci diventano iperﬂuorescenti in quanto si impregnano di colorante. Le drusen
possono rimanere invariate per anni senza alcun segno clinico, oppure evolvere verso la
forma atroﬁca o essudativa. La vista diminuisce soprattutto nella forma evoluta, ma
generalmente l’evoluzione è molto lenta.
Figura 1.1: AMD Atroﬁca.
Fluorangiograﬁa di un occhio destro: si notino la testa del nervo ottico con i principali
vasi (lato destro) e le evidenti drusen nella zona maculare, segno di patologia in atto.
FORMA ESSUDATIVA
Tale forma è caratterizzata da una neovascolarizzazione sottoretinica a partenza coroideale
associata o meno ad un distacco sieroso dell’epitelio pigmentato.
Queste lesioni tendono normalmente ad evolvere, compaiono essudati duri disposti a
corona attorno alla lesione e spesso sono presenti delle emorragie. Il processo di neovascolarizzazione forma una membrana costituita da piccoli vasi provenienti dalla coroide i
quali normalmente non dovrebbero essere presenti e sono caratterizzati da conformazioni
anomale. Con il passare del tempo la lesione tende a estendersi, i margini diventano
frastagliati, indistinti, si forma una cicatrice ﬁbrosa e inizia una distruzione in profondità
dei tessuti retinici (ﬁg.1.2).
1.1 Forme degenerative
5
Figura 1.2: AMD Essudativa.
Evoluzione di una neovascolarizzazione sottoretinica con formazione di essudati duri disposti a corona intorno alla zona maculare.
Formazione di una cicatrice ﬁbrosa con
distruzione dei tessuti retinici in profondità.
Nelle fasi iniziali la sintomatologia è rappresentata da metamorfopsie (visione distorta),
ben evidenziate con il test della griglia di Amsler (ﬁg.1.3) e/o da scotomi, comparsa di
macchie scure ﬁsse (ﬁg.1.4).
Figura 1.3: Visione della griglia di Amsler in condizione di normalità e di patologia.
Lo scopo del test è individuare la possibile metamorfopsia ovvero la deformazione, l’ondulazione, o distorsione di tutto ciò che è dritto. E’ il sintomo più tipico e precoce della
degenerazione maculare.
L’acuità visiva può essere in un primo tempo ancora buona. In seguito il visus tende
a diminuire progressivamente ﬁno ad arrivare, nelle fasi cicatriziali, a circa 1/10.
Per un approfondimento sull’anatomia dell’occhio e maggiori dettagli sulla AMD si
rimanda al capitolo in appendice.
1.2 Ruolo dei Carotenoidi nell’AMD
6
Figura 1.4: Metamorfopsie.
1.2
Ruolo dei Carotenoidi nell’AMD
La macula è una piccola zona circolare della retina del diametro di 5-6 mm, leggermente
decentra in zona nasale e spostata di pochi millimetri dall’asse ottico .
Figura 1.5: Sezione di occhio dx.
Il termine ormai in disuso, macula lutea, dal latino macchia gialla dovuto al suo colore giallastro, indica la presenza di vari pigmenti (luteina, zeoxantina ed al.). E’ la zona
1.2 Ruolo dei Carotenoidi nell’AMD
7
della visione ad alta risoluzione e a colori il cui centro, formato solo da coni, è chiamato
foveola. A circa 2mm da esso, i bastoncelli cominciano ad intercalarsi ai coni ed aumentano progressivamente il loro numero verso la periferia. A solo 5-6 mm dal centro, essi
sono divenuti venti volte più numerosi dei coni. Per avere un’idea della distribuzione dei
fotorecettori, basta pensare che in un occhio abbiamo circa 3 milioni di coni rispetto i 75
milioni dei bastoncelli.
A causa dell’invecchiamento, si ipotizza che le strutture dell’epitelio pigmentato retinico, della membrana di Bruch e della coriocapillare (superﬁcie più esterna della coroide
con alta vascolarizzazione costituita principalmente da capillari), perdano la loro eﬃcienza
metabolica, ﬁg.1.6.
Figura 1.6: Alcuni strati del fondo oculare.
Ciò è associato ad un aumento dei radicali liberi, fonte di danno ossidativo a livello
delle membrane e dei sistemi enzimatici. Sappiamo che una delle più importanti funzioni
dell’EPR (epitelio retinico pigmentato) è la fagocitosi dei dischi esterni, invecchiati, dei
fotorecettori con un ritmo di 5 segmenti al giorno. Questa operazione avviene nei lisosomi
citoplasmatici dell’EPR ed i prodotti di scarto sono eliminati attraverso il sistema di
vasi della coroide. Con l’invecchiamento o in particolari situazioni di danni ossidativi, la
fagocitosi perde la sua funzionalità portando alla formazione di depositi intra-lisosomiali
1.2 Ruolo dei Carotenoidi nell’AMD
8
e di un prodotto chiamato lipofuscina.
L’eﬀetto della lipofuscina su queste strutture è quello di inibire ulteriormente, con una
specie di eﬀetto valanga, la degradazione proteica lisosomiale [13], di aggiungere con la sua
formazione elementi fotoreattivi [14], produrre una varietà di specie reattive dell’ossigeno
ed altri radicali [15] ed indurre apoptosi (morte programmata cellulare) dell’EPR [16].
I carotenoidi sono alcuni dei principali costituenti del pigmento maculare. Grazie alla
loro particolare struttura molecolare, sono in grado di legare ed eliminare i radicali liberi
a livello delle membrane e dei sistemi enzimatici e di assorbire la luce blu dannosa per
l’occhio. Ricoprono quindi un ruolo importante nella protezione e ciò ne ha determinato
il grande interesse.
Sono molecole costituite da una lunga catena di doppi (C=C) legami coniugati di atomi
di carbonio (generalmente costituita da 35-40 atomi e deﬁnita catena polienica), spesso
terminante con un anello. I carotenoidi possono essere divisi in due classi: i caroteni
costituiti da molecole formate solo da idrogeno e carbonio e le xantoﬁlle in cui sono presenti
atomi di ossigeno. Appartengono a questa seconda classe pigmenti come la luteina e la
zeaxantina.
Figura 1.7: Formula di struttura della luteina e zeaxantina
Da analisi istologiche di sezioni retiniche, li troviamo distribuiti nell’EPR (epitelio
retinico pigmentato), ma la loro localizzazione principale è negli assoni dei fotorecettori, e
per un 25% nei segmenti esterni di questi[18] [19]. Inoltre la zeaxantina è prevalente nella
struttura dei coni mentre la luteina in quella dei bastoncelli con conseguente predominanza
di quest’ultima dalla zona perifoveale alla periferia oculare[19] [20] [21].
Il colore tipico di questi composti è una diretta conseguenza della struttura molecolare
1.2 Ruolo dei Carotenoidi nell’AMD
9
e spazia dal giallo pallido all’arancione ﬁno al rosso acceso. Le catene polimeriche che
li compongono sono infatti caratterizzate dalla presenza di doppi e singoli legami che
permette maggiore mobilità agli elettroni degli atomi interessati al legame. Il colore della
luce diﬀusa dipende dall’ampiezza delle vibrazioni dei legami intramolecolari e quindi dalla
particolare catena di legami carbonio.
Diversi studi suggeriscono che l’assunzione di luteina e zeaxantina, ed il supplemento di
vitamina E, svolgono un ruolo determinante nella prevenzione a protezione dalla patologia.
Sono state trovate molte correlazioni tra un regime dietetico carico di carotenoidi ed il
basso rischio di progressione dell’AMD.
In particolare lo studio epidemiologico JAMA di J.Seddon et al. [8], ha evidenziato una
riduzione del 57% del rischio nelle persone che hanno assunto almeno 6 mg di luteina al
giorno rispetto a quelle che ne hanno assunto meno di 1 mg al giorno.
Capitolo 2
Metodologie di misura della
concentrazione di carotenoidi nella
macula.
Data l’importanza di conoscere la quantità di carotenoidi presenti nella macula per la prevenzione dell’AMD, è importante essere in grado di misurare con accuratezza e ripetibilità
la loro concentrazione. Nel corso degli anni, sono stati sviluppati vari metodi tra cui quelli
psicoﬁsici e quelli spettroscopici.
Tra i metodi psicoﬁsici il più usato per la semplicità operativa è la fotometria ﬂicker
eterocromatica [22], mentre tra quelli spettroscopici, l’autoﬂuorescenza per immagini[6] e
la spettroscopia Raman [4] sono considerati i più promettenti.
2.1
Fotometria Flicker Eterocromatica (HFP)
E’ un metodo semplice e pratico che viene utilizzato per la misura della densità ottica
del pigmento maculare senza richiedere soﬁsticati sistemi ottici ed elettronici e può essere
utilizzato da operatori con diversa e modesta esperienza tecnica. Le misure possono essere
generalmente eﬀettuate su un solo occhio in quanto la densità del pigmento maculare è
molto simile in entrambi[28].
L’apparato utilizza un sistema a due lunghezze d’onda, una di stimolo a 460nm (blu)
maggiormente assorbita dai pigmenti maculari ed una di riferimento a 560nm (verde) non
assorbita.
10
2.1 Fotometria Flicker Eterocromatica (HFP)
11
Figura 2.1: Schematizzazione di occhio dx con asse visivo e ottico.
Il soggetto osservando uno spot di luce che rapidamente cambia alternando il colore
blu al colore verde, deve variare, dopo aver regolato il valore di background del verde,
l’intensità relativa al colore blu di test, ﬁno a far diminuire e/o eliminare la sensazione di
sfarfallamento tra i due colori.
Queste misure sono eﬀettuate stimolando, in tempi diﬀerenti, due zone retiniche. La
prima dove i pigmenti sono molto addensati, zona centrale foveale, con tipicamente 1∘ - 2∘
di ﬁssazione eccentrica (0,3-0,6 mm superﬁce retinica), e la seconda dove l’addensamento
è minore, zona bordo macula, con ﬁssazione eccentrica da 4∘ a 9∘ (1,2- 2,7 mm).
Il soggetto ﬁssa, per la zona foveale, una mira centrale che coincide con lo stimolo,
mentre per la zona perifoveale, ﬁssando sempre la mira centrale, lo stimolo è stato spostato
utilizzando anelli di luce di varie grandezze.
Lo stimolo è ottenuto nei sistemi più moderni con gruppi di led e con frequenza di
alternanza di 12-15 Hz per la zona foveale e 6-7 Hz per la zona parafoveale; questo perché,
quantitativamente, il pigmento maculare diminuisce verso la periferia della retina.
Dalle misure cosı̀ ottenute, viene calcolata la densità ottica di pigmento maculare con
buona approssimazione. La formula per il calcolo della densità ottica è data dal rapporto su
scala logaritmica della radianza della luce blu necessaria per minimizzare lo sfarfallamento
nella zona centrale(𝐵𝑓 𝑜𝑣 ) e quella necessaria nella zona perifoveale(𝐵𝑟𝑒𝑓 )[22].
2.2 Autoﬂuorescenza (AF)
12
𝑂𝑃 𝑇𝑑𝑒𝑛𝑠 = log
𝐵𝑓 𝑜𝑣
𝐵𝑟𝑒𝑓
Queste misurazioni sono aﬀette da gravi indeterminazioni dovute alla reazione soggettiva del paziente, allo stato di avanzamento della patologia maculopatica ed alle aberrazioni
cromatiche dell’occhio.
2.2
Autoﬂuorescenza (AF)
Questo metodo di indagine si basa sulle proprietà di ﬂuorescenza della lipofuscina, molecola polimerica normalmente presente nell’epitelio pigmentato retinico (RPE) risultato della
fagocitosi dei fotorecettori di scarto. La lipofuscina è originata dall’ossidazione di componenti cellulari che rendono le molecole non più degradabili dalle idrolasi lisosomiali e/o
dalle esocitosi ed è generalmente quasi del tutto espulsa attraverso il sistema venoso della
coroide. I residui, che nel corso degli anni si accumulano nell’RPE, si raggruppano in piccoli
granuli che assumono solitamente una colorazione marrone e contribuiscono all’insorgenza
della patologia.
Nella fovea il pigmento maculare presenta un assorbimento delle radiazioni luminose,
dovuto parzialmente ai carotenoidi, compreso tra 400-500 nm, con un massimo a 488 nm,
ﬁg.2.2.
Figura 2.2: Spettri di assorbimento e ﬂuorescenza di luteina e zeaxantina. Si noti il
massimo di ﬂuorescenza a 530 nm.
2.2 Autoﬂuorescenza (AF)
13
La lipofuscina presenta invece un assorbimento con massimi a 490 nm e 510 nm, quello
a 490 nm si sovrappone al picco di assorbimento dei pigmenti della macula. Stimolata con
queste due lunghezze d’onda la lipofuscina ﬂuoresce con due massimi a 590 nm e 630 nm.
Quindi utilizzando le proprietà dell’assorbimento e conseguente ﬂuorescenza di queste
molecole è possibile ottenere delle misure di densità ottica del pigmento maculare, calcolando il rapporto delle intensità tra i due valori dei picchi massimi di ﬂuorescenza della
lipofuscina.
Il sistema di misura è composto da un angiografo retinico modiﬁcato per supportare
un laser a ioni di argon le cui righe di emissione forniscono le due lunghezze d’onda di
eccitazione, 488 nm e 514 nm. Un ﬁltro ottico, interposto sull’asse ottico della CCD di
raccolta, taglia le radiazioni inferiori a 560 nm (ﬂuorescenza dei carotenoidi a 530 nm) [25]
[26], lasciando solo i due picchi di ﬂuorescenza della lipofuscina. Le immagini cosı̀ raccolte
per le due lunghezze d’onda di eccitazione, sono poi eleborate da un software che converte
la scala di grigi in valori di densità, dopo aver opportunamente corretto la risposta di
eﬃcienza della ﬂuorescenza, dovuta alla disomogeneità di distribuzione della lipofuscina
nella RPE.
Figura 2.3: Immagini ﬂuorangiograﬁche.
Nella ﬁg.A la ﬂuorescenza è ottenuta eccitando con la riga laser a 488 nm la lipofuscina. La
zona scura in corrispondenza della macula è il contributo dell’assorbimento dei carotenoidi.
Nella ﬁg.B la riga di eccitazione è la 514 nm, il contributo di assorbimento dei pigmenti
è nullo e la ﬂuorescenza della lipofuscina è maggiore (zona maculare più chiara).
La ﬁg.C è ottenuta dal rapporto tra le due immagini ed indica la densità ottica del pigmento
maculare.
Nella ﬁg.2.3A, notiamo, dopo aver eccitato con la riga laser a 488 nm, una ﬂuorescenza
minore nella zona maculare (macchia molto scura), dovuto al contributo di assorbimento
2.3 Spettroscopia Raman
14
del pigmento maculare, mentre per l’eccitazione con la riga 514 nm, dove l’assorbimento
del pigmento è nullo (ﬁg.2.3B), la ﬂuorescenza della lipofuscina è maggiore per cui la zona
maculare è più chiara[24] [27].
Utilizzando opportuni software, le due immagini vengono poi confrontate applicando
il rapporto fra singoli pixel al ﬁne di ottenere un’immagine e il proﬁlo della densità ottica
del pigmento maculare, ﬁg.2.4.
Figura 2.4: Elaborazione del proﬁlo della densità ottica dei pigmenti maculari calcolato
sull’immagine risultante dal rapporto tra l’immagine A e l’immagine B.
2.3
Spettroscopia Raman
Alla ﬁne degli anni venti (1928), il ﬁsico indiano C. V. Raman, osservando la diﬀusione
della luce (in particolare, un raggio di sole opportunamente focalizzato e ﬁltrato) da parte
di un volume d’acqua, notò accanto alla componente dovuta alla diﬀusione elastica la
presenza di un debole segnale a frequenza diversa da quella incidente.
Il fenomeno può essere cosı̀ riassunto: quando la materia viene irraggiata con luce
monocromatica di frequenza 𝜈0 , scelta in modo da non essere assorbita dal campione
stesso, essa passa attraverso l’intero sistema e una sua parte viene diﬀusa dalle molecole
in direzioni diverse da quella del raggio incidente. Da un’analisi spettroscopica risulta che
la maggior parte della radiazione diﬀusa mantiene la stessa frequenza della sorgente. Tale
fenomeno dà origine alla diﬀusione Rayleigh o elastica, la cui intensità è proporzionale
2.3 Spettroscopia Raman
15
alla quarta potenza della pulsazione 𝜔0 (𝜔0 = 2𝜋𝜔). Se si impiegasse della luce bianca
si avrebbe quindi diﬀusa più fortemente la parte blu dello spettro rispetto a quella rossa.
Questo spiega, ad esempio, il colore blu del cielo.
Raman scoprı̀ nell’osservare lo spettro della luce diﬀusa, che questo conteneva, oltre
alla luce elastica, anche una serie di righe aventi frequenze non contenute nel fascio incidente. Lo spostamento in frequenza di queste righe è indipendente dalla frequenza di
eccitazione 𝜔0 ed è caratteristico del campione in esame. L’importanza di studiare tale effetto, noto da allora come spettro Raman, concretizzata solo grazie all’avvento di sorgenti
ad elevata brillanza (principalmente laser), risiede essenzialmente nel fatto che ogni specie
chimica ha un suo caratteristico spettro Raman, che può essere usato per la sua identiﬁcazione. Tale tipo di spettroscopia infatti è in grado di rivelare la presenza di specie
molecolari senza perturbarne l’equilibrio chimico. Inoltre poiché l’intensità della riga è
legata alla concentrazione della specie chimica, è possibile svolgere un’analisi quantitativa oltre che qualitativa. Dall’analisi delle forme di riga è possibile risalire anche ai moti
molecolari che avvengono all’interno di un campione, permettendo cosı̀ una comprensione
più approfondita di tali fenomeni.
Durante l’interazione con una molecola, il fotone può essere diﬀuso elasticamente, cioè
senza cambiare la propria energia, dando origine alla riga Rayleigh. Tuttavia, esiste anche
una probabilità non nulla che la collisione sia anelastica. In quest’ultimo caso la molecola
è soggetta ad una transizione ad un livello rotovibrazionale di energia maggiore di quello
iniziale, con il risultato che il fotone perde energia ed è diﬀuso con frequenza minore (righe
Raman Stokes Δ𝜔 < 0).
Se la molecola si trova già in uno stato rotovibrazionale eccitato, l’interazione con il
fotone può causare una transizione ad un livello energetico minore, in questo caso il fotone
è diﬀuso con una frequenza maggiore (righe Raman anti-Stokes Δ𝜔 > 0). (ﬁg 2.5).
Queste righe sono disposte simmetricamente rispetto alla linea Rayleigh, e la diﬀerenza
in energia rispetto a quest’ultima corrisponde all’energia acquistata o ceduta dalla molecola
nel variare il livello vibrazionale iniziale. In più, poiché all’equilibrio la popolazione dei
livelli più alti è minore di quella dei livelli più bassi (diminuisce infatti esponenzialmente
Δ𝐸
con l’energia secondo il fattore di Boltzmann 𝑒− 𝐾𝑇 ) le righe Stokes risultano molto più
intense delle anti-Stokes e sono pertanto quelle generalmente utilizzate a ﬁni analitici.
In caso di composti ﬂuorescenti si può avere elevata interferenza nell’osservazione degli
spostamenti Stokes, quindi si usano le righe anti-stokes, sebbene meno intense.
Applicando questa spettroscopia ai pigmenti maculari, è possibile identiﬁcarne in modo
2.3 Spettroscopia Raman
16
Figura 2.5: Diﬀerenza di intensità tra la diﬀusione Rayleigh e le righe Raman Stokes e
Anti-Stokes.
univoco i vari tipi e le loro concentrazioni relative. Utilizzando una geometria a backscattering ed una lunghezza d’onda nell’intervallo di assorbimento della molecola, è possibile
misurare un segnale Raman più intenso, generato dai moti vibrazionali dei singoli e doppi
legami del carbonio che compongono la catena coniugata di struttura della molecola: si
parla in tal caso di eﬀetto Raman risonante. L’eﬀetto Raman risonante è particolarmente
utile per indagini su composti a bassa concentrazione.
Dalla letteratura ricaviamo gli spettri Raman dei carotenoidi di nostro interesse. I
graﬁci presentano coordinate in Raman-shift, ovvero spostamento in 𝑐𝑚−1 dalla riga dell’elastico, con dei picchi nei valori di 1159 𝑐𝑚−1 per il singolo legame C-C e 1524 𝑐𝑚−1
per il doppio legame C=C.
Le ﬁgure di seguito (ﬁg.2.6) illustrano gli spettri Raman della luteina e zeaxantina.
La ﬁgura B, mostra lo spettro corretto dal fondo di ﬂuorescenza, calcolata con un ﬁtting
polinomiale del 5∘ ordine [1], dovuta principalmente alla presenza di lipofuscina.
2.3 Spettroscopia Raman
17
CC
C=C
Figura 2.6: Spettri Raman.
La ﬁgura A, mostra lo spettro Raman della luteina immerso in un fondo di ﬂuorescenza.
La ﬁgura B, mostra lo stesso spettro corretto dal fondo di ﬂuorescenza. Sono messi in
evidenza i picchi nei valori di 1159 𝑐𝑚−1 per il singolo legame C-C e 1524 𝑐𝑚−1 per il
doppio legame C=C. In ascisse abbiamo la coordinata espressa in Raman-shift, ovvero
spostamento in 𝑐𝑚−1 dalla riga dell’elastico.
Capitolo 3
Progetto DODRAS
3.1
Descrizione generale
Verso la ﬁne degli anni ’90 Bernstein, Gellerman et al, hanno iniziato ad eﬀettuare i primi
studi sulla possibilità di impiegare la spettroscopia Raman per l’identiﬁcazione e della
luteina e zeaxantina e la stima della loro distribuzione nel fondo retinico. Nei loro più
recenti lavori hanno messo a confronto alcune tecniche di indagine, [1] [3] [4], e hanno
notato come la spettroscopia Raman rispondesse a criteri di non distruttività ed alta
risoluzione spaziale. Le misure sono state eﬀettuate in geometria di backscattering con
una sorgente laser 𝐴𝑟+ (riga a 488nm), che ha permesso di lavorare in condizione Raman
Risonante. Tutte le misure sono state realizzate focalizzando il laser su di uno spot di
1-2𝑚𝑚2 , inizialmente su campioni di pigmenti in vitro, pigmenti in occhi schematici, in
vivo su scimmie sedate e solo da poco su volontari umani.
La zona maculare è individuata attraverso una Fundus Camera, apparecchio utilizzato
per ottenere immagini del fondo retinico, mentre varie ottiche e beam splitter sono utilizzati per indirizzare il fascio laser di eccitazione e rilevare il segnale Raman da analizzare.
Un accoppiatore con ﬁbra ottica invia le radiazioni diﬀuse a un monocromatore che disperderà lo spettro di frequenze raccolto, inviando poi la zona di interesse a una CCD per
la conversione da fotoni a segnale elettrico. Quest’ultimo inviato ad un personal computer
sarà analizzato e presentato all’operatore (ﬁg.3.1).
La diagnostica dell’AMD attraverso la spettroscopia Raman richiede di conoscere oltre
la stima puntuale della quantità di carotenoidi, la loro distribuzione nella zona maculare.
La zona della macula indagata è attualmente di qualche 𝑚𝑚2 e le informazioni ottenute
riguardano la sola densità dei pigmenti per singolo spot. Per conoscere la distribuzio18
3.1 Descrizione generale
19
Figura 3.1: Presentazione di una misura Raman di carotenoidi sull’apparato utilizzato da
Bernstein e Gellermann.
ne spaziale, occorre compiere ulteriori puntamenti e misure su altre zone maculari con
inevitabili errori e sovrapposizioni di zone, dovuti al movimento oculare involontario.
Un prototipo progettato con queste caratteristiche di misura a singolo spot, è attualmente utilizzato in fase sperimentale presso una struttura ospedaliera del nord Italia.
I principali problemi riscontrati durante le misure sono stati il puntamento e la riproducibilità delle stesse.
Per la soluzione di queste problematiche e lo sviluppo di alcune sostanziali innovazioni
è nato un progetto di collaborazione tra l’Exall, una PMI del Lazio attiva nel campo dei
prodotti medico-farmaceutici e il Gruppo Liquidi del Dipartimento di Fisica dell’Università degli Studi di Roma Tre, con l’obiettivo di realizzare un nuovo prototipo che ovviasse
a questi inconvenienti con delle misure stabili e riproducibili.
Tra le soluzioni ipotizzate, con l’obiettivo di eﬀettuare la misura come una serie di più misure organizzate in una matrice di punti sull’area retinica e quindi rilevare la concentrazione
e la distribuzione dei pigmenti, quella più idonea risponde ai seguenti requisiti:
∙ focalizzazione del segnale laser eccitante su una superﬁcie di 100-300 𝜇𝑚2 ;
3.1 Descrizione generale
20
∙ direzionalità del segnale laser con un sistema di puntamento che guidi l’esplorazione
e la raccolta del segnale Raman attraverso una matrice di punti;
∙ ricostruzione della distribuzione spaziale del segnale con un software proprietario;
∙ costruzione di un particolare monocromatore che aumenti l’eﬃcenza del sistema.
Il progetto, denominato DODRAS (Double Ortogonal Dispersion Raman Acquisition
System), per la sua complessità, è stato suddiviso in tre sezioni:
1. Sistema di movimento e raccolta del segnale Raman (Testa di Misura):
dispositivo che interfaccia il paziente, la sorgente laser ed il monocromatore. Le
funzioni principali sono di focalizzare il sistema di illuminazione sulla zona retinica,
di acquisire l’immagine del fondo oculare per la rilevazione e puntamento nella zona
di interesse, di focalizzare e puntare il fascio laser di eccitazione e di raccogliere il
segnale Raman da inviare al monocromatore.
2. Monocromatore a doppia dispersione ortogonale:
il sistema consiste in un doppio monocromatore progettato con una conﬁgurazione
innovativa, tale da ottenere un rigetto della luce diﬀusa elasticamente dal campione,
e di acquisire su una CCD una ﬁnestra spettrale adeguata alla misura, senza bisogno
di eﬀettuare una scansione in frequenza.
3. Accoppiamento della Testa di misura e monocromatore:
Unione delle due sezioni del progetto e matching delle parti ottiche per ottenere
l’eﬃcienza massima.
Nel corso di questa tesi, ci siamo occupati di sviluppare e realizzare un prototipo
della Testa di Misura completo del software per la gestione dell’acquisizione dell’immagine
retinica e del puntamento del fascio laser.
Durante la fase di pianiﬁcazione, per il corretto sviluppo del progetto, abbiamo classiﬁcato in funzione delle priorità progettuali, una serie di obiettivi.
Qui di seguito, elencheremo tale percorso evidenziando le problematiche ed i risultati che
ci siamo preﬁssati:
1. Sistema ottico che permetta la visualizzazione con forte ingrandimento del fondo
retinico, per individuare la zona maculare di interesse per la misura.
3.2 Sistema ottico di ingrandimento e illuminazione.
21
2. Sistema di illuminazione del fondo retinico con sorgente esterna di luce.
3. Sistema ottico di focalizzazione e gruppo di specchi ortogonali motorizzati per il
movimento X-Y del fascio laser di eccitazione.
4. Sistema ottico e beam splitter per focalizzare il fascio di ritorno del segnale da inviare
al monocromatore.
5. Sistema di visualizzazione su CCD dell’immagine maculare per il puntamento da
parte dell’operatore.
6. Sviluppo di software per la gestione del gruppo specchi X-Y utilizzando piattaforme
Labview e MatLab.
7. Sviluppo di una GUI (Graphical User Interface) per la visualizzazione delle immagini
retiniche, inserimento delle coordinate di scansione del fascio laser e dati del paziente
trattato.
3.2
Sistema ottico di ingrandimento e illuminazione.
(sviluppo punti 1-2-5)
Il progetto ottico visibile in ﬁg.3.2 si basa sullo schema di principio di una Fundus
Camera, apparecchio nato per la fotograﬁa del fondo retinico. Lo scopo è di ottenere con
opportune ottiche, una visualizzazione del fondo retinico, con suﬃciente ingrandimento
da risolvere la zona maculare. Abbiamo quindi deﬁnito un schema ottico principale e
calcolato il valore delle lenti per ottenere i risultati richiesti.
Il sistema di illuminazione retinico, segue una conﬁgurazione classica in cui troviamo:
una lampada a incandescenza E, una lente condensatore 𝐿2 e un diaframma 𝐷1 , per la
produzione di un fascio di luce collimato.
Lo specchio SP direziona il fascio cosı̀ ottenuto, sull’asse principale A verso l’uscita
paziente. Come si nota dallo schema ottico, lo specchio si interpone tra la telecamera che
deve acquisire l’immagine retinica e l’occhio bloccando il percorso visivo. E’ stato quindi
necessario creare un passaggio ottico tramite un foro angolato del diamentro 2,5mm.
Continuando nella descrizione, in direzione dell’uscita paziente, troviamo la lente 𝐿1 ,
che deﬁniremo principale. E’ attraverso di essa che passano e vengono focalizzati tutti
i fasci di luce da e verso il fondo retinico: dall’illuminazione alla visualizzazione sulla
telecamera dell’immagine, al fascio laser di eccitazione e raccolta del segnale Raman dei
3.2 Sistema ottico di ingrandimento e illuminazione.
22
Figura 3.2: Schema ottico della Testa di Misura.
Nella parte superiore dello schema è visibile il laser di eccitazione che tramite la ﬁbra
ottica e l’accoppiatore ottico AC2 invia il fascio al sistema di puntamento motorizzato.
Scorrendo verso il basso, troviamo il monocromatore per l’analisi spettrale del segnale di
raccolta con la ﬁbra ottica. Il segnale arriva dal percorso: occhio, lente 𝐿1 , beam splitters
BS1 , BS2 , accoppiatore AC1 . Inﬁne troviamo sull’asse principale A, la telecamera per
la visualizzazione dell’immagine retinica, la lente di focalizzazione 𝐿3 , il diaframma 𝐷2
e lo specchio forato SP che invia il fascio d’illuminazione verso l’occhio. La sezione di
illuminazione proveniente dall’asse ottico secondario B, è formata dalla sorgente E, la
lente condensatore 𝐿2 ed il particolare diaframma 𝐷1 .
3.2 Sistema ottico di ingrandimento e illuminazione.
23
pigmenti. La scelta delle sue caratteristiche è stata cruciale in quanto, avendo bisogno di
una focale corta dovuta all’accoppiamento con il sistema ottico dell’occhio, la lente deve
assicurare poche aberrazioni ed un buon f-number, deﬁnito come il rapporto tra focale e
diametro della lente:
𝑓𝑛 =
𝑓
𝑑𝑖𝑎𝑚
Dai calcoli eﬀettuati la lente ottimale è risultata un doppietto acromatico del diametro di
50 mm e focale di 30 mm con trattamento antiriﬂesso.
Dal lato opposto dello specchio SP, troviamo il diaframma 𝐷2 e la lente 𝐿3 per la
focalizzazione dell’immagine retinica sulla telecamera a CCD. Dopo le prime acquisizioni,
è stato applicato un tubicino forato nello specchio SP, con trattamento antiriﬂesso nel
suo interno, per diaframmare ulteriormente il fascio di raccolta e ridurre alcune riﬂessioni
provenienti dall’illuminatore.
Il corretto illuminamento della retina è uno dei punti fondamentali per la realizzazione
di questa sezione e come ci aspettavamo ha presentato vari problemi dovuti principalmente
alle riﬂessioni corneali e al diametro pupillare estremamente ridotto (dimensione massima
circa 8 mm).
Figura 3.3: Immagine Occhio Test.
Sono visibili, oltre alla testa del nervo ottico, zona circolare chiara con i vasi principali
che fuoriescono, due riﬂessioni dovute alle superﬁci corneali interna ed esterna (nel nostro
caso lo spessore del vetro).
Le immagini sono state ottenute utilizzando un occhio schematico da laboratorio della HEINE, e ﬁn dalle prime acquisizioni, abbiamo riscontrato un grave disturbo dovuto
alle riﬂessioni delle superﬁci. Come è visibile dalla ﬁgura (ﬁg. 3.3) queste riducono la
3.2 Sistema ottico di ingrandimento e illuminazione.
24
qualità dell’immagine e creano un abbagliamento alla telecamera di puntamento. Siamo
intervenuti allora, con nuovi coating sulle lenti, variato i diametri dei diaframmi lungo il
percorso ottico, ma i risultati sono stati poco soddisfacenti.
Il problema ha trovato una buona soluzione solo quando abbiamo utilizzato una illuminazione a campo oscuro tipica dei microscopi. Per ottenere tale illuminazione, si pone
la lente condensatore della sorgente, il più vicino possibile al campione e si inserisce un
ostacolo circolare al centro di essa. Ciò permette di proiettare un toro di luce con raggi
molto divergenti che illumina il campione lateralmente rendendolo luminoso rispetto al
fondo che resta oscuro.
Utilizzando quest’idea, costruiamo il diaframma 𝐷1 , con uno foro del diametro di 15mm
ed un disco oscuro centrale di 8mm, in modo da proiettare sulla cornea un toro di luce
del diametro esterno di 5mm, zona di luce 1mm, zona oscura di 3mm, ciò ha permesso
di eliminare la riﬂessione della superﬁcie corneale. Nell’ottica di eliminare le riﬂessioni
spurie, anche lo specchio SP è stato modiﬁcato riducendo la sua zona di riﬂessione ad
un’ellisse minima di 12mm per 15mm.
L’immagine di ﬁg. 3.4 è un esempio dei risultati ottenuti sul nostro occhio di prova,
che dimostra l’eﬃcacia delle modiﬁche eﬀettuate.
Figura 3.4: Diminuzione delle riﬂessioni su Occhio Test.
L’eliminazione delle riﬂessioni ha permesso di vedere la zona maculare prima completamente abbagliata e migliorare il contrasto dell’immagine a vantaggio di un eﬃcace
puntamento.
In ultima analisi, abbiamo considerato la possibilità futura, di inserire un illuminatore
ad infrarossi che porterebbe a sostanziali beneﬁci: la possibilità di eliminare le riﬂessioni con un semplice ﬁltro ottico, la possibilità di lavorare con pupilla in miosi naturale, senza dilatazione indotta da farmaci, in quanto il paziente non sarebbe abbagliato
dall’illuminazione e la riduzione degli elementi ottici.
3.3 Sistema ottico di puntamento e raccolta.
25
Queste migliorie che sono in fase di realizzazione, aumenteranno l’eﬃcienza del sistema, con la sola controindicazione di una visione delle immagini retiniche in scala di grigi
dovuta alla lunghezza d’onda dell’infrarosso.
3.3
Sistema ottico di puntamento e raccolta.
(sviluppo punti 3-4-6)
Il sistema nasce dall’esigenza di dirigere il fascio laser in punti speciﬁci della retina per
eﬀettuare una scansione programmata. Il fascio di eccitazione giunge alla testa di misura
attraverso una ﬁbra ottica da 300 𝜇𝑚. L’accoppiatore ottico AC2 adatta la ﬁbra in modo
da ottenere un fascio in uscita parallelo e del diametro di 300 𝜇𝑚 da inviare agli specchi
del sistema X-Y. Questi ultimi lo direzionano, attraverso i beam splitters BS2 , BS1 e la
lente L1 all’uscita paziente. Il gruppo di scansione composto dal supporto per il montaggio
ortogonale dei motori e specchi è realizzato della Cambridge Technology (ﬁg.3.5).
Figura 3.5: Gruppo di scansione X-Y, sono visibili le motorizzazioni e gli specchi montati
ortogonalmente.
Il modello del progetto, MicroMax Dual Axis Servo Driver, usa come motorizzazione
due galvanometri (CT6215-HB) con specchi da 3mm montati ortogonalmente, questi assicurano un tempo di risposta di 175 𝜇sec su 40∘ di spostamento, un drift in temperatura di
3.3 Sistema ottico di puntamento e raccolta.
26
15 𝜇rad/∘ C. ed una linearità del 99,9%. Sono pilotati da una scheda elettronica di potenza
che permette con 1 mV di segnale in ingresso, di ottenere uno spostamento angolare di
2 ⋅ 10−3 gradi.
L’accoppiamento tra l’elettronica (analogica) e il PC (digitale) è realizzato da due
convertitori digitali/analogici (D/A) a 16 bits, uno per l’asse X e l’altro per quello Y,
organizzati su scheda PCI.
L’elettronica di pilotaggio dei galvanometri ha un fondo scala in ingresso di ±10𝑉 , per
cui con i 16 bits (65.536 step) del convertitore otteniamo una risoluzione di 300 𝜇V, che
permette un ipotetico spostamento angolare minimo di 0, 6⋅10−3 gradi. Il valore è superiore
alle speciﬁche richieste dal sistema di puntamento, in modo da tornare utile in caso di
cambiamento delle speciﬁche progettuali. La scheda utilizzata per questa conversione, la
PCI-6221 della National Instruments, oﬀre oltre ai convertitori, delle linee di input/output
programmabili, utili per la gestione di alcuni controlli dell’elettronica generale.
Per la programmazione, ci siamo avvalsi di due piattaforme software: LabView e MatLab. Sono stati sviluppati dei Virtual Instruments (VI), che interfacciati tra loro hanno
permesso una semplice gestione di blocchi funzionali.
La raccolta del segnale Raman avviene attraverso la lente principale L1 con un percorso
inverso a quello del segnale di eccitazione. Due beam splitters BS2 , BS1 deviano il fascio
di raccolta dall’asse principale traslandolo verso l’accoppiatore ottico AC1 .
La funzione di quest’ultimo è di adattare il fascio alla ﬁbra ottica per avere il massimo
trasferimento di segnale e poi attraverso la stessa di trasportarlo al monocromatore.
Il beam splitter BS1 è stato calcolato con un rapporto di trasmissione /riﬂessione uguale
a 30%/ 70% per riﬂettere maggiormente il segnale Raman, questa scelta penalizza inevitabilmente l’intensità del segnale dell’immagine retinica in telecamera.
La stessa considerazione di privilegiare il segnale Raman, è stata utilizzata per il
beam splitter BS2 . Poiché la sua posizione è opposta al BS1 è stato invertito il rapporto
trasmissione/riﬂessione ( 70%/30%).
La ﬁgura 3.6 illustra l’assemblaggio eﬀettuato in laboratorio di alcune delle sezioni del
progetto.
3.3 Sistema ottico di puntamento e raccolta.
27
Figura 3.6: Testa di Misura parzialmente assemblata sul banco ottico.
Sono visibili, nella parte alta, il sistema di puntamento X-Y illuminato da un laser HeNe
rosso e il gruppo di illuminazione del fondo retinico. Più in basso da sx, l’occhio di test,
la lente L1 , uno dei beam splitter, lo specchio SP e a seguire il diaframma, la lente di
focalizzazione L3 e la telecamera di acquisizione immagini.
3.4 Graphical User Interface (GUI).
28
Figura 3.7: giovasnni
3.4
Graphical User Interface (GUI).
(sviluppo punto 7)
Dopo aver ottenuto le immagini del fondo oculare e realizzato un sistema innovativo
di scansione, abbiamo sviluppato una Graphical User Interface (GUI) che visualizzando
le immagini del fondo oculare, potesse sovrapporre una matricie di puntamento su cui
dirigere il fascio laser per la scansione, [29].
La GUI denominata DODRAS, dal nome del progetto, sviluppata su piattaforma
MatLab, gestisce la calibrazione dello strumento e l’anagraﬁca del paziente includendo
i dati personali, l’anamnesi, la memorizzazione delle immagini retiniche con i parametri
di scansione e gli spettri Raman relativi.
3.4 Graphical User Interface (GUI).
29
Figura 3.8: Funzionalità di acquisizione della GUI.
Nell’immagine del fondo retinico ottenuta dall’occhio di misura, osserviamo la testa del
nervo ottico con il disegno dei vasi principali. La griglia in rosso è la matrice di puntamento che è stata programmata e su cui avverrà la scansione. Notiamo la sua sovrapposizione
ad una zona scura, che simula la macula.
3.5 Energia massima somministrata, tempo di stabilità e stabilità
dell’immagine
30
Nella schermata relativa all’impostazione dei parametri di misura, la GUI sovrappone sull’immagine retinica in run-time, una visualizzazione della matrice di puntamento
programmata. Il centro della sua posizione è scelto attraverso un cursore azionato dal
mouse del computer di gestione. Le coordinate di posizionamento sono evidenziate nei
campi posX e posY. Le dimensioni del’area di scansione (in millimetri) e gli elementi della
griglia, sono impostati dall’operatore nei relativi campi. Per semplicità è stata scelta una
matrice quadrata, per cui è suﬃciente un solo valore per ogni campo.
Le coordinate X,Y di ciascun punto, generate in automatico, sono a loro volta inviate
ai convertitori D/A del sistema di puntamento che sequenzialmente azionano il movimento
degli specchi per dirigere il fascio laser.
Nella ﬁgura riportata (ﬁg.3.8) è rappresentato uno screenshoot dell’applicativo sviluppato. Nell’immagine del fondo retinico, ottenuta dall’occhio di misura, osserviamo la testa
del nervo ottico con il disegno dei vasi principali.
La griglia in rosso è la matrice di puntamento programmata su cui avverrà la scansione.
Notiamo la sua sovrapposizione ad una zona scura ben evidenziata che simula la macula.
3.5
Energia massima somministrata, tempo di stabilità e
stabilità dell’immagine
Alla base delle soluzioni proposte per risolvere le problematiche in esame, oltre ad aver
utilizzato tecnologie ed idee sul software che oﬀrissero delle risposte innovative ed eﬃcienti,
vi sono delle considerazione di massima importanza scaturite dai seguenti parametri:
∙ Energia totale somministrata(𝐸𝑡𝑜𝑡 ): che indica l’energia totale che l’occhio sopporta
nell’arco temporale 𝑇𝑡𝑜𝑡 dell’intera seduta.
∙ Energia totale dei singoli raster (𝐸𝑚𝑖𝑠 ): che indica il quantitativo totale di energia
che l’occhio assorbe in una sola delle n ripetizioni del singolo raster, vale quindi la
relazione :
𝐸𝑡𝑜𝑡 = 𝑛 ∗ 𝐸𝑚𝑖𝑠
3.5 Energia massima somministrata, tempo di stabilità e stabilità
dell’immagine
31
𝑇𝑡𝑜𝑡 = 𝑛 ∗ 𝑇𝑚𝑖𝑠
dove 𝑇𝑚𝑖𝑠 è il tempo di esecuzione del singolo raster.
∙ Il puntamento e la stabilità dell’immagine: ovvero la capacità di stimolare con il
fascio laser la zona di retina importante ai ﬁni diagnostici della AMD ed il mantenimento di tale posizione per la durata della misura sono aspetti vincolanti. Sia il
puntamento che la stabilità sono fortemente legati alla rapidità della misura rispetto
la capacità del paziente di trovare e mantenere il punto di ﬁssazione. Dalla letteratura sappiamo che il tempo minimo di stabilità 𝑇𝑠𝑡𝑎𝑏 , oscilla tra 300 e 400 ms (tempo
minimo per la trasmissione del segnale saccadico) per cui vale il vincolo :
𝑇𝑚𝑖𝑠 ≤ 𝑇𝑠𝑡𝑎𝑏 = 400 msec
∙ Energia e Tempo del singolo raster: il tempo 𝑇𝑚𝑖𝑠 è dato dal tempo di acquisizione
𝑇𝑎𝑐𝑞 per il numero dei punti N*M della matrice considerata
𝑇𝑚𝑖𝑠 = 𝑇𝑎𝑐𝑞 ∗ 𝑁 ∗ 𝑀
e quindi l’energia associata a ciascun elemento della matrice 𝐸𝑎𝑐𝑞 è :
𝐸𝑎𝑐𝑞 =
𝐸𝑚𝑖𝑠
𝑁 ∗𝑀
Il quantitativo massimo di energia che l’occhio può sopportare nell’arco di tempo totale della misura è deﬁnito da enti come l’American National Standard Institute
(ANSI), che indicano un valore massimo prima del danneggiamento pari a 15,5
J/𝑐𝑚2 . Nella procedura che vogliamo implementare per eﬀettuare la misura del
segnale Raman su una matrice di punti, consideriamo ﬁssa la superﬁcie di irraggiamento al valore di 300 𝜇𝑚2 , per cui l’energia massima di acquisizione 𝐸𝑎𝑐𝑞 è circa
50𝜇𝐽. Risulta evidente che, più punti inseriamo nella matrice, minore dovrà essere
𝑇𝑎𝑐𝑞 per rispettare il valore di 𝑇𝑠𝑡𝑎𝑏 .
3.6 Strategia software per migliorare il rapporto S/N.
32
La riduzione del tempo di acquisizione 𝑇𝑎𝑐𝑞 ha come conseguenza un peggioramento
del rapporto segnale/rumore (S/N) sullo spettro Raman associato a ciascuna matrice
e non può esser spinto oltre il valore minimo 𝑇𝑚𝑖𝑛 al di sotto del quale il sistema non
risponde.
𝑇𝑚𝑖𝑛 < 𝑇𝑎𝑐𝑞 < 𝑇𝑠𝑡𝑎𝑏
𝑇𝑎𝑐𝑞 è quindi un parametro molto delicato, perché da una parte è strettamente legato
all’eﬃcenza di tutto il sistema di misura e dall’altra deﬁnisce, attraverso il vincolo
imposto da 𝐸𝑑𝑎𝑛 , la potenza del laser.
Attualmente non siamo in grado di deﬁnire il parametro minimo di 𝑇𝑚𝑖𝑠 , non essendo
il nostro progetto ultimato in tutte le sue parti, con conseguente impossibilità di fare
test quantitativi.
3.6
Strategia software per migliorare il rapporto S/N.
Un contributo al miglioramento del rapporto S/N, può essere ottenuto con una strategia
software [29], che calcoli una nuova matrice virtuale come media delle n misure raster
eﬀettuate. Ciascun elemento della matrice N x M, può essere pensato come il valore di
una misura Raman riferita al picco massimo di 1524 𝑐𝑚−1 della luteina (vedi ﬁg.2.6).
L’insieme di questi valori opportunamente convertiti in gradazioni di grigio, simulano la
distribuzione dei carotenoidi nella fovea. Poiché l’occhio ha dei movimenti involontari la
distribuzione può trovarsi posizionata in punti diversi all’interno del nostro raster.
L’identiﬁcazione di punti caratteristici e delle loro correlazioni, permette al software
di ottenere dei riferimenti univoci per la sovrapposizione delle n immagini della zona
esaminata. La scansione della matrice N x M sarà ripetuta un numero n di volte suﬃciente
per avere, una volta mediate, un buon rapporto S/N.
Al ﬁne di testare l’eﬃcacia della strategia in esame, abbiamo implementato un codice per
una simulazione al computer di una misura virtuale.
La strategia è quella di pensare la zona in esame come divisa in una matrice di 25 x
25 elementi che il dispositivo di scansione X-Y illumina sequenzialmente.
Vengono assegnate in modo random ad un sottoinsieme di elementi, delle gradazioni di
grigio che simulano una piccola distribuzione del segnale Raman di una misura ottimale
all’interno della matrice, (ﬁg.3.9). La rimanente zona più scura indica la mancanza di
3.6 Strategia software per migliorare il rapporto S/N.
33
Figura 3.9: Esempio di misura raster di una matrice 25x25 con una zona virtuale di segnale
ottimale. La zona scura rappresenta la mancanza di carotenoidi, mentre i pixel in toni di
grigio (matrice 3x3), rappresentano la distribuzione di carotenoidi ottenuta da un misura
Raman virtuale.
carotenoidi.
L’obiettivo della procedura è la ricostruzione dell’immagine vera attraverso una serie di n
determinazioni (raster) che hanno un rapporto S/N di bassa qualità.
La ﬁgura 3.10 rappresenta la collezione delle n=10 determinazioni (raster) con un
rapporto S/N di bassa qualità. Lo spostamento della distribuzione del segnale nella 3.10
simula lo spostamento dell’occhio del paziente. Si noti come la distribuzione dei toni di
grigio risulti cambiata, infatti i toni di grigio riﬂettono le ﬂuttuazioni casuali dell’intensità.
Il contorno rosso, individuato automaticamente dalla routine di analisi dati, indica il
perimetro della zona di interesse dove sono contenuti i carotenoidi. Questa è identiﬁcata
dal programma di analisi in base a una routine di riconoscimento di immagine. Le zone
di interesse sono poi sovrapposte l’una sull’altra con algoritmi che cercano la massima
corrispondenza tra i vari elementi dell’immagine.
La ﬁgura 3.11 mostra sulla sinistra l’immagine della misura ottimale iniziale mentre
sulla destra compare una sua ricostruzione ottenuta come media delle n zone di interesse
evidenziate in ﬁg 3.10, come si nota, la procedura ha individuato in modo univoco la
distribuzione spaziale dei picchi raman virtuali.
L’eﬀettiva raggiungibilità di tale optimum di condizioni è da veriﬁcare una volta che
l’assemblaggio del monocromatore sia in uno stato avanzato.
3.6 Strategia software per migliorare il rapporto S/N.
34
Figura 3.10: Mappe virtuali con n=10.
Insieme di 10 determinazioni (raster) con un rapporto S/N di bassa qualità. Il contorno
rosso, individuato automaticamente dalla routine di analisi dati, indica il perimetro della
zona di interesse dove sono contenuti i carotenoidi
3.6 Strategia software per migliorare il rapporto S/N.
35
Figura 3.11: Immagini a confronto. L’immagine di sinistra mostra la misura ottimale di
partenza, mentre quella di destra è la sua ricostruzione ottenuta come media delle n zone
di interesse con basso rapporto S/N.
Conclusioni
Nel corso di questa tesi sono stati sviluppati e realizzati tutti gli obiettivi preﬁssasti:
∙ rilevazione e acquisizione dell’immagine retinica con buon contrasto,
∙ implementazione di un software che gestisca il gruppo ottico di scansione per eﬀettuare la misura della distribuzione dei pigmenti maculari,
∙ sviluppo di una GUI che interfacci lo strumento all’operatore per una gestione
semplice,
∙ sviluppo di un software di simulazione che veriﬁchi l’idea della mappatura ripetuta n
volte, come soluzione per migliorare il rapporto S/N durante la misura per il calcolo
della distribuzione dei pigmenti.
Durante lo svolgimento di questo lavoro sono emerse delle considerazioni che portano
a deﬁnire dei vincoli progettuali di notevole importanza per il completamento del lavoro
e sono:
∙ Determinazione dell’energia massima per singolo punto della matrice 𝐸𝑎𝑐𝑞 , per determinare il valore massimo di potenza laser applicabile per singolo punto.
∙ Calcolo del tempo minimo di misura 𝑇𝑚𝑖𝑠 , limite oltre il quale lo strumento non è
più in grado di misurare.
Il successivo passo del progetto sarà di validare le parti realizzate con campioni in vivo
ed accoppiare il sistema di puntamento, realizzato nel corso della tesi, con il monocromatore per calcolare complessivamente, attraverso test quantitativi, l’eﬃcienza del sistema.
Come implementazione futura, si può realizzare l’illuminazione del fondo oculare con
una sorgente ad infrarosso per ottenere vantaggi, quali: midriasi spontanea, riﬂessioni
eliminate con ﬁltri ottici e riduzioni di parti ottiche per un abbattimento dei costi.
36
Capitolo 4
Appendice
4.1
Richiami di Anatomia
Questa piccola sezione di anatomia permetterà di conoscere quelle parti dell’occhio e della
retina interessati alla degenerazione maculare. L’occhio è un organo molto complesso,
composto di molte parti ed una buona visione dipende dal modo in cui queste funzionano
nel loro insieme (Fig.4.1).
Figura 4.1: Occhio in sezione.
Per la nostra patologia, ci soﬀermeremo ad una descrizione della zona maculare della
retina e della coroide.
37
4.1 Richiami di Anatomia
38
STRUTTURA DELLA RETINA
La retina è un tessuto sottile, luce-sensibile disposto nella zona posteriore dell’occhio. Il
suo funzionamento si può, in modo semplicistico, paragonare al sensore di una moderna
macchina fotograﬁca. La luce che compone l’immagine (fotoni) è focalizzata attraverso un
sistema di lenti (cornea e cristallino) su di essa, in modo da essere convertita attraverso i
fotorecettori (coni e bastoncelli) in un segnale elettrico da inviare attraverso il nervo ottico
ai centri del cervello deputati alla formazione e riconoscimento dell’immagine.
Nel suo percorso la luce attraversa i vari strati della retina in modo particolare, interessando per prima la ﬁbre nervose, le cellule multipolari e gangliari e poi i fotorecettori
coni e bastoncelli, per poi fermarsi sull’epitelio pigmentato ﬁg.4.2.
Figura 4.2: Sezione Retina.
Gli strati sono elencati a partire dalla superﬁcie più esterna, epitelio pigmentato retinico a quella più interna a contatto con il vitreo (sostanza gelatinosa, trasparente, indice
di rifrazione dell’acqua), che riempie la camera posteriore:
1. strato: epitelio pigmentato
2. strato: dei coni e dei bastoncelli
3. strato: membrana limitante esterna
4. strato: dei granuli esterni
4.1 Richiami di Anatomia
39
5. strato: plessiforme esterno
6. strato: dei granuli interni
7. strato: plessiforme interno
8. strato: delle cellule multipolari
9. strato: delle ﬁbre nervose
10. strato: membrana limitante interna
EPITELIO PIGMENTATO RETINICO.
Epitelio pigmentato della retina (EPR) è una struttura di origine neuroectodermica formata da un singolo strato di cellule pigmentate. Formano, insieme alla membrana di
Bruch, la barriera ematoretinica esterna localizzata tra la coriocapillare ed i fotorecettori
(ﬁg.4.2).
L’EPR svolge numerosi compiti, dalla protezione del danno ossidativo dei processi della visione, al funzionamento della pompa epiteliale necessaria agli scambi metabolici tra
retina e coriocapillare, alla sintesi dell’11 cis-retinale per il ciclo visivo, alla fagocitosi e
rigenerazione dei segmenti esterni dei fotorecettori ed alla secrezione di fattori di crescita
necessari all’integrità della coriocapillare e dei fotorecettori.
STRATO CONI E BASTONCELLI.
E’ lo strato dei fotorecettori, cellule altamente specializzate che prendono il nome dalla
forma del loro segmento esterno. Sono gli elementi recettoriali del sistema visivo deputati
alla trasduzione dell’energia luminosa in potenziali elettrici.
I coni, utilizzati per la visione a colori e poco intensa, sono di tre tipi e ognuno specializzato
nel rilevare le lunghezze d’onda di base di un colore. I bastoncelli invece, sono adatti alla
visione nottura per la loro alta sensibilità ed essendo di un unico tipo rilevano in bianco
e nero. La disposizione dei fotorecettori è a palizzata, perpendicolari alla membrana
limitante esterna, sulla quale sembrano come impiantati (ﬁg.4.2).
La distribuzione dei fotorecettori sulla retina non è omogenea, si notano nella zona
para-mediana gruppi di bastoncelli rigorosamente paralleli ed accostati gli uni agli altri
separati da un solo cono. Questa geometria e distribuzione si inverte verso il centro
dell’occhio.
4.1 Richiami di Anatomia
40
L’addensamento centrale è in prevalenza composto di coni e forma la zona maculare.
Il termine antico, macula lutea (dal latino macchia gialla) dovuto al suo colore giallastro
indica la presenza di vari pigmenti (luteina, zeoxantina ed al.). E’ la zona della visione
distinta il cui centro, formato da solo coni, è chiamato foveola. A circa 0,25 mm da esso,
i bastoncelli cominciano ad intercalarsi ai coni ed aumentano progressivamente il loro
numero nell’avanzare verso la periferia. A 5-6 mm, limite esterno della macula, essi sono
divenuti venti volte più numerosi dei coni.
Figura 4.3: Localizzazione macula e zone periferiche.
Nella zona più periferica della retina i fotorecettori sono solo bastoncelli, sono spaziati
e diminuiti come quantità, quasi zero verso l’ora serrata. Complessivamente i coni sono in
numero di 3 milioni mentre i bastoncelli circa 75 milioni.
STRATO CELLULE BIPOLARI E GANGLIARI.
Figura 4.4: Struttura degli strati cellulari
4.1 Richiami di Anatomia
41
Disposte in ﬁla e vicine l’una all’altra, le cellule gangliari (o multipolari) con i loro prolungamenti formano questo strato. In questo spessore si trovano il corpo e le espansioni
di parte degli astrociti ed i prolungamenti delle cellule di Muller.(ﬁg.4.4)
STRATO FIBRE NERVOSE
Inizia sottilissimo al limite anteriore della parte ottica della retina e, per aggiunta delle
ﬁbre nervose nate dalle cellule gangliari, si ingrossa gradualmente nella direzione della
papilla (testa del nervo ottico). Il suo spessore tipico arriva ad un massimo di 20 micron.
La direzione delle ﬁbre, in genere meridiana, si complica dal lato temporale. La presenza
della macula, le costringe a compiere archi concentrici intorno ad essa. I fasci di ﬁbre
che provengono dalle parti più periferiche della retina entrano dalla parte centrale della
papilla, mentre quelle delle zone più vicine entrano nella parte periferica. L’insieme di
queste ﬁbre forma il nervo ottico.
COROIDE
La coroide è lo strato formato da vasi sanguigni a contatto con l’epitelio pigmentato della
retina e la sclera. Il suo compito è di provvedere all’apporto di ossigeno, di nutrienti e
smaltimento delle sostanze di scarto (ﬁg.4.5). Parleremo più volte in questo lavoro della
‘coriocapillare’ riferendoci allo strato più interno della coroide. In essa sono contenuti
addensamenti di capillari ematici a contatto con lo strato esterno della membrana di
Bruch.
Figura 4.5: Sezione Coroide.
4.2 Patogenesi AMD
4.2
42
Patogenesi AMD
La patogenesi dell’AMD è multifattoriale, vi concorrono numerosi fattori: genetici, ambientali e demograﬁci che conferiscono al soggetto un aumentato rischio di sviluppare la
patologia. Le più recenti teorie eziologiche sostengono come cause dell’AMD: lo stress
ossidativo dell’epitelio pigmentato retinico (EPR) e della coriocapillare; uno stato inﬁammatorio della membrana di Bruch generato da un’alterata diﬀusione di nutrienti con
deposizione di matrice extracellulare in eccesso; un’accumulo di lipidi e inﬁltrati cellulari
[11], [12].
A causa dell’invecchiamento sistemico, si ipotizza che l’epitelio pigmentato retinico, la
membrana di Bruch, la coriocapillare perdano la loro eﬃcienza metabolica. Ciò è associato ad un aumentato stress ossidativo in quanto le specie reattive dell’ossigeno liberate
nel normale metabolismo, possono danneggiare le molecole costituenti delle cellule. Sappiamo che una delle più importanti funzioni dell’EPR è la fagocitosi dei dischi esterni
dei fotorecettori secondo un ritmo circadiano di 5 segmenti al giorno. Tale degradazione
avviene nei lisosomi citoplasmatici dell’EPR ed i prodotti terminali sono eliminati nella
coroide. Con l’invecchiamento o in particolari situazioni patologiche, si veriﬁca un deposito
intra-lisosomiale di lipofuscina come prodotto incompleto di degradazione.
I componenti della lipofuscina depositata possono: inibire la degradazione proteica lisosomiale [13], essere fotoreattivi [14], produrre una varietà di specie reattive dell’ossigeno ed
altri radicali [15], agire come detergenti ed indurre apoptosi (morte programmata cellulare)
dell’EPR [16]. Questo è uno dei motivi per cui le cellule dell’EPR contengono numerosi
antiossidanti enzimatici, tra cui la superossidodismutasi e la catalasi ed antiossidanti non
enzimatici, come luteina e zaexantina e beta-carotene.
Primo segno della patologia AMD sono le drusen, escrescenze focali subretiniche composte da un core di glicolipidi e glicoconiugati, da apolipoproteina E, vitronectina e proteine legate all’inﬁammazione. Sopra di queste, l’EPR è atroﬁco e depigmentato. Con
l’invecchiamento i lipidi che sono colesterolo, esteri del colesterolo e acidi grassi polinsaturi si accumulano nella membrana di Bruch e contribuiscono ad un ispessimento della
stessa. Essi sono soggetti ad un notevole stress ossidativo [17], in quanto a livello della
membrana di Bruch manca un adeguato sistema antiossidante intrinseco.
Questi composti possono legarsi al sistema di recettori scavenger, determinando un
legame con i macrofagi che porta a uno squilibrio della secrezione del fattore di crescita
endoteliale vascolare (VEGF). Il VEGF induce sia un incremento della permeabilità vasco-
4.3 Sintomatologia e diagnosi
43
lare (è 50.000 volte più potente dell’istamina) che uno stimolo alla neovascolarizzazione,
quindi stress ossidativi e ﬂogosi sono meccanismi chiave nella AMD.
L’esposizione all’ambiente esterno, alla luce e a fattori tossici, ma anche i processi ﬁsiologici, come il metabolismo e l’invecchiamento, innescano numerose reazioni ossidative a
livello della retina, con conseguente sintesi di radicali liberi. La lesività di questi composti
è correlata alla loro capacità di indurre un tipo di danno ossidativo a livello delle membrane e dei sistemi enzimatici cellulari. Per la formazione di radicali liberi occorrono due
principali elementi: una fonte di energia e l’ossigeno. Per quanto riguarda l’occhio, la via
più comune di danno ossidativo è quella fotochimica.
4.3
Sintomatologia e diagnosi
I sintomi principali dell’AMD sono la riduzione dell’acuità visiva centrale con permanenza di quella periferica, la distorsione delle immagini (metamorfopsie), l’alterazione della
percezione dei colori, la diminuita sensibilità al contrasto. La diminuzione della capacità
visiva può non essere marcata nelle fasi iniziali della patologia, soprattutto nella forma
non vascolare.
La diagnosi avviene attraverso due indagini fondamentali: l’esame biomicroscopico del
fondo oculare e lo studio per immagini della regione maculare.
L’esame biomicroscopico utilizza come strumento la lampada a fessura, un microscopio
orizzontale con max 60 ingrandimenti e focale lunga. Si interpongono lenti diagnostiche
ad elevato potere diottrico per permette di identiﬁcare le lesioni dell’AMD: drusen e alterazioni pigmentarie dell’RPE, sollevamenti ed atroﬁe dello stesso, edema maculare e i segni
legati alla presenza di neovasi (tessuto ﬁbrovascolare, emorragie, essudati lipidici) [7].
Lo studio per immagini della regione maculare avviene sostanzialmente attraverso
tre esami: la ﬂuorangiograﬁa retinica [9], l’angiograﬁa con verde d’indocianina [10] e la
tomograﬁa ottica a luce coerente [5].
Le prime due sono indagini angiograﬁche che usano il principio della ﬂuorescenza per
rappresentare lo stato vascolare della retina e della coriocapillare.
L’esame chiamato ﬂuorangiograﬁa utilizza la ﬂuoresceina, una sostanza ﬂuorescente
alla luce blu, come mezzo di contrasto. La ﬂuoresceina viene assorbita dalla membrana
neovascolare e rende più visibile. Sul reperto ﬂuorangiograﬁco la neovascolarizzazione
può apparire ben delineata e chiaramente localizzabile per cui siamo in presenza di una
neovascolarizzazione classica, oppure apparire mal deﬁnita e solo sospettabile da cui neo-
4.3 Sintomatologia e diagnosi
44
Figura 4.6: Immagine angiograﬁca, si noti la patologia dell’AMD in atto.
vascolarizzazione occulta. In caso di neovascolarizzazione occulta può essere utile eseguire
un secondo esame angiograﬁco che utilizza un colorante ﬂuorescente allinfrarosso, il verde
d’indocianina, in grado di dare un’immagine più deﬁnita di questi neovasi.
L’OCT apparato di imaging di ultima generazione, utilizza il fenomeno dell’interferenza con luce a bassa coerenza ottica. Questo strumento consente di ottenere immagini
delle strutture retiniche a sezione trasversale e alta risoluzione, solo alcuni micron. E’ una
metodica particolarmente utile per valutare lo spessore retinico, la presenza di edema e le
sue caratteristiche, distacchi dell’RPE e della neuroretina, ed alterazioni dell’interfaccia
vitreoretinica.
Figura 4.7: Immagine trasversale di una retina ottenuta con OCT. Si noti il distacco con
formazione di una camera di essudati sottoretinici in zona maculare.
4.4 Trattamenti
4.4
45
Trattamenti
TERAPIA FOTODINAMICA
La terapia fotodinamica è una tecnica minimamente invasiva che viene eseguita in ambito
ambulatoriale. Impiega una sostanza fotosensibile, la Verteporﬁna, la cui caratteristica
importante è la selettività per i neovasi della coroide che le consente di agire sulla lesione
neovascolare senza danneggiare la neuroretina sovrastante.
La terapia fotodinamica prevede una procedura in due fasi. Nella prima avviene l’infusione del farmaco per via endovenosa tramite una pompa a cilclo lento, aﬃnché il farmaco
si accumuli selettivamente a livello della lesione sottoretinica. La seconda fase prevede
l’applicazione sull’area della lesione di una luce laser di lunghezza d’onda di 690 nm per
attivare il farmaco. L’attivazione induce la formazione per ossidazione di radicali liberi che
danneggiano l’endotelio dei neovasi producendo aggregazione piastrinica e formazione di
trombi. Questi ultimi a loro volta occludono i vasi patologici della membrana neovascolare
portandoli alla necrosi.
TERAPIE con INIEZIONE INTRAOCULARE
Negli ultimi anni sono state sviluppate nuove terapie basate sul principio di prevenire la
causa della lesione vascolare. Si interviene tentando di bloccare lo squilibrio del fattore
di crescita endoteliale vascolare (VEGF), una proteina che aumenta la permeabilità dei
vasi con fuoriuscita di liquido dagli stessi. La procedura è usualmente indolore e prevede
l’iniezione di un farmaco nel vitreo, la sostanza gelatinosa che riempie la camera posteriore
dell’occhio. L’iniezione viene praticata in regime di day hospital, con una anestesia di tipo
locale, cioè si instillano alcune gocce di collirio anestetico. L’iniezione può essere ripetuta
a seconda delle necessità ogni quattro-sei settimane e frequentemente viene ripetuta nel
tempo.
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