Cap. 8 Biomarker mitili

Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
Capitolo 8 – BIOTA: BIOMARKERS nei Mytilus galloprovincialis
8.1 Campionamento degli organismi e metodiche utilizzate
I campionamenti di cantiere nell’area del Terminale, per lo studio dei biomarkers nei Mytilus
galloprovincialis, sono stati effettuati a Dicembre 2008.
Gli organismi sono stati prelevati da una mitilicoltura di Portonovo (Ancona) e in parte
immediatamente traslocati nella stessa area (TC041), utilizzata come sito di riferimento per valutare
l’effetto della procedura di traslocazione. Entro le 24 h, gli organismi sono stati traslocati in due siti
posti nell’area del Terminale. Le due stazioni di campionamento erano state inizialmente previste in
prossimità del Terminale, a tale scopo durante le attività di monitoraggio nella fase di bianco erano
state ubicate strutture di biomonitoraggio contenenti i mitili trapiantati (Mytilus galloprovincialis); a causa
tuttavia della intensa attività di pesca a strascico che abitualmente si svolge nella zona sono state
successivamente sistemate in una posizione più protetta, in corrispondenza dell’impianto di
mitilicoltura “VISMA”. Le due stazioni di campionamento (TC039, TC040) sono state mantenute nel
medesimo impianto di mitilicoltura anche per la fase di cantiere. Il recupero degli organismi in tutte le
stazioni è stato effettuato dopo circa 4 settimane.
La posizione delle stazioni con il dettaglio delle coordinate geografiche è riportata nel Capitolo 3 par.
3.2.
Al termine dei periodi di traslocazione, i mitili (5.5 ± 0.5 cm) sono stati portati in laboratorio e
mantenuti per 12h in acquario a 18°C. Per ogni punto di campionamento, le ghiandole digestive di 30
organismi sono state dissezionate e suddivise in 10 pool, congelate in azoto liquido e mantenute a 80°C fino al momento delle analisi. Per la valutazione dell’attività dell’acetilcolinesterasi, della stabilità
lisosomiale e del danno genotossico, è stata prelevata un’aliquota di emolinfa dal muscolo adduttore di
5 organismi per ogni punto di campionamento.
Per quantificare i livelli di metallotioneine, i campioni di ghiandola digestiva sono stati omogenati (1:3
p/v) in tampone Tris-HCl 20 mM pH 8.6 con saccarosio 0.5 M, leupeptina 0.006 mM,
fenilmetilsolfonilfluoruro (PMSF) 0.5 mM, β-mercaptoetanolo 0.01%. Dopo centrifugazione a 30.000
xg per 45 minuti a 4°C, la purificazione delle metallotioneine è stata effettuata attraverso una serie di
precipitazioni etanoliche. Il pellet ottenuto da questi procedimenti e contenente le metallotioneine, è
stato asciugato sotto flusso d’azoto, risospeso nuovamente in una soluzione di NaCl 0.25 M e HCl 1 N,
contenente EDTA 4 mM per eliminare i cationi metallici legati alle metallotioneine. Alla soluzione così
ottenuta è stato aggiunto tampone Na-fosfato 200 mM pH 8, NaCl 2 M e DTNB 0.43 mM ed il
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campione ulteriormente centrifugato a 3.000 xg per 5 minuti a 4°C. La concentrazione delle
metallotioneine è stata valutata in rapporto ai gruppi –SH determinati spettrofotometricamente a λ =
412 nm mediante reazione con l’acido 5,5’-ditio-bis-2-nitrobenzoico (DTNB). La quantificazione è stata
effettuata attraverso una retta standard di calibrazione, con concentrazioni note di glutatione ridotto
(GSH) (50-500μM) (Viarengo et al., 1997).
La proliferazione perossisomiale, è stata misurata per via spettrofotometrica attraverso l’attività
enzimatica della acil-CoA ossidasi (AOX). Il campione è stato omogenato in un tampone contenente
NaHCO3 (1 mM, pH 7.6), EDTA 1 mM, etanolo 0.1%, Triton X-100 0.01%; l’analisi
spettrofotometrica ha previsto l’incubazione del campione con un working buffer contenente tampone
K-fosfato (10 mM pH 7.4), diclorofluoresceina-diacetato (DCF-DA) (2.2 mM), perossidasi esogena (1.2
U/ml), sodio azide (40 µM), Triton X-100 (0.02%) al buio, a 25°C per 5 minuti. La reazione è stata fatta
iniziare aggiungendo come substrato il palmitoil CoA (30 µM), ed è stata seguita per tre minuti alla
temperatura di 25°C (Small et al. 1985).
L’attività dell’acetilcolinesterasi è stata determinata sull’emolinfa degli organismi centrifugata per 10
minuti a 10.000 xg. L’attività dell’acetilcolinesterasi è stata misurata secondo il metodo di Ellman (1961)
usando come substrato l’acetilcolina iodide, che viene convertita dall’enzima in tiocolina. Questa
reagisce con l’acido 5,5’-ditio-bis-2-nitrobenzoico (DTNB), che dà origine ad un anione giallo che viene
quantificato alla lunghezza d’onda di 412 nm (ε = 13.6 mM-1cm-1).
La stabilità lisosomiale è stata misurata negli emociti prelevando l’emolinfa dal muscolo adduttore
posteriore di cinque organismi per sito di campionamento. Una soluzione stock di Rosso Neutro è stata
preparata dissolvendo 28.8 mg di colorante in 1 ml di dimetilsulfossido (DMSO) e conservata a 4°C per
non più di 3 settimane. Al momento dell’analisi 10 µl di soluzione stock sono stati diluiti in 5 ml di
soluzione fisiologica. Le cellule sono quindi state incubate con il colorante e, mediante valutazione
microscopica, è stato calcolato il tempo al quale il 50% degli emociti presenta il Rosso Neutro non più
compartimentalizzato nei lisosomi ma rilasciato nel citosol (Lowe et al., 1995).
La comparsa di danni genotossici è stata valutata attraverso il test della cometa e la frequenza di
micronuclei (Gorbi et al., 2008, Venier et al., 1997). Il test della cometa misura la perdita di integrità
strutturale del DNA e permette una stima delle rotture a carico dei legami zucchero-fosfato nella
doppia elica del DNA (strand breaks). Il saggio della cometa è stato eseguito sugli emociti prelevati dal
muscolo adduttore posteriore e per ogni sito sono stati analizzati 5 individui in replicato.
Immediatamente dopo il prelievo gli emociti sono stati lavati in un buffer salino (500 mM NaCl, 120
mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM EDTA) con brevi centrifugate successive e portati alla
concentrazione di 40 x 104 cellule x ml -1. Prima di essere imbibite su gel d’agarosio a basso punto di
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fusione, le cellule sono state preservate in ghiaccio al riparo dalla luce. Tre strati successivi di gel
d’agarosio a basso punto di fusione sono aggiunti su vetrini da microscopia pre-allestiti con un film di
gel d’agarosio a punto di fusione normale (di supporto). Ogni strato, compreso quello centrale con le
cellule, è stato fatto aderire al vetrino porta-oggetto e reso di spessore omogeneo coprendolo con un
vetrino copri-oggetto, alla temperatura di circa 37°C. Lasciato raffreddare per diversi minuti, il vetrino
copri-oggetto è stato rimosso delicatamente e l’operazione ripetuta fino a quando tutti gli strati sono
risultati pronti. Una volta preparati, i vetrini sono stati riposti per 90 minuti in una soluzione di lisi (2.5
M NaCl; 100 mM EDTA; 10 mM Trizma-base; 1% Triton X-100 e 10% DMSO), in modo da
disgregare tutte le membrane cellulari e disperdere i contenuti citoplasmatici nel gel. Dopo la lisi
cellulare i vetrini sono stati immersi in un buffer alcalino (75 mM NaOH; 10 mM EDTA a pH > 12.5)
per 10 minuti, per favorire la denaturazione del DNA che induce una riduzione del grado di
superavvolgimento del DNA, in maniera proporzionale al numero delle rotture dell’asse fosfodiesterico
della molecola. Gli strand breaks sono stati messi in evidenza lasciando migrare il DNA, per ulteriori 10
minuti con una elettroforesi a 1 Vcm-1 sempre nello stesso buffer. Dopo un lavaggio di 5 minuti in
buffer di neutralizzazione (400 mM TRIS, pH 7.5) e colorazione con DAPI (colorante fluorescente
specifico per il DNA) i vetrini sono stati analizzati al microscopio. In presenza di un DNA poco
degradato i nuclei appaiono dall’aspetto circolare, mentre nel caso contrario dopo la corsa
elettroforetica i nuclei presentano una forma simile a quella di una cometa. Durante le campagne di
bianco le quantificazione della perdita di integrità strutturale del DNA è stata effettuata attraverso una
conta delle comete e loro attribuzione ad una di cinque possibili classi di danno, sulla base della
grandezza delle teste e della lunghezza delle comete (Danno Totale). Nella campagna di cantiere la
quantificazione è stata effettuata attraverso un software d’analisi di immagine CometScore 1.5 (TriTek
corp) che fornisce il valore di % DNA nella coda. Per poter confrontare i risultati ottenuti tra bianco e
cantiere, i valori ottenuti con il Danno Totale sono stati trasformati in valori di % di DNA nella coda
attraverso un’opportuna retta di conversione.
Oltre agli strand breaks che si formano anche in condizioni fisiologiche e possono essere compensati da
sistemi enzimatici di riparo del DNA, gli effetti genotossici sono stati analizzati come comparsa di
micronuclei (MN), che riflettono l’alterazione dell’equilibrio fra processi di rottura e riparo, a favore dei
primi, con un accumulo delle rotture nel DNA. In queste circostanze, si possono avere conseguenze
rilevanti per processi essenziali del ciclo cellulare, come la corretta segregazione del materiale genetico
durante la mitosi, e la comparsa di micronuclei (MN), cioè di piccoli frammenti di cromatina
fisicamente separati dal nucleo principale. La frequenza dei MN è stata determinata sugli emociti
aspirati dal muscolo adduttore posteriore e dilavati in un buffer salino (500 mM NaCl, 120 mM KCl, 20
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mM HEPES, 10 mM EDTA) con brevi centrifugate. Di seguito le cellule sono state trattate con
fissativo di Carnoy (miscela 3:1 metanolo ed acido acetico) e sottoposte ulteriormente a brevi
centrifughe, e cambi di fissativo, prima di allestire degli strisci su vetrino. Dopo colorazione dei
preparati con 4',6-Diamidino-2-fenilindolo cloridrato (DAPI) (100 ngml-1), i vetrini sono stati
esaminati al microscopio in fluorescenza per determinare la percentuale delle cellule contenenti MN.
Per ciascun campione sono state contate almeno 2.000 cellule, considerando MN tutte quelle porzioni
di cromatina fortemente DAPI positive in discontinuità fisica con il nucleo centrale.
I sistemi enzimatici antiossidanti sono stati misurati in campioni di ghiandola digestiva omogenati (1:5
p/v) in tampone K-fosfato 100 mM, pH 7.5, con cloruro di sodio 2.5%, fenilmetilsolfonilfluoruro
(PMSF) 0.1 mM ed i seguenti inibitori di proteasi: aprotinina 0.008 TIU/ml, leupeptina 1 µg/ml,
pepstatina 0.5 µg/ml e bacitracina 0.1 mg/ml. Dopo centrifugazione a 100.000 xg per 1h e 10 min a
4°C, la frazione citosolica è stata aliquotata e conservata a -80ºC. Le attività enzimatiche sono state
misurate con specifici saggi spettrofotometrici utilizzando uno strumento Varian (modello Cary 5)
termostatato a temperatura costante di 18±1 °C. Tutte le metodiche sono riportate in Regoli et al.,
2004.
L’attività della catalasi è stata misurata seguendo la diminuzione di assorbanza (rilevata a λ = 240 nm;
ε = -0.04 mM-1cm-1) dovuta alla decomposizione del perossido di idrogeno. Il saggio è stato condotto
per un minuto in un volume finale di 1 ml contenente tampone K-fosfato 100 mM a pH 7.0, con H2O2
12 mM e aliquote opportune di campione.
La famiglia enzimatica delle glutatione S-transferasi (GST) è stata analizzata seguendo l’aumento di
assorbanza dovuto alla formazione del complesso di coniugazione tra GSH e 1-cloro-2,4dinitrobenzene (CDNB), a λ = 340 nm (ε = 9.6 mM-1cm-1). La reazione è stata seguita per un minuto in
un volume finale di 1 ml contenente tampone K-fosfato 100 mM pH 6.5, CDNB 1.5 mM, GSH 1 mM
e opportune aliquote di campione o bianco.
Nel saggio della glutatione reduttasi (GR) viene misurato il decremento dell’assorbanza dovuto al
consumo di NADPH(λ = 340 nm; ε = -6.22 mM-1cm-1). La reazione è stata condotta in un volume di
saggio finale di 1 ml contenente tampone K-fosfato 100 mM a pH 7.0, GSSG 1 mM e NADPH 0.12
mM e appropriate aliquote di campione.
L’attività enzimatica delle glutatione perossidasi (GPx) è stata misurata in un saggio accoppiato in cui
il GSSG formato nella reazione delle perossidasi viene riconvertito nella forma ridotta da una glutatione
reduttasi aggiunta in saggio: la diminuzione di assorbanza del NADPH è stata seguita a λ = 340 nm (ε
= -6.22 mM-1cm-1). L’attività è stata misurata usando come substrato l’idroperossido di cumene (CHP).
Il volume finale di saggio (1 ml) contiene tampone K-fosfato 100 mM pH 7.5, EDTA 1 mM, GSH 2
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mM, glutatione reduttasi 1U, NADPH 0.24 mM, appropriate aliquote di campione, idroperossido di
cumene 0.8 mM.
Per la determinazione del glutatione totale gli omogenati sono stati preparati in acido sulfosalicilico
5% con EDTA 4 mM (1:5 p/v). I campioni sono stati lasciati in ghiaccio per 45 min per la
deproteinizzazione e centrifugati a 37.000 xg per 15 min. Il contenuto di glutatione totale è stato
determinato misurando per via spettrofotometrica (λ = 412 nm) la formazione di TNB a partire
dall’acido 5,5’-ditio-bis-2-nitrobenzoico (DTNB). Il saggio è stato condotto in tampone K-fosfato 100
mM pH 7, EDTA 1 mM, DTNB 0.1 mM, NADPH 0.24 mM, glutatione reduttasi 1 U, con opportune
aliquote di campione. La calibrazione è stata effettuata utilizzando standard di GSH.
Per l’analisi della capacità antiossidante totale (TOSC) i campioni sono stati omogenati (1:3 p/v) in
tampone K-fosfato 100 mM, pH 7.5, con cloruro di sodio 2.5% ed i seguenti inibitori di proteasi:
aprotinina 0.008 TIU/ml, leupeptina 1 µg/ml, pepstatina 0.5 µg/ml. La frazione citosolica è stata
ottenuto mediante centrifugazione a 100.000 xg a 4°C.
Nel saggio TOSCA varie forme di radicali liberi vengono artificialmente generate a tasso costante. In
questo modo i ROS possono ossidare un substrato (l’acido α-keto-γ-metiolbutirico, KMBA) ad etilene
la cui formazione in funzione del tempo viene misurata in gas cromatografia. L’efficienza degli
antiossidanti cellulari come “scavengers” dei radicali prodotti è funzione della loro capacità di ridurre la
reazione tra radicali liberi e KMBA. Il grado di inibizione della formazione di etilene rispetto ad una
reazione di controllo, permette di quantificare un parametro TOSC che rappresenta la capacità
antiossidante totale di un campione nei confronti di una determinata classe di radicali liberi. Poiché
l’efficienza relativa degli antiossidanti puo’ variare molto nei confronti di diverse forme di ossidanti, il
metodo TOSCA è stato standardizzato nei confronti di più classi di radicali liberi, tra cui i radicali
perossilici ed idrossilici. I radicali perossilici sono stati ottenuti dalla omolisi termica del 2-2'-azo-bis-(2
metilpropionamidina)-diidrocloruro (ABAP), i radicali idrossilici sono stati generati attraverso una
reazione di Fenton ferro-acido ascorbico (Regoli and Winston, 1999).
Le condizioni di saggio finali sono state:
a) 0.2 mM KMBA, 20 mM ABAP in tampone K-fosfato100 mM , pH 7.4 per i radicali perossilici;
b) 0.2 mM KMBA, 1.8 μM Fe3+, 3.6 μM EDTA, 180 μM acido ascorbico in tampone K-fosfato 100
mM, pH 7.4 per i radicali idrossilici;
Le reazioni sono state condotte in un volume finale di 1 ml, a 35°C, in vials da 10 ml chiusi con valvole
gas-tight Mininert per iniezioni multiple. Aliquote di 200 μl sono state prelevate dallo spazio di testa ad
intervalli di 10-12 min e la formazione di etilene è misurata con un gas cromatografo Hewlett Packard
(HP 4890 series) equipaggiato con colonna capillare Supelco SPB-1 (30 m x 0.32 mm x 0.25 μm) ed un
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detector a ionizzazione di fiamma (FID). Le temperature al forno, iniettore e detector erano
rispettivamente 35°, 160° e 220°C; come gas di trasporto è stato utilizzato l’elio (flusso a 1 ml/min) ed
un rapporto split di 20:1.
I valori TOSC sperimentali ottenuti nei confronti delle varie forme di radicali sono quantificati
dall’equazione:
TOSC = 100-(∫SA/∫CA x 100)
dove ∫SA e ∫CA rappresentano l’integrazione matematica delle aree descritte al di sotto delle curve
cinetiche rispettivamente della reazione del campione (∫SA) e di quella del controllo (∫CA). In questo
modo un valore TOSC pari a 0 (∫SA/∫CA=1) indica un campione con nessuna capacità di neutralizzare
radicali (nessuna inibizione della formazione di etilene rispetto al controllo), mentre un valore teorico
massimo TOSC = 100 corrisponderebbe ad una totale inibizione della formazione di etilene per tutta la
durata del saggio dovuta alla completa neutralizzazione dei radicali da parte degli antiossidanti (∫SA=0).
Per tutti i campioni un valore TOSC specifico (riferito a 1 mg di proteine) è stato calcolato dividendo il
valore TOSC sperimentale per la quantità di proteine presenti nel saggio. I campioni biologici sono
stati diluiti per ottenere valori TOSC sperimentali compresi tra 20 e 40, in quanto tali valori rientrano
nell’intervallo di massima linearità analitica con un valore di coefficiente angolare vicino ad 1.
Il contenuto di malondialdeide è stato determinato attraverso una reazione di coniugazione con 1metil-2-fenilindolo, che dà luogo alla formazione di un composto con assorbanza massima a λ = 586
nm. Per questa analisi i campioni di ghiandola digestiva sono stati omogenati in Tris-HCl 20 mM pH
7.4 (1:3 p/v) e centrifugati a 3.000 xg per 20 min. La reazione di coniugazione è stata condotta a 45°C
per 40 min in un volume finale di 1 ml costituito da: 650 µl di 1-metil-2-fenilindolo 10.3 mM in
acetonitrile diluito in rapporto 3:1 con metanolo; 100 µl di campione; 100 µl di H2O; 150 µl di HCl
37%. Dopo centrifugazione a 15.000 xg per 10 min, il contenuto di malondialdeide è stato misurato per
via spettrofotometrica, utilizzando come standard 1,1,3,3-tetrametossipropano in Tris-HCl 20 mM
(Shaw et al.,2004).
Le proteine sono state misurate secondo il metodo di Lowry, utilizzando albumina di siero bovino
(BSA) come standard (Lowry et al., 1951).
Analisi statistica
Per ogni parametro analizzato l’analisi della varianza a una via (ANOVA) è stata utilizzata per testare la
significatività delle differenze in funzione dei siti, mentre l’analisi post hoc (Newman-Keuls) ha
permesso di verificare la significatività delle differenze tra le medie dei valori. L’analisi delle
Componenti Principali (PCA) è stata utilizzata per evidenziare possibili correlazioni ed associazioni tra
le diverse variabili e la separazione dei siti in funzione delle campagne di bianco e cantiere.
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Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
8.2 Risultati ottenuti in Mytilus galloprovincialis
Il dettaglio di tutti i risultati ottenuti viene riportato nell’Appendice del presente capitolo.
I biomarkers di esposizione a specifiche classi di contaminanti (metallotioneine, proliferazione
perossisomiale e attività dell’acetilcolinesterasi) non hanno evidenziato differenze tra i mitili traslocati
nelle due aree in prossimità del terminale durante la fase di cantiere nel Dicembre 2008 rispetto agli
organismi traslocati nell’area di riferimento (Portonovo, AN) (figura 8.2.1). I valori medi di
metallotioneine sono risultati pari a 3,4 ± 0,41 Eq. GSH nmol/mg prot, quelli della acil CoA ossidasi
(AOX) pari a 0,6 ± 0,2 e infine quelli dell’acetilcolinesterasi 41,7 ± 9,14 nmol/min/mg prot.
Tra i biomarkers di danno cellulare, la stabilità delle membrane lisosomiali ha mostrato valori
significativamente più bassi nei mitili delle stazioni TC039 e TC040 (31,3 ± 2,30 minuti) rispetto agli
organismi di riferimento (46,2 ± 11,1 minuti). Il grado di frammentazione del DNA non ha evidenziato
invece differenze tra le aree con livelli di 26,2 ± 2,18 di % di DNA nella coda. Anche la frequenza di
micronuclei è risultata confrontabile tra gli organismi traslocati nelle varie aree (0,54 ± 0,54‰), anche
se tendenzialmente più alta in quelli del sito TC040 (figura 8.2.2).
L’analisi dei parametri ossidativi ha evidenziato qualche differenza tra i mitili traslocati nelle diverse aree
(figura 8.2.3). L’attività della catalasi è risultata significativamente più elevata nelle stazioni TC039 e
TC040 rispetto al sito di riferimento (37,6 ± 0,23 vs 11,6 ± 5,22 µmol/min/mg prot), mentre l’attività
delle glutatione S-transferasi ha evidenziato livelli significativamente più bassi in TC040 (93,2±16,4
nmol/min/mg prot) e intermedi in TC039 (106 ± 24,3 nmol/min/mg prot) rispetto alla TC041 (130 ±
1,96 nmol/min/mg prot). L’attività della glutatione reduttasi e delle glutatione perossidasi non hanno
evidenziato differenze significative tra i mitili traslocati nelle diverse aree, ed i valori medi sono risultati
rispettivamente di 24 ± 5,99 e 16,1 ± 1,14 nmol/min/mg prot. I mitili traslocati nei siti dell’area del
terminale hanno evidenziato livelli di glutatione totale significativamente più bassi (0,45 ± 0,05 µmol/gr
tess) rispetto a quelli di controllo (0,88 ± 0,07 µmol/gr tess), mentre la capacità antiossidante totale
verso i radicali perossilici ed idrossilici e i livelli di malondialdeide sono risultati confrontabili tra i
diversi siti (275 ± 21,3 UTosc/mg prot; 239 ± 9,25 UTosc/mg prot e 39 ± 3,2 nmol/gr tess).
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Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
Metallotioneine
Eq. GSH µmol/mg prot
p>0.05
5
4
3
2
1
0
TB039
TC039
TB040
TC040
Attività AOX
TB 041
TC041
p>0.05
nmol/min/mg prot
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
TB039
TC039
TB040
TC040
Attività acetilcolinesterasi
TB 041
TC041
p>0.05
nmol/min/mg prot
80
70
60
50
40
30
20
10
0
TB039
TC039
TB040
TC040
TB 041
TC041
Figura 8.2.1: Livelli di metallotioneine, attività della acil CoA ossidasi (AOX) e dell’acetilcolinesterasi nei mitili
traslocati nelle due aree del terminale (TC039 e TC040) e nel sito di riferimento di Portonovo (TC041) durante la
campagna di cantiere (Dicembre 2008). Valori espressi come medie ± deviazioni standard (n=10).
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Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
Stabilità lisosomiale
p<0.05
minuti
70
b
60
50
a
a
40
30
20
10
0
TC039
TB039
TB040
TC040
TC041
TB 041
Grado di frammentazione del DNA
% DNA nella coda
p>0.05
35
30
25
20
15
10
5
0
TB039
TC039
TB040
TC040
Micronuclei
Frequenza di MN ‰
TB 041
TC041
p>0.05
2
1.6
1.2
0.8
0.4
0
TB039
TC039
TB040
TC040
TB 041
TC041
Figura 8.2.2: Stabilità lisosomiale, grado di frammentazione del DNA e frequenza di micronuclei nei mitili
traslocati nelle due aree del terminale (TC039 e TC040) e nel sito di riferimento di Portonovo (TC041) durante la
campagna di cantiere (Dicembre 2008). Valori espressi come medie ± deviazioni standard (n=5). Lettere diverse
indicano differenze significative tra gruppi di medie (confronto post hoc).
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Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
Attività catalasi
µmol/min/mg prot
60
nmol/min/mg prot
ab
p<0.05
b
140
a
a
Attività Glutatione S-transferasi
p<0.05
a
120
50
100
40
80
30
b
20
60
40
10
20
0
0
TC039
TB039
TB040
TC040
Attività glutatione reduttasi
TB039
TC039
TB
041
TC041
TB040
TC040
Attività glutatione perossidasi
p>0.05
nm ol/m in/mg prot
nm ol/m oin/mg prot
40
TB
041
TC041
p>0.05
25
35
20
30
25
15
20
10
15
10
5
5
0
0
TB039
TC039
TB040
TC040
Livelli glutatione totale
TB 041
TC041
p<0.05
µmol/gr tess
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
TB039
TC039
b
TB040
TC040
TB
041
TC041
Capacità antiossidante totale (TOSC-ROO) p>0.05
UTosc/m g prot
400
350
a
300
a
250
200
150
100
50
0
TC039
TB039
TB040
TC040
Capacità antiossidante totale (TOSC-OH)
UTosc/m g prot
TC039
TB039
TB
041
TC041
TB040
TC040
Livelli di malondialdeide
p>0.05
nm ol/gr tess
TB
041
TC041
p>0.05
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
350
300
250
200
150
100
50
0
TB039
TC039
TB040
TC040
TB
041
TC041
TC039
TB039
TB040
TC040
TB
041
TC041
Figura 8.2.3: Attività enzimatiche della catalasi, glutatione S-transferasi, glutatione reduttasi, glutatione
perossidasi, livelli di glutatione totale, capacità antiossidante totale verso radicali perossilici ed idrossilici, livelli di
malondialdeide nei mitili traslocati nelle due aree del terminale (TC039 e TC040) e nel sito di riferimento di
Portonovo (TC041) durante la campagna di cantiere (Dicembre 2008). Valori espressi come medie ± deviazioni
standard (n=10). Lettere diverse indicano differenze significative tra gruppi di medie (confronto post hoc).
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere
586
Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
8.3. Discussione dei risultati della campagna di cantiere e confronto con quelli
ottenuti nelle campagne di bianco
Tra i biomarkers di esposizione a specifiche classi di contaminanti sono stati analizzati i livelli di
metallotioneine, proteine inducibili coinvolte nell’omeostasi cellulare di diversi metalli pesanti
(Viarengo et al., 1997). I valori ottenuti durante la campagna di cantiere non hanno evidenziato
differenze tra i mitili traslocati nelle due aree in prossimità del terminale rispetto all’area di riferimento
(Portonovo) (si veda il paragrafo precedente, figura 8.2.1). Confrontando i risultati ottenuti durante la
fase di cantiere e le campagne di bianco si evidenzia un aumento generale dei livelli di metallotioneine,
che risultano circa il 50% più alte rispetto ai periodi precedenti (figura 8.3.1). Tuttavia poiché tale
variazione è stata osservata anche nell’area di riferimento, l’induzione non sembra essere correlata ad
un’esposizione a contaminanti metallici rilasciati durante la fase di cantiere, ma piuttosto ad una
variazione stagionale legata al ciclo riproduttivo degli organismi (Gorbi et al., 2008). Durante il periodo
invernale infatti i mitili delle coste adriatiche vanno incontro a spawning, fase del ciclo riproduttivo che
induce un aumento dei livelli di metallotioneine (Ivankovich et al., 2005; Isani et al., 2000).
La proliferazione perossisomiale, misurata attraverso l’attività enzimatica dell’ acil CoA ossidasi, è
stata scelta come marker di esposizione a contaminanti organici (Cajaraville et al., 2000). I valori
misurati in questa campagna non hanno evidenziato differenze significative tra siti di traslocazione, ma
sono risultati significativamente più bassi in tutte le aree rispetto alle campagne di bianco effettuate in
precedenza (figura 8.3.1). Anche per questo parametro, le variazioni misurate sia nell’area del terminale
sia in quella di riferimento indicano una risposta legata ad un fattore naturale piuttosto che ad
un’esposizione a proliferatori perossisomiali. L’Acil CoA ossidasi interviene nel metabolismo lipidico in
quanto rappresenta l’enzima chiave della beta ossidazione degli acidi grassi e di altri substrati naturali
come eicosanoidi, molecole lipidiche che presentano una marcata stagionalità legata al ciclo riproduttivo
e alla dieta dell’animale (Cancio et al., 1999; Deridovich and Reunova, 1993). La generale inibizione
osservata in questo periodo confermerebbe la limitata quantità di lipidi correlata alla perdita di tessuto
gonadico alla fine dello spawning. Anche l’attività dell’acetilcolinesterasi, la cui inibizione è
generalmente utilizzata per evidenziare un’esposizione a composti neurotossici, in particolare organo
fosforici e carbammati (Forget et al., 2003; Rickwood e Galloway, 2004), non ha evidenziato differenze
significative tra siti (si veda il paragrafo precedente, figura 8.2.1). Una inibizione significativa rispetto al
bianco è stata tuttavia misurata durante la fase di cantiere (figura 8.3.1), ma anche per questo biomarker
di esposizione, i risultati ottenuti negli organismi di controllo confermano una significativa influenza di
fattori stagionali durante quest’ultima campagna. Alcuni studi recenti hanno dimostrato che fattori
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere
587
Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
naturali, come la temperatura e la salinità, possono agire su questa attività enzimatica sia direttamente,
che indirettamente influenzando il ciclo riproduttivo degli organismi (Pfeifer et al., 2005).
Metallotioneine
Eq. GSH nmol/mg prot
5.00
4.50
4.00
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
TB039TB040TB041
TB039TB040TB041
TB039TB040TB041
luglio ‐06
genn ‐07
febb ‐07
TB039TB040TB041
marzo ‐07
TC039TC040TC041
TB039TB040TB041
dic ‐08
cantiere
Attività AOX
nmol/min/mg prot
4.50
4.00
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
TB039TB040TB041
TB039TB040TB041
TB039TB040TB041
luglio ‐06
genn ‐07
febb ‐07
TB039TB040TB041
marzo ‐07
TB039TB040TB041
TC039TC040TC041
dic ‐08
cantiere
Attività acetilcolinesterasi
nmol/min/mg prot
250.0
200.0
150.0
100.0
50.0
0.0
TB039TB040TB041
luglio ‐06
TB039TB040TB041
TB039TB040TB041
genn ‐07
febb ‐07
TB039TB040TB041
marzo ‐07
TC039TC040TC041
TB039TB040TB041
dic ‐08
cantiere
Figura 8.3.1: Confronto dei livelli di metallotioneine, attività della acil CoA ossidasi (AOX) e
dell’acetilcolinesterasi nei mitili traslocati nelle diverse aree del terminale (T039 e T040) e nel sito di riferimento
(T041) durante le campagne di bianco (luglio -06, gennaio -07, febbraio -07 e marzo -07) e la campagna di
cantiere (dicembre -08). Valori espressi come medie ± deviazioni standard (n=10).
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere
588
Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
Tra i biomarkers di danno cellulare è stata valutata la stabilità delle membrane lisosomiali, risposta
particolarmente sensibile nell’evidenziare l’insorgenza di condizioni di disturbo ambientale (Moore et
al., 2006). Nella campagna di cantiere (si veda il paragrafo precedente, figura 8.2.2) i valori di ritenzione
del rosso neutro nei mitili traslocati nell’area del terminale sono risultati significativamente più bassi
rispetto a quelli misurati negli organismi del sito di riferimento. Tuttavia durante le campagne di bianco
questo parametro ha evidenziato una forte stagionalità; i bassi valori di Rosso Neutro misurati durante
la campagna di cantiere (figura 8.3.2) sia nell’area di riferimento che nell’area del terminale (< 40minuti)
confermerebbero una certa forma di disturbo biologico “stagionale” probabilmente legato alla fase del
ciclo riproduttivo. Come abbiamo già detto infatti, durante il periodo invernale i mitili vanno incontro a
spawning con conseguente aumento dei processi autofagici e degradazione del tessuto digestivo (Regoli,
1992), che si riflette in una alterazione della funzionalità del sistema lisosomiale. La differenza tra siti
può evidenziare un diverso effetto del disturbo biologico, legato probabilmente a fasi del ciclo
riproduttivo che risultano non sincrone nelle diverse aree di traslocazione.
Il danno genotossico misurato come grado di frammentazione del DNA nella coda e come
frequenza di micronuclei non ha evidenziato differenze significative tra i diversi siti di traslocazione
(si veda il paragrafo precedente, figura 8.2.2). In generale i livelli di % di DNA nella coda risultano
bassi, confrontabili con quelli misurati nella campagna invernale di bianco (figura 8.3.2), non
evidenziando specifiche condizioni di disturbo genotossico. Anche i livelli di micronuclei pur con
qualche fluttuazione nei valori medi, non risultano particolarmente elevati e non statisticamente diversi
da quelli ottenuti nei campionamenti precedenti (figura 8.3.2).
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere
589
Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
Stabilità lisosomiale
minuti
140
120
100
80
60
40
20
0
TB039 TB040 TB041
luglio ‐06
TB039 TB040 TB041
TB039 TB040 TB041
genn ‐07
febb ‐07
TB039 TB040 TB041
marzo ‐07
TB039 TB040 TB041
TC039TC040TC041
dic ‐08
cantiere
Grado di frammentazione del DNA
% DNA nella coda
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
TB039 TB040 TB041
luglio ‐06
TB039 TB040 TB041
TB039 TB040 TB041
genn ‐07
febb ‐07
TB039 TB040 TB041
marzo ‐07
TC039TC040TC041
TB039 TB040 TB041
dic ‐08
cantiere
Micronuclei
Frequenza MN‰
4.50
4.00
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
TB039 TB040 TB041
TB039 TB040TB041
TB039 TB040 TB041
luglio ‐06
genn ‐07
febb ‐07
TB039TB040 TB041
marzo ‐07
TB039 TB040 TB041
TC039TC040TC041
dic ‐08
cantiere
Figura 8.3.2: Confronto della stabilità lisosomiale, del grado di frammentazione del DNA e della frequenza di
micronuclei nei mitili traslocati nelle diverse aree del terminale (T039 e T040) e nel sito di riferimento (T041)
durante le campagne di bianco (luglio -06, gennaio -07, febbraio -07 e marzo -07) e la campagna di cantiere
(dicembre -08). Valori espressi come medie ± deviazioni standard (n=5).
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere
590
Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
Durante la campagna di cantiere, l’attività della catalasi è risultata significativamente più elevata nei
mitili traslocati nell’area del terminale rispetto al sito di riferimento (si veda il paragrafo precedente,
figura 8.2.3). Questo enzima rappresenta il principale meccanismo di rimozione del perossido di
idrogeno, e le sue variazioni rappresentano un biomarkers sensibile nell’evidenziare un’alterazione del
bilancio ossidativo cellulare. Se confrontiamo però le variazioni di catalasi con le campagne invernali
della fase di bianco, risultati simili a quelli ottenuti nella fase di cantiere sono già stati evidenziati nel
Febbraio 2007 (figura 8.3.3). Per quanto riguarda le glutatione S-transferasi, la loro induzione è
generalmente associata all’esposizione a contaminanti organici, mentre l’inibizione o variazioni
transitorie riflettono condizioni di disturbo generali; sebbene questi enzimi abbiano mostrato qualche
differenza tra le aree durante la fase di cantiere (si veda il paragrafo precedente, figura 8.2.3), con i mitili
traslocati in TC040 e TC039 che presentano livelli enzimatici più bassi del riferimento, i valori di attività
enzimatica risultano all’interno del range di quelli misurati durante le campagne di bianco (figura 8.3.3).
Gli organismi traslocati nell’area del terminale non hanno evidenziato differenze nell’attività della
glutatione reduttasi e delle glutatione perossidasi. La glutatione reduttasi, pur non avendo
un’azione antiossidante diretta, mantiene l’equilibrio ossidativo cellulare riconvertendo il glutatione dalla
sua forma ossidata inattiva (GSSG) nella sua forma ridotta biologicamente attiva (GSH); le glutatione
perossidasi, invece operano la rimozione dei perossidi organici ed inorganici. Anche considerando i
campionamenti effettuati durante le campagne di bianco, sia la glutatione reduttasi che le glutatione
perossidasi non hanno evidenziato differenze marcate tra le diverse aree, ma piuttosto variazioni
indicative di una fluttuazione stagionale (figura 8.3.3).
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere
591
Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
Attività catalasi
µmol/min/mg prot
70.0
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
TB039TB040TB041
luglio ‐06
TB039TB040TB041
genn ‐07
TB039TB040TB041
TB039TB040TB041
febb ‐07
marzo ‐07
TB039TB040TB041
TC039TC040TC041
dic ‐08
cantiere
Attività glutatione S-transferasi
nmol/min/mg prot
400
350
300
250
200
150
100
50
0
TB039TB040TB041
TB039TB040TB041
TB039TB040TB041
luglio ‐06
genn ‐07
febb ‐07
TB039TB040TB041
marzo ‐07
TC039TC040TC041
TB039TB040TB041
dic ‐08
cantiere
Attività glutatione reduttasi
nmol/min/mg prot
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
TB039TB040TB041
TB039TB040TB041
TB039TB040TB041
luglio ‐06
genn ‐07
febb ‐07
TB039TB040TB041
marzo ‐07
TC039TC040TC041
TB039TB040TB041
dic ‐08
cantiere
Attività glutatione perossidasi
nmol/min/mg prot
25.0
20.0
15.0
10.0
5.0
0.0
TB039TB040TB041
TB039TB040TB041
TB039TB040TB041
luglio ‐06
genn ‐07
febb ‐07
TB039TB040TB041
marzo ‐07
TC039TC040TC041
TB039TB040TB041
dic ‐08
cantiere
Figura 8.3.3: Confronto dell’attività enzimatica della catalasi, glutatione S-transferasi, glutatione reduttasi e
glutatione perossidasi nei mitili traslocati nelle diverse aree del terminale (T039 e T040) e nel sito di riferimento
(T041) durante le campagne di bianco (luglio -06, gennaio -07, febbraio -07 e marzo -07) e la campagna di
cantiere (dicembre -08). Valori espressi come medie ± deviazioni standard (n=10).
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere
592
Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
I mitili trapiantati nell’area del terminale durante la fase di cantiere hanno evidenziato rispetto agli
organismi di controllo valori significativamente più bassi di glutatione totale (circa del 40%), molecola
a basso peso molecolare che rappresenta uno dei più importanti antiossidanti cellulari, oltre che un
cofattore per numerosi enzimi. La diminuzione dei livelli di glutatione è stata osservata in numerosi
studi sia di laboratorio che in condizioni naturali in risposta all’esposizione a contaminanti metallici con
cui questa molecola ha un’elevata affinità e che, una volta complessati grazie ai gruppi SH, causano una
perdita della disponibilità di questa molecola (Regoli e Principato, 1995). Il confronto tra organismi
trapiantati durante le fasi di bianco e cantiere evidenzia una forte diminuzione dei livelli di glutatione
totale sia nei mitili di riferimento che in quelli dell’area del terminale, suggerendo dunque anche per
questo parametro l’influenza di fattori stagionali e non legati alle attività di cantiere (figura 8.3.4).
A questo proposito, marcate fluttuazioni stagionali delle difese antiossidanti nei mitili del Mediterraneo
sono state riportate in numerosi studi che hanno evidenziato il ruolo delle variazioni naturali di fattori
come disponibilità di nutrienti, temperatura e ciclo riproduttivo (Sheehan and Power, 1999; Bocchetti
and Regoli, 2006). Popolazioni di mitili provenienti da aree diverse dell’Adriatico hanno evidenziato
andamenti opposti dei singoli sistemi nello stesso periodo stagionale, suggerendo dunque che lo stesso
fattore pro ossidante possa influenzare diversamente le risposte biologiche in funzione dell’area. Questo
è in accordo con l’evidenza che le variazioni stagionali di temperatura e disponibilità di cibo risultano
diverse lungo le coste dell’Adriatico, mostrando anche una certa variabilità inter-annuale che influenza
le caratteristiche biologiche degli organismi, come il ciclo riproduttivo, che risulta pertanto non
sincrono nelle diverse popolazioni.
In generale dunque, l’analisi dei parametri ossidativi non ha evidenziato marcate differenze tra i mitili
traslocati nelle diverse aree durante la campagna di cantiere rispetto a quelle di bianco.
L’analisi della capacità antiossidante totale che fornisce una misura quantitativa dell’efficienza
complessiva delle difese antiossidanti di neutralizzare varie specie reattive dell’ossigeno (Regoli et al.,
2004) non è risultata significativamente diversa nei mitili traslocati nell’area del terminale e rispetto a
quelli dell’area di riferimento durante la fase di cantiere (si veda il paragrafo precedente, figura 8.2.3).
Questi risultati confermano che, nonostante si siano riscontrate alcune differenze nei singoli sistemi
antiossidanti tra i mitili delle diverse aree, queste non sono tali da modificare lo stato ossidoriduttivo
cellulare, ed evidenziare la presenza di un significativo disturbo ossidativo. Inoltre, mentre i valori di
TOSC verso i radicali perossilici sono risultati confrontabili con quelli misurati nelle campagne di
bianco, la capacità di neutralizzare i radicali idrossilici ha evidenziato valori più bassi durante la fase di
cantiere in tutte le aree (figura 8.3.4), confermando la presenza di un diverso effetto sia di fattori
biologici che naturali, probabilmente legato a fluttuazioni stagionali. Anche i livelli di malondialdeide,
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere
593
Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
prodotto di perossidazione lipidica, non sono risultati differenti nei tre siti analizzati durante la fase di
cantiere (si veda il paragrafo precedente, figura 8.2.3), ma i valori sono risultati mediamente più elevati
rispetto a quelli misurati durante le campagne di bianco (figura 8.3.4). Variazioni dei livelli di
malondialdeide sono state osservate infatti durante il periodo di spawning, quando i processi autofagici
e di degradazione dell’epitelio digestivo inducono l’aumento dei processi di perossidazione lipidica
(Gorbi et al., 2008).
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere
594
Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
Livelli di glutatione totale
µmol/gr tess
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
TB039TB040TB041
TB039TB040TB041
TB039TB040TB041
luglio ‐06
genn ‐07
febb ‐07
TB039TB040TB041
marzo ‐07
TC039TC040TC041
TB039TB040TB041
dic ‐08
cantiere
Capacità antiossidante totale
(TOSC-ROO) UTosc/mg prot
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
TB039TB040TB041
luglio ‐06
TB039TB040TB041
genn ‐07
TB039TB040TB041
febb ‐07
TB039TB040TB041
marzo ‐07
TC039TC040TC041
TB039TB040TB041
dic ‐08
cantiere
Capacità antiossidante totale
(TOSC-HO) UTosc/mg prot
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
TB039TB040TB041
luglio ‐06
TB039TB040TB041
genn ‐07
TB039TB040TB041
febb ‐07
TB039TB040TB041
marzo ‐07
TC039TC040TC041
TB039TB040TB041
dic ‐08
cantiere
Livelli di malondialdeide
nmol/gr tess
70.0
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
TB039TB040TB041
TB039TB040TB041
TB039TB040TB041
luglio ‐06
genn ‐07
febb ‐07
TB039TB040TB041
marzo ‐07
TB039TB040TB041
TC039TC040TC041
dic ‐08
cantiere
Figura 8.3.4: Confronto dei livelli di glutatione totale, capacità antiossidante totale verso i radicali perossilici ed
idrossilici, livelli di malondialdeide nei mitili traslocati nelle diverse aree del terminale (T039 e T040) e nel sito di
riferimento (T041) durante le campagne di bianco (luglio -06, gennaio -07, febbraio -07 e marzo -07) e la
campagna di cantiere (dicembre -08). Valori espressi come medie ± deviazioni standard (n=10).
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere
595
Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
L’analisi delle Componenti Principali di tutti i parametri analizzati, considerando sia le campagne
effettuate durante le fasi di bianco che quelle di cantiere, ha messo in evidenza due fattori (PC1 e PC2)
che spiegano il 62,5% del totale della varianza (figura 8.3.5). Il primo fattore (42%) risulta
negativamente correlato con i livelli di metallotioneine, e positivamente correlato con l’attività
dell’AOX, dell’acetilcolinesterasi, con la stabilità lisosomiale, con il glutatione totale e la capacità
antiossidante totale verso i radicali perossilici. Il secondo fattore (17,5%) risulta negativamente correlato
con l’attività della glutatione reduttasi e la capacità antiossidante totale verso i radicali idrossilici. E’
inoltre evidente una chiara separazione dei punti corrispondenti alla campagna di cantiere rispetto a
quelli delle fasi di bianco. Tuttavia, in questo periodo sia l’area di riferimento che l’area del terminale
sono tra loro associate in funzione di quei biomarkers correlati con i due fattori principali e che hanno
evidenziato marcate fluttuazioni stagionali. Questi risultati confermano che la separazione dei risultati
ottenuti durante la fase di cantiere rispetto a quelli delle campagne di bianco è legata a fluttuazioni
naturali dei biomarkers piuttosto che alla presenza di una compromissione biologica dovuta agli effetti
delle operazioni di cantiere.
3
I Luglio
TB040
I Luglio
TB040TB039
I Luglio
'06
2
TB039 I Luglio '06
TB041 cantiere Dic
Dic.’08
TC040 cantiere TC041
Dic Cantiere
TB041
Cantiere dic.'08
TC039 cantiere
Dic
TC040
TB040Cantiere
CantiereDic.’08
dic.'08
Fatt. 2: 17.52%
1
TB039
Cantiere
dic.'08
TC039
Cantiere
Dic.’08
0
I Luglio
TB040TB041
IV Marzo
TB041
I Luglio '06
TB041 IV Marzo
TB040 IV Marzo '07
TB041
IV Marzo '07
TB041
III Febb
TB039
II Genn
TB040
II Genn
TB041 III Febb.'07
TB039 II Genn'07
TB030
IV Marzo
TB040
II Genn'07
-1
TB039 IV Marzo '07
-2
TB039 III Febb.'07
TB039
III Febb
TB040
III Febb
TB041 II Genn
TB040 III Febb.'07
-3
TB041 II Genn'07
-4
-5
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
Fatt. 1: 41.98%
Figura 8.3.5: Analisi delle componenti principali effettuata utilizzando tutti i parametri analizzati in Mytilus
galloprovincialis e rappresentazione grafica delle stazioni investigate durante le campagne di bianco e quella di
cantiere.
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Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
8.4. Conclusioni
Nel complesso, i risultati ottenuti dall’analisi di numerosi biomarkers hanno evidenziato poche
variazioni tra gli organismi traslocati nell’ area del terminale rispetto a quelli di controllo.
Il confronto tra la campagna di cantiere e quelle di bianco ha messo in evidenza marcate fluttuazioni
stagionali dei parametri analizzati, confermando che fattori naturali come temperatura, disponibilità di
cibo e ciclo riproduttivo influenzano significativamente le risposte biologiche analizzate.
In conclusione i risultati sui biomarker misurati nel mitili traslocati nell’area del terminale permettono di
escludere la presenza di un disturbo biologico legato alle attività di cantiere.
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Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
APPENDICE BIOMARKERS
AREA TERMINALE
CAMPAGNA DICEMBRE 2008
Fase di cantiere
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Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
BIOMARKERS – Area Terminale – Mytilus galloprovincialis – Cantiere – Dicembre 2008
TC039M
TC040M
TC041M
Esposizione a metalli in traccia
Metallotioneine
2,96 ± 0,25 3,77 ± 0,86 3,52 ± 1,16
Eq. (GSH) nmol/mg prot
Prolif. perossisomiale (esposizione a proliferatori
perossisomiali)
Att. enzimatica AcilCoA ossidasi (AOX)
0,66 ± 0,19 0,45 ± 0,18 0,69 ± 0,22
nmol/min/mg prt
Esposizione a organofosforici, carbammati ed altri
inquinanti
Att. enzimatica della acetilcolinesterasi (AchE)
39,7 ± 14,7 33,7 ± 8,68 51,7 ± 16,3
nmol/min/mg prt
Danni al sistema lisosomiale
Stabilità lisosomiale
33,0 ± 7,26 29,8 ± 8,56 46,3 ± 11,1
minuti
Danni DNA
Integrità strutturale DNA (Comet Assay)
24,8 ± 3,13 28,7 ± 3,26 25,1 ± 3,79
% DNA nella coda
Micronuclei negli emociti
0,10 ± 0,10 1,16 ± 0,70 0,38 ± 0,19
Frequenza di MN ogni 1000 cellule
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Capitolo 8 – Biomarkers Mytilus galloprovincialis
BIOMARKERS –Area Terminale – Mytilus galloprovincialis – Cantiere – Dicembre 2008
TC039M
TC040M
TC041M
Parametri stress ossidativo
Att. enzimatica della catalasi
37,8 ± 8,6
37,4 ± 13,3 11,7 ± 5,23
µmol/min/mg prt
Att. enzimatica delle Glutatione S-transferasi (GST)
107 ± 24,3 93,2 ± 16,5
130 ± 1,96
nmol/min/mg prt
Att. enzimatica delle Glutatione Reduttasi (GR)
21,7 ± 7,96 19,5 ± 4,45 30,8 ± 5,35
nmol/min/mg prt
Att. enzimatica delle Glutatione perossidasi (GPx)
15,6 ± 5,52 17,3 ± 3,68 15,2 ± 2,84
nmol/min/mg prt
Livelli di Glutatione totale
0,41 ± 0,03 0,49 ± 0,04 0,83 ± 0,07
µmol/g tess
Capacità antiossidante totale (TOSC ROO·)
262 ± 24,7 300 ± 62,5
264 ± 33,1
U Tosc/mg prt
Capacità antiossidante totale (TOSC HO·)
239 ± 33,8 231 ± 101,1 249 ± 34,7
U Tosc/mg prt
Perossidazione lipidica
Livelli di malondialdeide
38,8 ± 6,2
35,9 ± 1,38 42,3 ± 2,38
nmol/g tess
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