il kavolì

LABORATORIO
PROPRIETÀ SALUTISTICHE
DI UNA GIOVANE BRASSICACEA
IL KAVOLÌ
Un nuovo ortaggio frutto di particolari tecniche agronomiche; per il suo sapore e la sua consistenza può
essere consumato crudo, a differenza di altre varietà di cavolo, ed è ricco di glucosinati e acido ascorbico che ne caratterizzano le proprietà biologiche e nutrizionali.
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* Vincenzo Longo
I
l Kavolì appartiene alla famiglia delle Brassicaceae, la famiglia dei cavoli (le diverse
varietà di Brassica oleracea), ed
è costituito da piccole foglie raccolte a uno stadio giovanile dello
sviluppo della pianta e per questo
consumabile crudo a differenza di
altre Brassicaceae, come il cavolo
toscano, generalmente consumato solo previa cottura. Il Kavolì
viene coltivato su un terreno
sano, ricco di humus e in presenza di microorganismi probiotici
senza l’utilizzo di concimi chimici, diserbanti e antiparassitari. Il
prodotto che si ottiene è migliore
sia come sapore che in termini di
proprietà nutritive.
Nonostante la giovane età, le foglioline del Kavolì presentano sia
il sapore che le proprietà nutrizionali tipiche dei cavoli e, grazie
alla tecnologia utilizzata per la
produzione, contengono una notevole quantità di sostanze antiossidanti.
È universalmente riconosciuto
che tutte le verdure appartenenti alla famiglia delle Brassicaceae (cavolo, broccoli, cavolini di
Bruxelles, verza, crescione, rapa,
cavolfiore) siano molto importanti per la salute umana, in quanto
ricche in vitamine, sali minerali,
fibre e molti composti fitochimici.
Oltre a proteine, grassi, carboidrati e micronutrienti, il mondo
vegetale fornisce anche fenoli,
terpeni, terpenoidi, alcaloidi, purine, pirimidine, acidi nucleici
e altri composti che esercitano
potenti attività biologiche, riconosciute complessivamente con
il nome di fitochimici. Queste
sostanze hanno spesso un’azione
protettiva sulla salute umana se
assunte a livelli significativi e possono espletare una serie di funzioni biologiche tra le quali attività
antiossidante, modulazione degli
enzimi detossificanti, stimolazione del sistema immunitario, attività antibatterica (1, 2). La classificazione dei composti fitochimici
sintetizzati dalle piante è complessa, ma possiamo individuare
tre gruppi principali: i polifenoli
(suddivisi a loro volta in flavonoidi, acidi fenolici, stilbeni e lignani), i carotenoidi e i glucosinolati.
Queste sostanze concorrono all’espletamento delle ben note attività antiossidanti, antinfiammatorie e antitumorali.
I flavonoidi costituiscono il gruppo più comune di composti polifenolici nella dieta umana e sono
presenti ubiquitariamente nelle
piante.
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È universalmente riconosciuto che tutte
le verdure appartenenti alla famiglia
delle Brassicaceae
siano molto importanti per la salute
umana, in quanto
ricche in vitamine,
sali minerali, fibre
e molti composti
fitochimici
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L’azione antiossidante di polifenoli e flavonoidi è dovuta principalmente alla capacità ossidoriduttiva, che consente loro di agire
da agenti riducenti e quencer di
ossigeno singoletto (3). Il gruppo
dei flavonoidi comprende le importanti sotto-classi dei flavonoli,
e delle antocianine.
Oltre all’azione antiossidante è
stato dimostrato per le Brassicaceae un effetto preventivo e protettivo nei confronti di patologie
cardiovascolari, anemie, disordini visivi e polmonari, nonché
nei confronti di patologie degenerative come le neoplasie; inoltre studi recenti ne hanno dimostrato l’attività antinfiammatoria e antitumorale, in quanto
inducono l’apoptosi delle cellule
tumorali (4).
Proprio in questo ambito si inseriscono le più recenti ricerche
sulla famiglia delle Brassicaceae
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e sul loro potenziale anti-tumorale, grazie all’elevato contenuto di glucosinolati (GLS) precursori degli isotiocianati (ITC),
metabolicamente attivi.
L’enzima coinvolto nella idrolisi
dei glucosinolati in isotiocianati
è la mirosinasi, una glicosidasi
presente sia nelle cellule vegetali che nei batteri che compongono la flora intestinale umana.
La mirosinasi viene liberata dai
vacuoli cellulari a seguito di triturazione delle varie parti della
pianta, inoltre la presenza di
questo enzima a livello della microflora intestinale contribuisce
a rendere ulteriormente disponibili gli isotiocianati di origine
alimentare.
Gli isotiocianati prodotti dall’idrolisi dei glucosinolati sono
responsabili dell’odore pungente e del sapore peculiare delle
Brassicaceae, che scoraggia, in
natura, l’aggressione della pianta da parte di insetti ed erbivori;
nell’uomo esercitano un’analoga
attività nei confronti delle cellule tumorali, inibendone alcune
fasi della carcinogenesi e inducendone l’apoptosi.
Tra gli isotiocianati più studiati
per le proprietà antitumorali citiamo il sulforafano, attivo contro i carcinomi di mammella,
colon e prostata (5).
I glucosinolati, i loro prodotti di
idrolisi e le tirosinasi vengono
facilmente inattivati dal calore. L’eccessiva cottura causa un
odore intenso, indice della liberazione dello zolfo; per mantenere inalterate le proprietà delle
brassicaceae si consiglia l’impiego di alimenti freschi o sottoposti a una cottura al vapore di
pochi minuti. Diversi studi hanno recentemente dimostrato che
sia l’drolisi dei glucosinolati che
l’assorbimento degli isotiocianati
risultano maggiormente efficaci
in seguito al consumo dei vegetali crudi rispetto ai cotti (6).
Il contenuto di glucosinolati
nelle Brassicaceae si riduce con
l’avanzamento dell’età del germoglio e la maturazione della
pianta; il Kavolì, essendo a uno
stadio iniziale di maturazione,
mostra un ottimo livello di glucosinolati e quindi di isotiocianati.
La famiglia delle Brassicaceae è
anche ricca di acido ascorbico,
ossia la vitamina C, nota per
l’elevato potere antiossidante.
Numerosi studi hanno dimostrato che un consumo regolare di
alimenti ricchi in vitamina C può
ridurre significativamente l’incidenza di diverse forme di cancro;
inoltre l’acido ascorbico sembra
agire in maniera sinergica con gli
isotiocianati, potenziandone così
l’effetto (7).
Alimenti contro radicali
Un’alimentazione basata sull’apporto e il conseguente assorbimento di antiossidanti, è uno dei
fattori che possono contribuire a
mantenere nell’organismo un corretto livello di radicali liberi, rafforzando la naturale barriera antiossidante e riducendo lo stress
ossidativo.
Il potere antiossidante di un alimento può essere misurato con
diversi metodi, il più idoneo alla
valutazione dei complessi vegetali è stato ritenuto il test ORAC
(Oxygen Radical Absorbance Capacity) (8) che misura la capacità
scavenging dei composti antiossidanti di un campione alimentare
o biologico verso i radicali perossidici (ROO·), una delle più comuni specie reattive dell’ossigeno
(ROS) presenti nell’organismo.
In questo saggio viene misurata
la variazione dell’intensità della
fluorescenza di un marcatore nel
tempo, in seguito alla modifica, da
parte dei radicali, di tale marcatore.
I valori ORAC sono riportati in
termini di Trolox equivalenti per
grammo di prodotto (μmolTE/g).
È stato dimostrato che con un
incremento da 5 a 10 volte della
porzione quotidiana di frutta e
verdura, il valore ORAC del cibo
assunto aumenta da 1500 a 3500
unità. L’USDA (United States Department of Agriculture) considera la dose ottimale per la salute
una quantità giornaliera 3500
unità ORAC.
La misura antiossidante degli alimenti in vitro mostra spesso una
debole correlazione con l’attività
osservata in vivo. Girard-Lalancette e coll. (9) hanno infatti dimostrato come l’attività antiossidante misurata con saggio ORAC
risulti spesso sovrastimata rispetto ai valori ottenuti utilizzando
modelli sperimentali cellulari e
animali.
Blasa e colleghi hanno introdotto
un nuovo test per valutare la capacità antiossidante di molecole
di origine naturale in eritrociti
umani, denominato CAA-RBC ossia Cellular Antioxidant Activity-Red Blood Cells (10, 11).
L’utilizzo dei globuli rossi come
sistema sperimentale per l’attività
antiossidante è ampiamente giustificato dal forte coinvolgimento
di queste cellule nei pathway ossidativi.
Essendo gli eritrociti cellule anucleate e prive di mitocondri, il
test CAA-RBC non viene influenzato dalla produzione endogena
di ROS mitocondriali né dal contributo dei ROS alla trascrizione
genica e consente di misurare
l’attività antiossidante dei soli
composti in grado di attraversare
la membrana eritrocitaria (12).
Queste proprietà rendono l’eritrocita umano un sistema ideale
per lo studio dello stress ossidativo e l’emolisi indotta da fattori
ossidanti.
Il test CAA-RBC misura il grado
di ossidazione di una sonda intracellulare, la 2’,7’-diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA), in
presenza di sostanze che, in base
alla loro capacità antiossidante
sono in grado di esercitare un determinato livello di inibizione del
processo di ossidazione; la sonda
intracellulare diffonde all’interno
delle cellule e viene inizialmente
de-acetilata dalle esterasi intracellulari, successivamente l’aggiunta di AAPH (2,2’-azobis2-amidinopropano) genera specie reattive dell’ossigeno che agiscono
ossidando e convertendo la sonda
nel derivato fluorescente (DCF).
In seguito al trattamento con i
composti in studio, se l’azione del
generatore di radicali AAPH viene contrastata e quindi in seconda
istanza viene inibita la formazione
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del composto fluorescente, la sostanza testata risulterà avere una
capacità antiossidante, direttamente correlata alla fluorescenza misurata.
Il danno ossidativo a carico della
membrana dell’eritrocita generalmente causa un aumento della perossidazione lipidica, con alterazione della plasticità cellulare e della
funzionalità di enzimi e di recettori
di membrana, meccanismi che determinano danno cellulare, causando infine l’emolisi dell’eritrocita
(13). Alcune sostanze naturali sono
in grado di aumentare sia la resistenza della membrana all’insulto
ossidativo sia le proprietà antiossidanti endogene dei globuli rossi,
queste proprietà vengono misurate con il saggio di emolisi, basato
sull’induzione di emolisi ossidativa
dopo il trattamento con elevate
concentrazioni di AAPH che determina una rapida deplezione di tutto
il GSH intracellulare, nonché l’ossidazione delle proteine e dei lipidi di
membrana causando infine emolisi. Le sostanze in grado di ridurre o
inibire tale processo risultano avere capacità anti-emolitica (14)
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Contenuto totale di polifenoli
I polifenoli totali sono stati determinati con il metodo di Folin-Ciocalteu modificato da Singleton (15).
L’estratto naturale è stato miscelato con di reattivo di Folin-Ciocalteu 0.2 N e incubato al buio per 5
minuti. In seguito è stato aggiunto
carbonato di sodio 0.7 M (Na2CO3) .
Dopo 2 ore di incubazione a temperatura ambiente al buio, è stata misurata l’assorbanza allo spettrofotometro a una lunghezza d’onda di
760 nm. Il contenuto totale di polifenoli è stato infine espresso come
mg di acido gallico equivalenti per g
di peso secco (mg GAE/g).
Materiali e metodi
Contenuto totale di flavonoidi
I flavonoidi totali sono stati quantificati mediante il metodo colorimetrico del cloruro di alluminio modificato (16). Brevemente, l’estratto
naturale è stato miscelato con H2O
e NaNO2 al 5% e incubato 5 minuti a
temperatura ambiente. Successivamente è stato aggiunto AlCl3 al 10%,
e dopo un’incubazione di 6 minuti
la reazione è stata neutralizzata con
NaOH 1M. Dopo 30 minuti è stata
misurata l’assorbanza allo spettrofotometro a una lunghezza d’onda di
430 nm, la catechina è stata utilizzata come standard e la concentrazione finale di flavonoidi presente
nei campioni è stata espressa come
mg di catechina equivalenti per g
di peso secco (mg CE/g).
Preparazione dei campioni
Le foglie di Kavolì I e II (fornite dal
Consorzio Freschissimi, Campagna Lupia, Venezia, Italy) sono sta-
Contenuto totale di flavonoli
Il contenuto di flavonoli è stato
determinato con il metodo descritto da Romani e colleghi (17).
Lo scopo del nostro studio è stato
quello di determinare la quantità di
composti fenolici, flavonoidi e flavonoli, l’acido ascorbico, l’attività
antiossidante con saggio ORAC e
test CAA-RBC e infine l’attività anti-emolitica sul Kavolì.
Le analisi sono state effettuate su
estratti derivanti dalle foglie a due
diversi stadi di maturazione della
piantina di cavolo e perciò denominati in ordine di età crescente
rispettivamente Kavolì I (20 gg.) e
Kavolì II (40 gg.).
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te liofilizzate, polverizzate in azoto
liquido e infine sottoposte a un processo di estrazione.
I campioni di Kavolì (10 mg/ mL)
sono stati estratti in H2O per 12
ore in agitazione a 4 °C al buio e
in seguito centrifugati a 2300xg 10
minuti a 4 °C. L’estrazione è stata
effettuata in triplicato.
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Brevemente, agli estratti sono stati aggiunti EtOH al 10% HCl allo
0.1% in EtOH al 95% e HCl al 2%.
Dopo 30 minuti di incubazione a
temperatura ambiente, l’assorbanza della miscela di reazione è stata
misurata spettrofotometricamente
a una lunghezza d’onda di 360 nm
e la quercetina è stata utilizzata
come standard. La concentrazione
di flavonoli presenti nel campione
è stata espressa come mg di quercetina equivalenti per g di peso
secco (mg QE/g).
Dosaggio dell’acido ascorbico
La vitamina C presente nelle due
varietà di cavolo è stata dosata
mediante il saggio colorimetrico
di Jacota e coll. (18). Brevemente,
agli estratti è stato aggiunto TCA
(acido tricloroacetico) al 10% e in
seguito a una incubazione in ghiaccio di 5 minuti, i preparati sono
stati centrifugati. Successivamente il sovranatante è stato prelevato
e miscelato con acqua bi-distillata
e reattivo di Folin diluito 1:10.
Dopo 10 minuti di incubazione si
è proceduto alla lettura spettrofotometrica alla lunghezza d’onda di 760 nm e l’acido ascorbico
è stato utilizzato come standard.
La concentrazione di vitamina C
nei campioni viene espressa come
mg di acido ascorbico per g di peso
secco (mgAA/g).
Saggio ORAC
Il metodo di Cao e coll. (19) è stato
utilizzato con alcune modifiche. La
miscela finale di reazione contiene: fluoresceina 36 nM, campione
o Trolox 5μM diluiti in tampone
fosfato 0,075 M pH 7.4 e AAPH
40 mM. La fluorescenza è stata
letta a 37 °C con fluorimetro Perkin-Elmer VictorTM X3 (Waltham,
MA) a 510 nm di emissione e 485
nm di eccitazione, 60 cicli. Il valore ORAC corrisponde all’area
sotto la curva della fluoresceina
in presenza del campione e del
Trolox.
Il valore finale corrisponde all’area sotto la curva di fluorescenza
in presenza del campione o del
Trolox e viene espresso come μmoli di Trolox equivalenti per g di
peso del composto (μmoli TE/g).
Preparazione degli eritrociti
I campioni di sangue sono stati
raccolti in tubi trattati con EDTA
(ethylenediaminetetraacetic
acid) e centrifugati per 10 minuti
a 2300xg a 4 °C per rimuovere il
plasma, le piastrine e il buffy coat.
Gli eritrociti (RBC) sono stati
quindi diluiti in tampone fosfato.
Attività antiossidante cellulare
(CAA-RBC)
Gli eritrociti sono stati diluiti in
PBS e incubati 1 ora a 37 °C in
agitazione al buio, con la sonda
DCFH-DA alla concentrazione
finale di 15 μM e gli estratti di
Kavolì o lo standard (Trolox) a
diverse concentrazioni. Al termine dell’incubazione, gli eritrociti
sono stati lavati per rimuovere
l’eccesso di antiossidanti e risospesi in PBS freddo. Successivamente, alla sospensione cellulare
è stato aggiunto il generatore di
radicali AAPH a una concentrazione finale pari a 600 μM e la
fluorescenza è stata misurata mediante fluorimetro Perkin-Elmer
Victor X3 (Waltham, MA) a una
lunghezza d’onda di eccitazione
pari a 485 nm e 520 nm di emissione. Al termine delle letture
(12 cicli) la misura della fluorescenza prodotta è stata misurata
integrando l’area sotto la curva di
fluorescenza.
Analisi dell’attività
anti-emolitica
L’emolisi eritrocitaria è stata misurata con il metodo descritto da
Mikstacka et al. (20), utilizzando
come induttore di stress ossidativo la decomposizione termica
Tabella 1. Contenuto totale di polifenoli, flavonoidi, flavonoli e vitamina C e attività antiossidante
misurata in unità ORAC delle due varietà di Kavolì. **=p<0,01; ***=p<0,005; ****=p<0,0001.
Figura 1. Attività antiossidante misurata con il test CAA-RBC. *=p<0,05; **=p<0,01.
Figura 2. Attività anti-emolitica misurata con il test di emolisi. ***=p<0,005; ****=p<0,001.
dell’AAPH in radicali perossidici.
Una sospensione eritrocitaria al
5% è stata pre-incubata con Trolox o estratti di Kavolì a 37 °C
per un’ora in agitazione. In seguito, è stato aggiunto l’AAPH 50
mM e dopo 4 h di incubazione a
37 °C in agitazione, i campioni
sono stati centrifugati per 5 minuti e l’emolisi spontanea (bianco) e AAPH-indotta è stata valutata spettrofotometricamente a
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LABORATORIO
una lunghezza d’onda di 540 nm
come emoglobina rilasciata nel
sovranatante.
Il livello di emolisi misurata nei
campioni è espresso come percentuale rispetto al controllo.
Analisi statistica
Tutti i dati sono riportati come
media statistica di tre esperimenti indipendenti ± deviazione
standard. Per valutare se i parametri antiossidanti determinati
in Kavolì I e Kavolì II differiscono
in maniera significativa è stato
applicato il test t di Student. In
presenza di più punti sperimentali (CAA-RBC ed emolisi) è stato utilizzato il test ANOVA a una
via per l’analisi della varianza.
Le differenze risultano statisticamente significative per p<0,05.
Risultati
La Tabella 1 mostra i livelli di
polifenoli, flavonoidi, flavonoli
totali e vitamina C, nonché l’attività antiossidante risultante
dal test ORAC nei tipi di cavolo.
Tutti i risultati riportati mostrano livelli più elevati del Kavolì
I rispetto al II, in particolare i
polifenoli, i flavonoidi e la vitamina C, sebbene presenti in
elevate quantità in entrambe le
tipologie di ortaggio, risultano
significativamente più alti nelle foglie del tipo più giovane di
Kavolì (p<0,001 per i polifenoli;
p<0,0001 per i flavonoidi e la vitamina C). Il livello di flavonoli
risulta in entrambi i casi piuttosto basso, ma anche qui si può
sottolineare una differenza statisticamente significativa tra il
Kavolì I e il II (p<0,001).
Per quanto riguarda i risultati
del Test ORAC, i dati ottenuti
sono in linea con quelli presenti in letteratura relativi ad altri
tipi di Brassicacaee. Il Kavolì I
risulta avere una maggiore atti-
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vità antiossidante in termini di
unità ORAC, rispetto al Kavolì II
(p<0,05).
I risultati dal test CAA-RBC sono
riportati nella Figura 1 come area
sotto la curva di fluorescenza; il
livello di fluorescenza intracellulare degli eritrociti in questo
test risulta essere un indice della capacità antiossidante cellulare del composto. Negli eritrociti
trattati con Kavolì sia I che II è
stato osservato un significativo
decremento della fluorescenza intracellulare rispetto alle cellule di
controllo (rispettivamente p<0,01
e p<0,05). Il trattamento con Kavolì I ha prodotto risultati sovrapponibili al trattamento con un antiossidante standard, il Trolox alla
concentrazione di 100 μM.
La Figura 2 mostra i risultati del
test di emolisi, riportati come
percentuale di emolisi rispetto al
controllo.
È interessante osservare come
gli eritrociti trattati con Kavolì
mostrino una maggiore e significativa resistenza all’emolisi eritrocitaria, paragonabile a quella
indotta dal trattamento con la
concentrazione più alta dello
standard antiossidante (Trolox
500 μM). Il Kavolì I risulta più
efficiente nel proteggere i globuli
rossi dall’emolisi indotta dall’AAPH (p<0,0001), rispetto al Kavolì II (p<0,0005).
In conclusione le due tipologie
di Kavolì mostrano elevati livelli
di polifenoli e flavonoidi, componenti che sicuramente giocano
un ruolo fondamentale nella forte attività antiossidante di queste
sostanze, attività valutata sia con
saggio ORAC che con est CAA-RBC. Il Kavolì I e il Kavolì II risultano efficaci agenti protettivi nei
confronti dell’emolisi eritrocitaria.
In tutti i test sperimentali effettuati è risultato che il Kavolì I,
che rappresenta lo stadio più immaturo del cavolo in oggetto, ha
mostrato livelli più elevati di fitochimici a testimoniare una perdita progressiva delle componenti
antiossidanti con l’avanzare della
crescita e della maturazione della
pianta.
Un’alimentazione corretta rappresenta probabilmente il più efficace strumento a nostra disposizione per affrontare e vivere al
meglio i rischi legati alla salute e
all’ambiente; tra gli alimenti sani,
le Brassicaceae sono un’ottima
fonte di composti nutrienti e benefici, con l’unico ostacolo rappresentato dal sapore deciso che
queste assumono una volta cotte,
che spesso non viene apprezzato
dai consumatori. In questo scenario, il Kavolì, edibile in forma
cruda alla stregua di un’insalata,
può rappresentare una valida e
importante alternativa; inoltre
i risultati ottenuti in questo studio dimostrano un elevato potere
antiossidante e anti-emolitico di
questo cavolo, in grado quindi di
sopperire a due importanti richieste dei consumatori/amanti della
buona tavola: gusto e salute.
* Istituto di Biologia e Biotecnologia
Agraria, CNR, PISA
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