epigenetica File - Progetto e

29/04/16
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CHE COS’E’ L’EPIGENETICA?
DAL GRECO “epi” (sopra)
EPIGENETICA: “SOPRA” LA GENETICA, ovvero “SOPRA” IL DNA
“the study of mitotically and/or meiotically heritable changes in gene expression not caused by changes in the DNA sequence” (Feinberg and Tycko, 2004). 1
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Punti chiave: •  L’espressione genica può venire alterata dall’ambiente, compreso l’ambiente sociale. •  le alterazioni dell’espressione genica posssono essere trasmesse alle generazioni successive (senza variazioni nel DNA) •  L’epigenetica può aiutare a comprendere alcune patologie •  Nuovo importante campo nella ricerca medica concetti cardine dell'evoluzione ambiente-­‐genotipo-­‐fenotipo GENOTIPO insieme dei geni di un organismo FENOTIPO insieme dei caratteri di un organismo A
Genotipo
Ambiente
Perturbazioni
Casuali
B
I
II
Norma di reazione di A agli ambienti I e II
Fenotipo 1
Fenotipo 2
Fenotipo 3
Fenotipo 4
Fenotipo 5
Fenotipo 6
Fenotipo 7
Fenotipo 8
Fenotipo 9
Fenotipo 10
Norma di reazione di B agli ambienti I e II
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"La differenza fra genetica ed epigenetica può essere paragonata alla differenza che passa fra leggere e scrivere un libro. Una volta scritto il libro, il testo (i geni o le informazioni memorizzate nel DNA) sarà identico in tutte le copie distribuite al pubblico. Ogni lettore potrà tuttavia interpretare la trama in modo leggermente diverso, provare emozioni diverse e attendersi sviluppi diversi man mano che affronta i vari capitoli. Analogamente, l'epigenetica permette interpretazioni diverse di un modello fisso (il libro o il codice genetico) e può dare luogo a diverse letture, a seconda delle condizioni variabili con cui il modello viene interrogato".
Thomas Jenuwein (Max-­‐Planck-­‐Institut für Immunbiologie, Freiburg, Germania) Teorie dell’evoluzione Jean-­‐Baptiste Lamark 1744-­‐1829 Charles Darwin 1809-­‐1882 3
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Darwin: selezione naturale Le mutazioni genetiche casuali sono trasmesse alle generazioni successive I geni necessari per le caratteristiche più utili diventano più frequenti nelle generazioni successive contribuendo in misura maggiore al fenotipo Lamarck: •  L’ambiente influenza il fenotipo •  Ereditarietà di caratteristiche acquisite Two views about the type of mechanism that promotes evolution: According to Lamarck's theory, acquired characteristics can be passed to subsequent generations. According to Darwin's (and Wallace's) theory of natural selection, a population of giraffes will have individuals with variations in neck length. If having a longer neck is advantageous in feeding, longer necked giraffes will be more successful and reproduce more. 4
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Science
7 April 2000:Vol. 288. no. 5463, p. 38
Was Lamarck Just a Little Bit Right?
Michael Balter
Although Jean-Baptiste Lamarck is remembered mostly for the discredited theory that
acquired traits can be passed down to offspring, new findings in the field of epigenetics, the
study of changes in genetic expression that are not linked to alterations in DNA sequences,
are returning his name to the scientific literature. Although these new findings do not
support Lamarck's overall concept, they raise the possibility that "epimutations," as they
are called, could play a role in evolution.
Lamarck was a true pioneer of evolutionary theory!
Come si spiega la grande differenza fenotipica tra gli individui? ...e la differenziazione cellulare? Le cellule di uno stesso individuo: stesso genoma differenti fenotipi differenti profili di espressione 5
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Tutte le cellule provengono da uno zigote E contengono lo stesso identico DNA. MA: solo 10-­‐20% dei geni sono attivi nelle cellule differenziate Le cellule si differenziano SOLO quando processi epigenetici cruciali accendono/spengono i giusti geni La differenziazione cellulare dipende da variazioni, che si realizzano nello sviluppo, nell’espressione dei geni piuttosto che da modificazioni nella sequenza dei nucleotidi. Il mantenimento stabile, attraverso mitosi, è sotto controllo epigenetico. Stimoli esterni Ambiente EPIGENOMA
fattori di trascrizione 6
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13 Maher et al. (2009)
environment
Health tip
Obesity doesn’t run in family. The
main problem is nobody runs in the
family
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Gene-Environment Interactions
How large
is the
overlap?
Epigenetics is “the study of mitotically and/or meiotically heritable changes in
gene expression not caused by changes in the DNA sequence” (Feinberg and Tycko,
2004).
chemical modification of
GENES by the ENVIRONMENT
(Switching genes on & off)
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Genetics vs Epigenetics
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Epigenetic Mechanisms
Epigenetic mechanisms and endocannabinoid signalling
C. D’Addario et al.
DNA methyla on
Ac ve
M M M
M M
X
Inac ve
Exons
M
CpG island
Methylated cytosines
Histone modifica ons
Ac
Me
Ac
Me
Me
Me
Ac
Me
H3K9ac/H4K5ac
Me H3K4me3/H3K3me3
Me
DNA
Me H3K9me3/H3K27me3
X
DNA
nucleosome
nucleosome
DNA
micro RNAs
miRNA
mRNA
mRNA degrada on
transla onal repression
miRNA binding site
Fig. 2. Epigenetic mechanisms able to modify chromatin structure. DNA methylation is the covalent modification
of cytosine
residues
D’Addario
et al.,
2013in
CpG dinucleotides within gene sequences, and leads to transcriptional silencing. Unlike DNA methylation, histone modifications can lead to
either activation or repression of gene transcription, depending upon which residues are modified and which modifications take place. The
N-terminal tails of histones can undergo a variety of post-translational covalent modifications, including methylation and acetylation. Noncoding RNAs include microRNAs (miRNAs) that are small, ~22 nucleotides long, RNAs that regulate gene expression through posttranscriptional silencing of target genes. Sequence-specific base pairing of miRNAs with 3′ UTRs of messenger RNAs results in target
degradation or inhibition of translation.
suppression of gene transcription [53,54]. The mechachromatin structure and transcription is driven by
nism responsible for gene silencing starts with recruitpost-translational modifications of the core histones,
ment of methyl-DNA binding proteins (i.e. MeCP2)
primarily in the N-terminal tails [61], that include acetby methylated DNA. These in turn will recruit histone
ylation, methylation, phosphorylation, ubiquitination,
deacetylases (HDACs) that remove acetyl groups from
ADP addition and ribosylation [62]. It is now well
histone proteins and chromatin-remodelling complexes.
established that distinct histone modifications, occurAll these events cooperate in compacting chromatin
ring at Meccanismi selected residues
and different
times, on one or
epigenetici: DNA NUCLEO structure and thus
limiting the accessibility to tranmore tails, provide a ‘histone code’ that mediates discontrollo a lungo raggio mediante scriptional machinery. It should also be noted that
tinct downstream
events
[63–66].
rimodellamento della struttura della controllo trascrizionale: legame di cromatina DNA methylation
does
not
occur
exclusively
at
CpG
One
of
the
most
frequent
epigenetic modifications is
fattori trascrizionali tessuto specifici, islands. In legame fact, recently
methylahistone acetylation, associated with transcriptional
diretto di tissue-specific
ormoni, fattori DNA
di tion has been
found
at CpG
islanddi shores,
outlyingTrascritto activation
[64] and occurring at different positions of
primario crescita a elementi responsivi geni areas closeinducibili to CpG islands (up to 2 kb distance), and(precursore) histone H3 lysines (K9, K14, K18 and K23) and of
controllo post-­‐K8,
trascrizionale: strongly related to gene expression inactivation [58,59].
histone
H4 (K5,
K12 and K16) [61,67]. Acetylasplicing lternativo, polyA alternativo tion
and adeacetylation
depend
on the balance between
histone acetyltransferases and HDAC activities. Unlike
Histone modifications
histone acetylation, histone methylation may be either
mRNA Genomic DNA is packaged into a highly compact
activating or repressing gene expression, mainly
controllo del structure to form chromatin. The basic repeating units
depending
ontrasporto the sites of methylation [68] (Fig. 2).
CITOPLASMA of eukaryotic chromatin are the nucleosomes, comFor example, K9 and K27 methylations of H3 are
posed of short stretches of DNA (147 bp) wrappedmRNA associated with transcriptional silencing, whereas
and
around a core of histone proteins (H3,controllo H4, H2A
methylations
of K4,
K36 and K79 of H3 have been
controllo della stabilità traduzionale H2B, each in two copies) [60] and joined
together by
linked to gene activation [68,69]. Histone methylation,
traduzione degradazione linker DNA and linker histone H1. Regulation of
a relatively stable (and once thought to be irreversible)
Esistono molteplici livelli di regolazione dell’espressione genica negli eucarioti 1908
PROTEINA FEBS Journal 280 (2013) 1905–1917 ª 2013 The Authors Journal compilation ª 2013 FEBS
controllo post-­‐traduzionale PROTEINA attiva o inattiva 10
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Modificazioni epigenetiche Metilazione del DNA
La 5a Base… mCpG Modificazioni istoniche Variazioni stabili del DNA o degli istoni che influenzano l’espressione genica, ma non consistono in variazioni della sequenza del DNA Metilazione del DNA metilazione dei residui
di citosina del DNA alla
posizione del carbonio 5 generalmente associata
a repressione della
trascrizione.
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METILAZIONE DEL DNA NEI VERTEBRATI
MECCANISMO DI AZIONE DELLE DNMT
de novo
ex novo
Mantenimento della metilazione
e trasmissione alle cellule figlie
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Il quadro di metilazione del DNA viene ereditato Una volta stabilito, lo schema di metilazione viene mantenuto ad opera di DNA-­‐metil transferasi (DNMT1) che hanno particolare affinità per le sequenze emi-­‐metilate: tendono quindi a metilare il nuovo filamento che si è formato su uno stampo metilato. -> mantenimento del pattern di metilazione
(modificazione epigenetica - memoria cellulare)
Quali regioni sono bersaglio della metilazione? • Nel genoma umano la frequenza della sequenza 5’ CpG è inferiore del 20 % rispetto all’attesa • I geni dei vertebrati attivamente trascritti sono marcati al 5’ da ISOLE CpG “regione di almeno 200 bp con una percentuale di GC maggiore del
50% e con un rapporto di CpG osservati/attesi maggiore del 60%”
•  Nel genoma umano il 50 % dei geni sono associati a isole CpG: tutti i geni housekeeping ed il 40 % dei geni con espressione tessuto-­‐specifica •  I geni tessuto-­‐specifici sono metilati in CpG nei tessuti dove non sono espressi 13
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modificazioni riguardanti la metilazione del DNA è regolata durante lo sviluppo. per ristabilire
l’imprinting nelle nuove
cellule somatiche
necessita l’intervento di
Dnmt3a e Dnmt3b
Per ogni embrione che si forma, l'imprinting viene azzerato e ristabilito, poiché subito dopo la fecondazione l’intero genoma subisce un’onda di demetilazione (ad opera di enzimi Demetilasi) Fino a poco tempo fa si credeva che il pattern dell’epigenoma si stabilizzasse nelle prime fasi dello sviluppo fetale Ma da studi recenti si è visto che esso cambia in risposta all’ambiente per tutta la vita dell’individuo. 14
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Author Statement •  “We found that, although twins are epigenetically indistinguishable during the early years of life, older monozygous twins exhibited remarkable differences in their overall content and genomic distribution of 5-­‐methylcytosine DNA and histone acetylation, affecting their gene-­‐expression portrait.” Metilazione e regolazione genica • Dnmt metilano il DNA • Il DNA metilato è legato da proteine che legano il metile (MeCP2, MBD1-­‐4) • Queste a loro volta sono in grado di reclutare diverse HDAC repressione della trascrizione HDAC 15
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La 5-metilcitosina nelle sequenze CpG può essere
deaminata e mutata in Timidina
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Modificazioni degli Istoni I residui amminoacidici all’N-­‐terminale di ciascun istone (20-­‐60 residui) si estendono al di fuori della superficie del nucleosoma. Queste regioni sono particolarmente ricche in lisina (K) che può essere reversibilmente modificata mediante acetilazione, fosforilazione e metilazione.
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MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI DEGLI ISTONI
5F3
Modificazioni degli istoni H3 e H4 La lisina 9 di H3 può essere sia acetilata che metilata. L’acetilazione è associata alla cromatina trascrizionalmente attiva, ma se la regione cromatinica viene metilata a livello del DNA (CpG), le proteine che si legano al DNA metilato richiamano le deacetilasi istoniche, che rimuovono i gruppi acetile e le metil transferasi istoniche, legate alle CpG binding protein, metilano gli istoni. Il risultato è la condensazione della cromatina. 18
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IL CODICE ISTONICO
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L’acetilazione degli istoni è associata alla decondensazione della cromatina 19
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Repressori e attivatori possono dirigere la deacetilazione/acetilazione degli istoni a livello di specifici geni L’interferenza dell’RNA (o RNAi) Ė una forma di “silenziamento” genico mediata da un doppio filamento di RNA (dsRNA). In pratica… Ė un processo in cui un doppio filamento di RNA segnala la degradazione di un RNA messaggero omologo. 20
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Scoperta dell’ RNAi nel nematode Cenorabditis Elegans •  Nel 1998 Fire e Mello hanno osservato che l’RNA ds (a doppio filamento) e’ molto piu’ efficace dell’RNA anti-­‐senso a singolo filamento nel sopprimere l’espressione del gene bersaglio. L’osservazione è nata da quello che nell’intenzione degli autori doveva essere un controllo negativo! •  hanno quindi testato su diversi geni gli effetti di molecole purificate senso o anti-­‐senso, singolarmente oppure in combinazione. Andrew Z. Fire Craig C. Mello 21
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Schema riassuntivo del controllo dell’espressione genica cambiamenti EPIGENETICi
Ambiente interno:
–  ormoni
–  metabolismo
–  sesso
–  età
Ambiente esterno:
–  temperatura
–  dieta
–  farmaci
–  Sostanze chimiche
(inquinamento)
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Epigenetic diseases
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• Sindrome di Rett
Aberrante metilazione DNA (MECP2)
•  Sindrome di Rubinstein-Taybi
• Angelman/Prader-Willi
• Sindrome di Silver-Russell
Perdita della acetil-transferasi
istonica
Delezione, disomia uniparentale
paterna, difetto di imprinting
Nel 30% dei casi ipometilazione gene H19
GENOMIC IMPRINTING
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Epigenetica e alimentazione
Esperimenti su topi femmine
agouti incinte
alimentazione a base di alimenti
con donatori di metili (aglio, cipolla,
barbabietole)
Gene agouti:
tipicamente la progenie è identica
ai genitori nella maggior parte dei
casi
PELO GIALLO, OBESITA’, PRED.
CANCRO e DIABETE
La progenie di topi femmine
alimentate in questo modo
presentavano fenotipi normali
marroni e minor predisposizione
alle malattie, con una vita media
più lunga rispetto al controllo.
Le madri passano alle progenie il gene
aguti intatto, ma il pattern di
metilazione cambiato ne oscura gli
effetti deleteri (R.Jirtle & R.Waterland,
2000)
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Studi su relazioni materne e ambientali delle prime fasi dello
sviluppo e assetto dell’asse dello stress dei giovani ratti
Cuccioli allevati da madri poco premurose rispetto ad altri allevati da
madri premurose, presentavano ipermetilazione del recettore per i
glucocorticoidi (GR) e alterata acetilazione
Nello sviluppo questi animali presentavano una alterazione della risposta
allo Stress rispetto a ratti allevati con maggiore cura
le femmine di animali, allevati da madri poco amorevoli, presentavano lo
stesso epigenoma delle madri e quindi riproducevano lo stesso
comportamento poco amorevole sui loro figli
licking/grooming (LG)
Arched-Back Nursing (ABN)
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Epigenetica e cancro Il pattern di metilazione dei geni è alterato nelle cellule tumorali, e la metilazione alle isole CpG di certi geni è associata al loro silenziamento specifico con regolazione aberrante di geni coinvolti nel controllo del ciclo cellulare, del differenziamento e/o dell’apoptosi 28
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HAT/HDAC
HAT (Istone acetiltransferasi):
• Geni codificanti per diverse HAT si trovano
traslocati, amplificati, sovraespressi e/o mutati
in diversi tumori
HDAC (istone deacetilasi):
• coinvolgimento in linfomi e leucemia acuta
mieloide dimostrata
Oncogeni: geni che possono causare il cancro quando espressi in modo eccessivo o inappropriato In genere: geni che stimolano la crescita cellulare Oncosoppressori: geni la cui mancanza (per delezione o mutazione) può causare il cancro In genere: geni che reprimono la crescita o causano la morte cellulare quando i geni oncosoppressori sono metilati, il tumore darà origine a metastasi. Allo stesso modo quando geni oncogeni sono demetilati, questi causano la crescita del tumore. 29
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Epigenetic drugs
Roadmap Epigenomics Project: un progetto da 170 milioni di dollari per identificare e mappare dei marcatori epigenomici sta effettuando il primo consistente rilascio di dati. 30
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Analisi dell’epigenoma • I principali marcatori epigenetici possono ora essere interrogati in maniera comprensiva combinando tecniche cellulari, biochimiche e molecolari con next generation sequencing (NGS). • La produzione di mappe genomiche della metilazione della citosina, delle modificazioni istoniche, dell’accessibilità della cromatina e dell’espressione dei trascritti permette di analizzare lo stato di regolazione del genoma di un tipo cellulare di interesse. DNA methylation analysis by pyrosequencing
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Histone modifications
by Chromatin
Immunoprecipitation
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