FUNZIONI PRINCIPALI DEL RE ACCESSO DELLE PROTEINE NEL PATHWAY SECRETORIO ACQUISIZIONE DELLA TOPOLOGIA DELLE PROTEINE DI MEMBRANA FORMAZIONE DI PONTI DISOLFURO AGGIUNTA E RIELABORAZIONE DI OLIGOSACCARIDI (GLICOSILAZIONE) CONTROLLO DI QUALITA’ OPPORTUNI TAGLI PROTEOLITICI ASSEMBLAGGIO DI PROTEINE MULTIMERICHE FORMAZIONE DI PONTI DISOLFURO IgG Ponti disolfuro GLUTATIONE (GSH) è un tripeptide costituito da glicina e cisteina, legate da un normale legame peptidico, e acido glutammico che è legato alla cisteina con un legame peptidico atipico tra il gruppo carbossilico della sua catena laterale ed il gruppo amminico della cisteina. G-SH G-SH GS-SG Forma ridotta Forma ossidata Nel citoplasma la formazione dei ponti disolfuro non può avvenire perché il rapporto GSH:GSSG è di 50:1. Il glutatione ridotto, infatti, serve a prevenire la formazione di ponti S-S. Gli alti livelli di GSH sono assicurati dalla glutatione reduttasi citosolica. Nel reticolo questo rapporto cambia e si ha la formazione dei ponti disolfuro. Se si formano ponti inesatti interviene la proteina disolfuro isomerasi (Protein Disulfide Isomerase, PDI). Nel sistema compartimentale RE->Golgi alcune proteine diventano glicoproteine. Avviene, cioè, una delle più importanti modificazioni delle proteine: la GLICOSILAZIONE. La GLICOSILAZIONE, è il processo con il quale una catena oligosaccaridica viene legata covalentemente ad un peptide (glicoproteine) o ad un lipide (glicolipidi). Una catena oligosaccaridica è costituita da monosaccaridi legati covalentemente. Queste catene vengono formate grazie a glicosiltransferasi. I monosaccaridi sono l’unità strutturale di base di tutti i glicani Un monosaccaride è un carboidrato che non può essere idrolizzato in unità più semplici. Un monosaccaride è chimicamente un’idrossi-aldeide o un idrossi-chetone La gliceraldeide è il più semplice aldoso e il diidrossiacetone il più semplice chetoso La gliceraldeide può essere considerata il precursore di numerosi aldosi Il diidrossiacetone può essere considerato il precursore di numerosi chetosi (Glc) (Gal) (GlcNAc) (Man) (GalNAc) LEGAME GLICOSIDICO + H2O Le catene oligosaccaridiche possono essere N-linked O-linked N-LINKED: aggiunti alle Asn che fanno parte di una sequenza-segnale denominata glicone costituita da Asn-X-Ser/Thr (X: tutti gli aa, esclusa la prolina). La sintesi ha inizio nel RE e la rielaborazione continua nel Golgi. O-LINKED: aggiunti a livello di ser o thr. La sintesi avviene nel Golgi. SINTESI DEGLI N-LINKED Gli oligosaccaridi di tipo N-linked vengono aggiunti cotraduzionalmente a partire da un precursore comune assemblato nel RE. I monosaccaridi utilizzati per la polimerizzazione sono attivati. CORE PENTASACCARIDICO (2GLCNAC + 3MAN) GLICOSILTRANSFERASI: nota Le glicosiltransferasi agiscono sequenzialmente, in maniera tale che il prodotto di un enzima risulta essere il substrato per l’azione di un’altra transferasi. Il risultato è una catena lineare e/o ramificata di monosaccaridi legati l’uno all’altro. “one enzyme–one linkage” hypothesis (Saul Roseman et al.): ciascun legame glicosidico è prodotto da un singolo enzima. OST (oligosaccaril-transferasi): trasferisce il precursore degli oligosaccaridi Nlinked in blocco sulla proteina in corrispondenza del glicone. Il precursore viene rielaborato nel RE prima di essere passato all’apparato di Golgi. CONTROLLO DI QUALITÀ NEL RETICOLO ENDOPLASMATICO • Calnexina e calreticulina • glucosidasi II • glucosiltransferasi Il ciclo di deglucosilazione e riglucosilazione continua finché la proteina non raggiunge il corretto ripiegamento. Controllo di qualità delle proteine nel reticolo endoplasmatico Rappresentazione schematica di una proteina ancora in sintesi nel reticolo endoplasmatico a cui è stata legata una catena oligosaccaridica N-linked precursore in cui sono evidenziati i tre glucosi terminali (triangoli viola). La N-glicosilazione è cotraduzionale. Modificazione degli N-linked nell’apparato di Golgi MANNOSIDASI MANNOSIDASI, GLCNAC TRANSFERASI, FUCOSILTRANSFERASI GALATTOSIL-TRANSFERASI, SIALIL-TRANSFERASI CATENE OLIGOSACCARIDICHE N-LINKED COMPLESSE IBRIDE ALTO MANNOSIO MAN6P: INDIRIZZO PER I LISOSOMI Nelle proteine lisosomiali, come la catepsina b, esistono dei segmenti segnale (tratti in rosso) che vengono riconosciuti da precisi siti di riconoscimento presenti nell’enzima N-acetilglucosammina fosfotransferasi dell’apparato di Golgi. Una volta che il legame fra segmenti segnale e siti di riconoscimento è avvenuto, la fosfotrasferasi trasferisce una N-acetilglucosammina fosfato alla catena oligosaccaridica della proteina lisosomiale. Successivamente viene rimossa l’N-acetilglucosammina e resta così un mannosio 6-fosfato terminale che costituisce il segnale per le proteine lisosomiali. I residui di mannosio 6-fosfato costituiscono l’indirizzo per le proteine che devono andare ai lisosomi. MOLECOLA DI CLATRINA Triskelion di clatrina al microscopio elettronico dopo ombreggiatura con platino (riprodotta con autorizzazione da Macmillan Publisher Ltd: Nature, E. Ungewickell e D. Branton, Assembly units of clathrin coats, ©1981). Clathrin- coated vesicles Canestri di clatrina visti dopo colorazione negativa La freccia indica il centro di un esamero di clatrina (triskelion). ×280.000 (riprodotta da The Journal of Cell Biology, 1981, 91: 790-7, R.A. Crowther e B.M. Pearse, Assembly and packing of clathrin into coats). Per la polimerizzazione della clatrina è necessario l’intervento di ARF quale proteina legante il GTP. MECCANISMI DEI TRE DIVERSI TIPI DI ENDOCITOSI pseudopodi Fagocitosi (a), pinocitosi (b) ed endocitosi mediata da recettori (c) FAGOCITOSI Microfotografia al microscopio a scansione di un macrofago murino che sta fagocitando due globuli rossi danneggiati. Le frecce mostrano le estremità di sottili processi del macrofago (pseudopodi) che si estendono come un collare per inglobare i globuli rossi. (Courtesy of Jean Paul Revel.) Macrofago al microscopio elettronico che sta fagocitando un globulo rosso (GR). RER, reticolo rugoso; L, lisosomi; P, pseudopodi. ×11.000 La fagocitosi prevede un riconoscimento specifico da parte di una cellula specializzata. Il fagosoma si fonde con il lisosoma formando un fagolisosoma che degrada le macromolecole. PINOCITOSI La pinocitosi non prevede un riconoscimento specifico. La cellula incorpora in vescicole il fluido extracellullare e alcune molecole in esso disciolte. ENDOCITOSI MEDIATA DA RECETTORI L’endocitosi mediata da recettori è un processo specifico in cui la molecola che viene incorporata deve prima essere riconosciuta da un recettore. ENDOCITOSI MEDIATA DA RECETTORI Nell’endocitosi mediata da recettori le vescicole rivestite di clatrina si formano per invaginazione della membrana plasmatica. Un esempio è rappresentato dall’incorporazione delle LDL. particella di LDL (Low Density Lipoprotein, lipoproteina a bassa densità) ENDOCITOSI MEDIATA DA RECETTORI Fotografie al microscopio elettronico a trasmissione di quattro fasi dell'endocitosi di particelle lipoproteiche di tuorlo nell'oocito di pollo. Le particelle lipoproteiche legate ai recettori formano la zona densa e ispessita legata alla zona concava della fossetta, mentre la zona densa e ispessita sul lato convesso rappresenta il rivestimento di clatrina. La fossetta diviene sempre più profonda (a, b), per poi chiudersi (c) e infine distaccarsi (d) formando una vescicola rivestita (da M.M. Perry e A.B. Gilbert, Yolk transport in the ovarian follicle of the hen (Gallus domesticus): lipoproteinlike particles at the periphery of the oocyte in the rapid growth phase, J Cell Sci 39: 257-72, 1979). ENDOCITOSI MEDIATA DA RECETTORI Al pH neutro del sangue la transferrina (Tf) lega lo ione ferro (Fe) formando il complesso ferrotransferrina (Fe-Tf) che viene legato dai recettori per la transferrina (TfR) ed endocitato. All'interno dell'endosoma l'intervento delle pompe protoniche acidifica l'ambiente fino al valore di pH 5; questo provoca il rilascio del ferro dalla transferrina. Attraverso specifici canali di membrana il ferro passa al citosol, mentre il recettore rilascia la transferrina ormai scarica. La successiva esocitosi riporta il recettore in superficie, dove la transferrina, trovandosi di nuovo a pH neutro, può legare altro ferro per iniziare un nuovo ciclo. Apo-Tf, apotransferrina. Gli oligosaccaridi di tipo O-LINKED vengono aggiunti in maniera posttraduzionale uno per volta nell’apparato di Golgi. Nel Golgi ci sono proteine trasportatrici specifiche per i monosaccaridi attivati che dal citoplasma vengono trasportati nel lume delle cisterne. I GRUPPI SANGUIGNI: UN ESEMPIO DI O-GLICOSILAZIONE L’enzima fucosiltransferasi aggiunge un fucosio ad un precursore prodotto ad opera di altri enzimi con formazione dell’ANTIGENE H (gruppo sanguigno 0). Proteggono il polipeptide dall’azione delle proteasi RUOLO STRUTTURALE DEGLI OLIGOSACCARIDI Favoriscono il corretto ripiegamento della proteina Mediano l’interazione proteina-proteina RUOLO BIOLOGICO DEGLI OLIGOSACCARIDI VIRUS sono ligandi specifici di recettori esogeni e mediano l’interazione con BATTERI PARASSITI INTERAZIONI CELLULAMATRICE sono ligandi specifici di recettori endogeni e mediano INTERAZIONI CELLULACELLULA TRAFFICO INTRACELLULARE (ENZIMI LISOSOMIALI)