La spettrometria di massa è una metodica che
consente l’identificazione e l’analisi quantitativa di
una molecola dalla sua massa.
Si sfruttano due fenomeni correlati alla massa ed
alla carica.
1) la traiettoria di uno ione o di una particella carica in
movimento può essere modificata per azione di un
campo magnetico od elettrico, e l’entità della deviazione
è funzione del rapporto massa/carica della particella: a
parità di carica, particelle di massa minore subiranno
deviazione maggiore.
2) ioni o particelle cariche, accelerati da un campo
elettrico, assumo velocità diverse in dipendenza della
loro massa: a parità di carica, particelle di massa
maggiore assumono velocità minore.
Gli spettrometri di massa di prima generazione
sfruttavano unicamente il primo fenomeno;
attualmente sono disponibili strumenti che si
basano sul primo o sul secondo fenomeno.
Spettrometria di massa atomica (analisi
qualitativa e quantitativa di sostanze inorganiche).
Spettrometria di massa molecolare per l’analisi di
sostanze organiche.
Attualmente la spettrometria di massa costituisce
una metodica largamente diffusa per lo studio di
molecole e macromolecole di interesse biologico,
quali amminoacidi, glicidi, lipidi, proteine ed acidi
nucleici.
Uno spettrometro di massa separa gli atomi o le
molecole secondo uno dei principi indicati, ma per
poter essere separati atomi e molecole devono avere
una carica, devono cioè essere ionizzate. Inoltre,
devono essere allo stato gassoso.
Tappe fondamentali del processo d’analisi:
1. ionizzazione delle molecole in esame, cioè la
trasformazione in uno o più ioni, in genere con
carica positiva;
2. accelerazione degli ioni per immissione in un
campo elettrico;
3. separazione degli ioni con massa diversa;
4. rivelazione dei diversi ioni formatisi e la
conseguente determinazione della loro massa.
Componenti fondamentali:
1. camera di ionizzazione per produrre ioni;
2. un campo elettrico per accelerare gli ioni
prodotti;
3. un analizzatore di massa, che utilizzando un
campo magnetico e/o un campo elettrico,
separa gli ioni di massa diversa;
4. un rivelatore, che raccoglie gli ioni generando
un impulso quantificabile e registrabile.
La formazione di ioni di campione in fase gassosa è un pre-requisito essenziale
per i processi di separazione e di rivelazione tipici in uno spettrometro di
massa. Fino a non molto tempo fa gli spettrometri di massa richiedevano il
campione in fase gassosa, ma grazie agli sviluppi più recenti, l’applicabilità
della spettrometria di massa è stata estesa fino a includere anche campioni in
fase liquida o inglobati in una matrice solida. Il campione, che può essere
solido, liquido o gassoso, viene introdotto in una camera da vuoto mediante un
opportuno sistema di introduzione. In dipendenza del tipo di sistema di
introduzione e della tecnica di ionizzazione utilizzata, il campione può già
esistere in forma ionica in soluzione, oppure esso può essere ionizzato di
concerto con la sua volatilizzazione o mediante altri metodi nella sorgente
ionica. Gli ioni prodotti, che si trovano in fase gassosa, vengono separati
nell’analizzatore sulla base del loro rapporto massa/carica (m/z), e vengono
raccolti da un rivelatore. Nel rivelatore essi generano un segnale elettrico
proporzionale al numero di ioni presenti. Il sistema di elaborazione dati
registra questi segnali elettrici in funzione del rapporto m/z e li converte in uno
spettro di massa.
Sono state sviluppate nel tempo diverse
modalità di ionizzazione, che rappresentano il
principale elemento di differenziazione tra le
varie metodiche e tra le diverse strumentazioni
attualmente impiegate.
La sorgente di ionizzazione al plasma trova
applicazione essenzialmente nella
spettrometria di massa atomica, le altre
metodiche nella spettrometria molecolare, e si
possono suddividere in tecniche hard e soft.
Principali modalità di ionizzazione
Ionizzazione al plasma
ICP
Inductively Coupled
Plasma
Impatto elettronico
EI
Electronic Impact
Ionizzazione chimica
CI
Chemical Ionization
FAB - FIB
Desorbimento di ioni
PD
MALDI
Evaporazione ionica
Fast Atom/Ion
Bombardament
Plasma Desorption
Matrix Assisted Laser
Desorption Ionization
TSI
Thermo Spray
Ionization
ESI
Electro Spray Ionization
APCI
Atmospheric Pressure
Chemical Ionization
La spettrometria di massa MALDI (Matrix assisted
laser desorption ionization)- TOF (Time of fly) viene
principalmente impiegata per l’analisi di composti
organici non volatili che presentano un peso
molecolare elevato. Il campo di utilizzo principale
riguarda l’analisi di proteine, peptidi, lipoproteine,
oligosaccaridi e oligonucleotidi.
Rappresenta un metodo d’analisi abbastanza semplice
e compatibile con i tamponi utilizzati in laboratorio.
L’accuratezza della massa ottenuta dipende
dall’analizzatore dello spettrometro di massa, e sulla
maggior parte degli strumenti moderni si è in grado di
misurare masse con un errore dello 0,01% per masse
molecolari fino a 40.000 Da.
Un raggio emesso da un laser nell’UV fornisce
l’energia per il desorbimento. Si evita
l’irradiazione continua che potrebbe
decomporre il campione e con impulsi di pochi
nanosecondi si ottengono in fase gassosa ioni
molecolari, che subiscono scarsissima
frammentazione ed il cui rapporto m/z può
essere misurato in un analizzatore a tempo di
volo, TOF.
1 l della soluzione del campione da analizzare
viene aggiunto ad una soluzione satura di un
composto organico, la matrice, che sia capace di
assorbire luce alla emessa dal laser. La
soluzione risultante viene deposta su
un’appropriata superficie metallica inerte,
definita MALDI spot, ed il solvente fatto
evaporare. Si ottiene una matrice solida tra le
molecole della quale sono disperse le molecole
del campione, cioè matrice e campione sono
cocristallizzati in una MALDI spot.
La matrice va scelta in funzione del tipo di
campione, e deve essere in grado di
solubilizzare molecole polari ed apolari.
Formula di struttura delle matrici
reperibili in commercio.
Un raggio emesso ad es a 266 nm da un laser NdYAG od uno a 337 nm da un laser ad azoto, viene
inviato al campione e la sua energia verrà prima
assorbita dalla matrice e da questa trasferita poi, in
parte, alle molecole di campione.
Le molecole di campione vengono desorbite,
intatte, in forma gassosa, e ionizzate per
trasferimento di protoni da parte di ioni derivati
dal desorbimento della matrice. Da ciascuna
molecola si origina, pertanto, un’unica specie
ionica che non subisce ulteriori frammentazioni. I
vantaggi dell’utilizzo della matrice sono
molteplici: i campioni possono essere analizzati
anche in presenza di tamponi, detergenti, chelanti
in quanto questi non interferiscono con il processo
di desorbimento.
MALDI
Accoppiando la ionizzazione MALDI ad un
analizzatore TOF si possono rapidamente
separare ed analizzare i componenti di miscele
complesse di macromolecole con masse anche
maggiori di 300 kDa, utilizzando solo qualche
pmole di campione.
Svantaggi: la difficoltà di analizzare composti
con P.M. < 600 Da e la difficoltà di usare un
collegamento con HPLC od elettroforesi
capillare.
La peculiarità dell’ESI è il fatto che la
ionizzazione avviene a pressione atmosferica e
dà origine ad ioni multicarica della stessa
molecola.
Poiché la separazione avviene in base al
rapporto m/z, aumentando il numero delle
cariche z di uno ione è possibile che molecole di
parecchi milioni di dalton rientrino
nell’intervallo di massa rilevabile dalla
maggior parte degli analizzatori esistenti.
ESI
Il campione, sciolto in una miscela
acqua/solvente volatile (metanolo, acetonitrile
o loro miscele), è introdotto a pressione
atmosferica nello spettrometro attraverso un
capillare metallico che costituisce il terminale –
anado o catodo – di un circuito elettrico cui è
applicata una differenza di potenziale di circa 4
– 6 kV, responsabile della ionizzazione della
soluzione. L’altro terminale del circuito è dato
da un elemento dell’analizzatore, verso il quale
saranno attratti gli ioni di carica opposta.
Dal capillare la soluzione fuoriesce come uno spray
formato da minutissime goccioline cariche che, a
seguito dell’evaporazione del solvente provocata da un
flusso di azoto o da calore, diminuiscono ulteriormente
fino ad esplodere, quando la forza di repulsione supera
la tensione superficiale = esplosione coulombiana. Si
liberano ioni multicarica dell’analita in fase gassosa.
Da un campione è possibile produrre ioni molecolari
positivi o negativi a seconda della polarità del
voltaggio del capillare e del solvente utilizzato.
Da una stessa molecola si formano molteplici ioni
molecolari ciascuno recante un diverso numero di cariche,
che vengono quindi inviati all’analizzatore sotto vuoto
dell’apparecchio: si ottiene così uno spettro in cui i
numerosi picchi adiacenti differiscono tra loro per una unità
di carica, più comunemente un singolo protone.
Il programma computerizzato che gestisce lo
spettrometro provvede a calcolare il valore della carica
di ogni singolo picco e ciò consente di determinare il
valore della massa con una accuratezza superiore a
qualsiasi altra tecnica disponibile. Se ne ricava il così
detto “spettro deconvoluto” che riporta un unico picco,
il cui valore di massa è quello del campione analizzato.
La metodica ESI, prestandosi specificamente per la
ionizzazione di molecole polari ad alto peso
molecolare, trova larga utilizzazione nell’analisi di
polipeptidi e proteine e consente con facilità di mettere
in evidenza anche le più piccole variazioni di massa
dovute a modificazioni post-traduzionali.
Gli analizzatori di massa hanno la funzione di separare
ioni di massa diversa utilizzando un campo magnetico
e/o campo elettrico.
A seconda della modalità con la quale esplicano la
funzione si distinguono in analizzatori:
- a Settore magnetico;
- a Tempo di volo (TOF);
- a Quadruplo;
- a Trappola ionica;
- a Risonanza ciclotronica ionica in trasformata di
Fourier FT-ICR.
Non esiste un analizzatore di massa adatto per
tutte le applicazioni possibili, e la scelta
dipende dal tipo di analisi che si effettua,
tenendo conto che i vari analizzatori
differiscono tra loro principalmente per:
il massimo rapporto m/z misurabile;
il potere risolutivo;
la sensibilità (nmoli e pmoli);
la velocità di analisi;
la facile utilizzazione se lo spettrometro è
interfacciato ad un altro apparecchio (HPLC,
GC, EC).
Per quanto riguarda il potere risolutivo è da
premettere, che in uno spettro di massa, due picchi
adiacenti di intensità simile si considerano separati
se l’altezza h della valle tra di loro è minore del
10% dell’altezza H del picco maggiore.
Il potere risolutivo (R) è quindi la capacità di
separare due picchi di massa diversa:
R = m2/(m2-m1)
dove m2 è il valore m/z maggiore, m1 quello
minore.
Gli analizzatori si considerano a bassa risoluzione se
R è inferiore a 5.000 e ad alta risoluzione se R è
superiore a 5.000.
All’aumentare del potere risolutivo
dell’analizzatore aumenta l’accuratezza della
misura che indica di quanto il valore di massa
ottenuto o massa misurata si discosta dal
valore reale o massa reale, indica cioè
l’ampiezza dell’errore insito nella misurazione.
L’accuratezza si indica per convenzione come
l’inverso del potere risolutivo, e si ricava
dall’espressione (m2-m1)/m2, considerando
m2 il valore di massa esatta e m1 il valore di
massa misurata. Il risultato di questo rapporto
viene moltiplicato per 106 per esprimere
l’ampiezza dell’errore in ppm (parti per
milione = mg per litro).
L’accuratezza dipende da molteplici fattori
connessi alle metodiche seguite nell’analisi per
la ionizzazione, la rilevazione, l’acquisizione
dei dati, che possono influire singolarmente o
congiuntamente sul risultato finale.
Per determinare l’accuratezza di un’analisi si
effettua per ogni serie di analisi eseguite nello
stesso contesto sperimentale, va effettuata una
calibrazione con una molecola di cui si conosce
la massa esatta.
Analizzatori a settore magnetico;
Analizzatori a tempo di volo – TOF;
Analizzatori a quadrupolo;
Analizzatore a trappola ionica;
Analizzatore di risonanza ciclotronica ionica in
FIT (FIT-ICR).
In questi analizzatori non vi è necessità di un
campo magnetico od elettrico per selezionare
gli ioni in base ad una diversa traiettoria,
perchè si misura la velocità con la quale volano
verso il rivelatore. Per poter avere una misura
del tempo di volo è indispensabile l’esatta
determinazione del momento di inizio della
corsa, e vi è quindi la necissità di una
produzione pulsata di ioni; l’utilizzazione più
diffusa degli analizzatori TOF è perciò in
accoppiamento con il sistema di ionizzazione
MALDI.
Gli ioni provenienti dalla sorgente vengono
accelerati da un forte campo elettrico, di 20 kV,
all’uscita del quale tutti gli ioni hanno uguale
energia cinetica, ma differente velocità a
seconda della loro massa. Pertanto lasciandoli
correre in una regione libera da campi elettrici
o magnetici come un tubo sotto vuoto spinto,
gli ioni raggiungeranno il rivelatore in tempi
diversi: al collettore situato alla fine del tubo
arriveranno prima le particelle più veloci, ossia
quelle a massa minore.
Wiley and McLaren observed that ions of a particular mass-to-charge ratio would
reach the detector with a spread in arrival times, due to the effects of uncertainty
in the time of ion formation, location in the extraction field and initial kinetic
energy, resulting in reduced resolution. Wiley and McLaren devised an
instrument, incorporating a pulsed two-grid ion source, to compensate for
temporal, spatial and initial kinetic energy distributions. The basic geometry of
the Wiley-McLaren design is shown in the figure below:
I primi analizzatori TOF, denominati a
“modalità lineare” coprivano un’ampio
intervallo di valori di massa con alta sensibilità,
ma avevano però una bassa risoluzione. Ciò si
deve al fatto che gli ioni contenuti nella nube di
materiale desorbito non partono tutti
esattamente dalla medesima posizione.
Nei più recenti analizzatori TOF effettuando
una “estrazione ritardata” degli ioni ed
introducendo nel tubo di volo un “riflettore
elettrostatico” il potere risolutivo arriva a 104.
L’estrazione ritardata si ottiene applicando il campo
elettrico necessario per l’accelerazione degli ioni con un
certo ritardo rispetto al desorbimento, quando cioè si
hanno a disposizione tutti gli ioni, ed è possibile
applicare campi di estrazione differenti a ioni con
velocità iniziali diverse in modo da provocare il loro
compattamento.
Il riflettore elettrostatico posto all’estremità del tubo di
volo è composto da una serie di anelli o di griglie alle
quali viene applicato un potenziale crescente dello
stesso segno della carica degli ioni, che vengono
pertanto respinti. Gli ioni penetrano nel riflettore fino a
raggiungere energia cinetica pari a zero e vengono poi
riflessi e riaccelerati nella direzione opposta.
Due ioni aventi lo stesso m/z, ma diversa
energia cinetica percorrono spazi diversi nel
riflettore: quello con energia cinetica maggiore
penetra più in profondità rispetto a quello con
energia cinetica minore e quindi viene riflesso
dopo.
L’analizzatore TOF permette l’analisi di valori
di massa molto elevati, e questa caratteristica
contribuisce alla sua associazione preferenziale
ad una sorgente MALDI, capace di produrre
ioni monocarica di elevato peso molecolare.
L’analizzatore a quadrupolo o filtro di massa a quadrupolo è
formato da quattro barre metalliche parallele di 10 – 20 cm di
lunghezza poste in una camera sotto vuoto. Le barre hanno
sezione circolare od iperbolica e sono disposte a coppie
sovrapposte.
Le barre sono collegate sia ad una sorgente di corrente
continua, sia ad una sorgente di corrente alternata a
radiofrequenza. Ad una coppia di barre diagonalmente
opposte è applicato un potenziale positivo, all’altra coppia un
potenziale negativo. A tutte e due le coppie è sovrapposta una
corrente a RF , ma il voltaggio di RF sovrapposto alle barre
negative è tale da trovarsi di 180° fuori fase rispetto alla coppia
positiva. La funzione della RF è quella di far variare la polarità
ed il voltaggio delle barre, più o meno rapidamente a seconda
della frequenza applicata.
Il movimento di uno ione che entra nel
quadrupolo subisce oscillazioni in quanto viene
alternativamente attratto e respinto dalle
coppie di barre che variano in continuo il loro
potenziale da + a -. Lungo il cammino degli
ioni si genera un campo elettrico che varia
continuamente, e la traiettoria seguita dagli
ioni non è pertanto lineare, ma segue un
andamento a spirale.
Solo per certi valori di voltaggio e radiofrequenza
gli ioni con un dato valore m/z mantengono
un’oscillazione stabile, escono dall’analizzatore e
giungono fino al rivelatore; gli altri, con diverso
rapporto m/z subiranno delle oscillazioni instabili
che li porteranno a collidere con le barre del
quadrupolo ed ad annullarsi. Una proprietà del
quadrupolo è che la massa degli ioni che lo
attraversano fino al rivelatore è proporzionale al
voltaggio applicato alle barre; pertanto variando
voltaggio e RF si ottiene la filtrazione successiva, e
quindi l’arrivo al rivelatore, di ioni a massa
diversa. Ciò consente la selezione di un particolare
ione, oppure la scansione nel campo delle masse
tramite la variazione delle tensioni. Se si applica la
sola RF tutti gli ioni sono inviati al rivelatore.
Il potere risolutivo di questi analizzatori è
nell’ordine di 3.000 e quindi il quadrupolo è da
considerarsi un analizzatore a bassa risoluzione;
è però meno costoso di un analizzatore a
settore magnetico e l’acquisizione di uno
spettro avviene in pochi secondi.
L’analizzatore a quadrupolo è quello più
frequentemente accoppiato alla ionizzazione
per elettrospray, e trova ampia applicazione
come sistema di rivelazione nella
cromatografia liquida e nella gas cromatografia
accoppiate alla spettrometria di massa, nelle
metodiche ifenate.
I rivelatori o detectors usati negli spettrometri
di massa sono rapportabili a due tipi principali:
quelli a misura diretta;
quelli a moltiplicatore.
Spettro di massa di un peptide
La limitata frammentazione dello ione molecolare nelle
tecniche di ionizzazione “soft”, MALDI o ESI, che facilita la
determinazione della massa, costituisce uno svantaggio
quando si vogliono avere informazioni più precise sulla
struttura della molecola al fine di un riconoscimento
inequivoco.
E’ stata messa a punto la Spettrometria di Massa Tandem
(MS/MS) nella quale lo ione molecolare stabile,
immediatamente dopo la determinazione della sua massa,
viene fatto collidere con molecole di gas neutro (elio od
argon), acquista ulteriore energia e la dissipa
frammentandosi. Il processo è detto Dissociazione Indotta da
Collisione (CID). I frammenti ionici prodotti vengono quindi
sottoposti ad una seconda analisi.
Spettrometria tandem “nello spazio” e “nel
tempo”:
MS/MS nello spazio l’apparecchiatura
comprende due analizzatori di massa disposti
in serie, separati da una cella di collisione:
a triplo quadrupolo (QqQ);
a quadrupolo accoppiato con TOF (Qq-TOF);
con due analizzatori TOF separati (TOF/TOF).
Nella spettrometria tandem “nel tempo” non
vi è necessità di due analizzatori: passaggi
sopra descritti avvengono nello stesso
analizzatore, ma in tempi diversi.
Viene definita metodica ifenata una tecnica
analitica che accoppia una separazione
cromatografica od elettroforetica ad una
determinazione di massa.
GC-MS
LC-MS
CE-MS
RP-HPLC-MS-MS
Protein Identification
A biological sample contains hundreds or thousands of
proteins, all mixed together. The first step is to separate
them. One common technique uses two-dimensional gels.
The spots on the gel are different proteins, separated
horizontally by pH and vertically by mass (the two
dimensions).
VHLTPEEK
SAVTALWGK
VNVDEVGGEALGR
LLVVYPWTQR
FFESFGDLSTPDAVMGNPK
VK
AHGK
K
VLGAFSDGLAHLDNLK
GTFATLSELHCDK
LHVDPENFR
LLGNVLVCVLAHHFGK
EFTPPVQAAYQK
VVAGVANALAHK
Mass spectrometers can
identify proteins better if they
are first broken down into
tryptic peptides. Tryptic
peptides are chains of amino
acids that occur when the
proteins are digested with the
enzyme trypsin.
The tryptic peptides for
hemoglobin are shown here.
The peptides have to be further sorted before they
can be identified. This is often done in the following
two steps:
HPLC can separate peptides based on how
soluble the peptides are — that is, the peptide
hydrophobicity.
Mass spectrometry separates the peptides based
upon their mass.
This is the first mass spectrometer of the two in a
tandem mass spectrometer instrument.
The second part of the tandem mass spectrometer
examines the individual peptides in detail for
identifying features — the distances between the
peaks in the mass spectral graph. The peaks
represent the number of ions in the peptide's
spectrum that have a certain mass and charge.
A protein is identified
by matching the
identifying features of
the peptides to a
database of proteins.
An identification is
more believable if it is
based on matching
mass spectra from
several peptides.
Peptide Sequencing by Tandem Mass Spectrometry.
The most common usage of MS-MS in biochemical areas is the product or
daughter ion scanning experiment which is particularly successful for peptide
and nucleotide sequencing.
Peptide sequencing: H2N-CH(R')-CO-NH-CH(R")-CO2H
There are three different types of bonds that can fragment along the amino acid
backbone: the NH-CH, CH-CO, and CO-NH bonds. Each bond breakage gives
rise to two species, one neutral and the other one charged, and only the
charged species is monitored by the mass spectrometer. The charge can stay on
either of the two fragments depending on the chemistry and relative proton
affinity of the two species. Hence there are six possible fragment ions for each
amino acid residue and these are labelled as in the diagram, with the a, b, and
c" ions having the charge retained on the N-terminal fragment, and the x, y",
and z ions having the charge retained on the C-terminal fragment. The most
common cleavage sites are at the CO-NH bonds which give rise to the b and/or
the y" ions. The mass difference between two adjacent b ions, or y"; ions, is
indicative of a particular amino acid residue.
Peptide sequencing by tandem mass spectrometry backbone cleavages
The extent of side-chain fragmentation detected depends on
the type of analyser used in the mass spectrometer. A magnetic
sector - magnetic sector instrument will give rise to high
energy collisions resulting in many different types of sidechain cleavages. Quadrupole - quadrupole and quadrupole time-of-flight mass spectrometers generate low energy
fragmentations with fewer types of side-chain fragmentations.
Immonium ions (labelled "i") appear in the very low m/z
range of the MS-MS spectrum. Each amino acid residue leads to
a diagnostic immonium ion, with the exception of the two pairs
leucine (L) and iso-leucine (I), and lysine (K) and glutamine
(Q), which produce immonium ions with the same m/z ratio,
i.e. m/z 86 for I and L, m/z 101 for K and Q. The immonium
ions are useful for detecting and confirming many of the amino
acid residues in a peptide, although no information regarding
the position of these amino acid residues in the peptide
sequence can be ascertained from the immonium ions.
An example of an MS/MS daughter or product ion spectrum is illustrated
below. The molecular mass of the peptide was measured using standard
mass spectrometric techniques and found to be 680.4 Da, the dominant ions
in the MS spectrum being the protonated molecular ions (M+H+) at m/z
681.4. These ions were selected for transmission through the first analyser,
then fragmented in the collision cell and their fragments analysed by the
second analyser to produce the following MS/MS spectrum. The sequence
(amino acid backbone) ions have been identified, and in this example the
peptide fragmented predominantly at the CO-NH bonds and gave both b
and y" ions. (Often either the b series or the y" series predominates,
sometimes to the exclusion of the other). The b series ions have been
labelled with blue vertical lines and the y" series ions have been labelled
with red vertical lines. The mass difference between adjacent members of a
series can be calculated e.g. b3-b2 = 391.21 - 262.16 = 129.05 Da which is
equivalent to a glutamine (E) amino acid residue; and similarly y4 - y3 =
567.37 - 420.27 = 147.10 Da which is equivalent to a phenylalanine (F)
residue. In this way, using either the b series or the y" series, the amino acid
sequence of the peptide can be determined and was found to be NFESGK
(n.b. the y" series reads from right to left!). The immonium ions at m/z 102
merely confirm the presence of the glutamine (E) residue in the peptide.
Peptide sequencing by tandem mass spectrometry - an MS-MS
daughter or product ion spectrum.
A protein identification study would proceed as follows:
•a. The protein under investigation would be analysed by mass
spectrometry to generate a molecular mass to within an accuracy of 0.01%.
b. The protein would then be digested with a suitable enzyme. Trypsin is
useful for mass spectrometric studies because each proteolytic fragment
contains a basic arginine (R) or lysine (K) amino acid residue, and thus is
eminently suitable for positive ionisation mass spectrometric analysis. The
digest mixture is analysed - without prior separation or clean-up - by mass
spectrometry to produce a rather complex spectrum from which the
molecular weights of all of the proteolytic fragments can be read. This
spectrum, with its molecular weight information, is called a peptide map. (If
the protein already exists on a database, then the peptide map is often
sufficient to confirm the protein.)
For these experiments the mass spectrometer would be operated in the
"MS" mode, whereby the sample is sprayed and ionised from the
nanospray needle and the ions pass through the sampling cone, skimmer
lenses, Rf hexapole focusing system, and the first (quadrupole) analyser.
The quadrupole in this instance is not used as an analyser, merely as a lens
to focus the ion beam into the second (time-of-flight) analyser which
separates the ions according to their mass-to-charge ratio.
Q-TOF mass spectrometer operating in MS (upper) and
MS/MS mode (lower) modes.
c.
With the digest mixture still spraying into the mass
spectrometer, the Q-Tof mass spectrometer is switched into
"MS/MS" mode. The protonated molecular ions of each of the
digest fragments can be independently selected and transmitted
through the quadrupole analyser, which is now used as an
analyser to transmit solely the ions of interest into the collision
cell which lies in between the first and second analysers. An inert
gas such as argon is introduced into the collision cell and the
sample ions are bombarded by the collision gas molecules which
cause them to fragment. The optimum collision cell conditions
vary from peptide to peptide and must be optimised for each one.
The fragment (or daughter or product) ions are then analysed by
the second (time-of-flight) analyser. In this way an MS/MS
spectrum is produced showing all the fragment ions that arise
directly from the chosen parent or precursor ions for a given
peptide component.
An MS/MS daughter (or fragment, or product) ion
spectrum is produced for each of the components
identified in the proteolytic digest. Varying amounts of
sequence information can be gleaned from each
fragmentation spectrum, and the spectra need to be
interpreted carefully. Some of the processing can be
automated, but in general the processing and
interpretation of spectra will take longer than the data
acquisition if accurate and reliable data are to be generated.
The amount of sequence information generated will vary
from one peptide to another. Some peptide sequences will
be confirmed totally, other may produce a partial sequence
of, say, 4 or 5 amino acid residues. Often sequence "tag" of
4 or 5 residues is sufficient to search a protein database and
confirm the identity of the protein.
