INDICE - Accademia di qualitologia
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A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 1 di 20 0. SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE 3 1. RIFERIMENTI 3 2. GENERALITÀ 3 3. MODALITÀ OPERATIVE 3 3.1 Campioni istologici. 3.1.1 Sparaffinatura e successiva idratazione delle sezioni. 3 3 3.2 Campioni citologici 3 3.3 Colorazioni di routine 3 3.3.1 Ematossillina –Eosina 4 3.3.2 Papanicolaou 4 3.4 Cambio limonene, alcooli e coloranti 4 3.5 Colorazioni speciali 5 3.5.1 Colorazioni istochimiche 5 3.5.1.1 Accensione dell’immunocoloratore e scelta del protocollo 5 3.5.1.2 Caricamento dell’immunocoloratore 5 3.5.1.3 Preparazioni 5 3.5.1.3.1 Diluizioni di lavoro degli anticorpi primari (AB1) ed eventuale pretrattamento in MW 5 3.5.1.3.2 Enzima (ENZ) 6 3.5.1.3.3 Ematossilina (HEMA) 6 3.5.1.3.4 Cromogeno (CHROM) 6 3.5.1.4 Avvio dell’immunocoloratore 9 3.5.1.5 Colorazioni immunoistochimiche manuali 9 3.5.2 COLORAZIONE IMPREGNAZIONE ARGENTICA 10 3.5.3 COLORAZIONE MALLORY TRICROMICA 11 3.5.4 COLORAZIONE ROSSO CONGO 12 3.5.5 COLORAZIONE ALCIAN BLEU 13 3.5.6 COLORAZIONE FERRO 14 3.5.7 COLORAZIONE PAS 15 3.5.8 COLORAZIONE PAS DIASTASI 15 3.5.9 COLORAZIONE DI GIEMSA 16 3.5.9.1 Per sezione di Biopsia Osteomidollare 16 3.5.10 COLORAZIONE DI ZIEHL-NIELSEN 17 3.5.11 IBRIDIZZAZIONE IN SITU PER HPV 18 A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica 3.6 4. Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 2 di 20 Preparazione coloranti per colorazioni 18 3.6.1 Soluzione di Emallume Carazzi 18 3.6.2 Soluzione di Alcian Bleu 18 3.6.3 Soluzione di Ferro 18 3.6.4 Soluzione di Carmallume 18 3.6.5 Soluzione di Acido Periodico 19 3.6.6 Soluzione di Acqua solforosa 19 3.6.7 Soluzione di Diastasi 19 3.6.8 Soluzione di PBS 19 3.6.9 Soluzione di Giemsa 19 3.6.10 Soluzione di Fucsina 19 3.6.11 Soluzione di Eosina 19 3.6.12 Soluzione di Blue di Toluidina allo 0,5% 19 ELENCO DEGLI ALLEGATI COPIA CONTROLLATA N° _____ REDAZIONE: COORDINATORE _______________________ 20 DISTRIBUITO A _______________________________ VERIFICA: RAQ _________________________ APPROVAZIONE: DUO ________________________ A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 3 di 20 0. Scopo e campo di applicazione La presente istruzione operativa descrive le responsabilità e le modalità di colorazione dei campioni istologici e citologici. 1. Riferimenti Cap. 03 del MQ. Norma UNI EN ISO 9001/2000 § 7. 2. Generalità Le attività di seguito descritte sono svolte, salvo diversa indicazione dal Tecnico della U.P. 3. Modalità operative 3.1 Campioni istologici. 3.1.1 Sparaffinatura e successiva idratazione delle sezioni. Il tecnico addetto alle colorazioni il mattino, appena arrivato, toglie i cestelli con i vetrini da colorare dal termostato a 37° e li pone nel contenitore con limonene, con le seguenti modalità: - limonene almeno 45' - alcool 100° 30” per ognuno dei tre passaggi - alcool 95° 30” per ognuno dei tre passaggi - alcool 70° 30” 1 passaggio - alcool 50° 30” 1 passaggio - acqua distillata 30” 1 passaggio 3.2 Campioni citologici Per i campioni citologici, non è necessaria la procedura di sparaffinatura, a meno che non si tratti di citoinclusi, che vanno trattati con le medesime modalità indicate al punto 3.1.1. In tutti gli altri casi le modalità di esecuzione delle colorazioni speciali, istochimiche ed immunocitochimiche sono le stesse dei campioni istologici, una volta completata la procedura di sparaffinatura. 3.3 Colorazioni di routine Vengono di seguito descritte le attività che il Tecnico della U.P. deve eseguire per la realizzazione delle colorazioni di routine utilizzate. La qualità di tutte le colorazioni viene verificata e validata dal Patologo al momento della lettura al microscopio. A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 4 di 20 3.3.1 Ematossillina –Eosina Viene utilizzato il seguente metodo: Portare le sezioni all’acqua, ed immergere nei seguenti liquidi, secondo la sequenza e per i tempi indicati: 1. acqua distillata 1' 2. Emallume Carazzi 20' (per preparazione v. §3.6.1) 3. rapido passaggio in acqua distillata 4. acqua di fonte 30' 5. acqua distillata 2 passaggi 30" ciascuno 6. alcool 70° 30" 7. alcool 95° 3 passaggi 20" ciascuno 8. eosina 30"(per prepar.ne v. §3.6.11) 9. alcool 95° 3 passaggi rapidi 10. alcool 100° 3 passaggi 15" + 15" + 30" 11. limonene 30' 12. limonene tenere immersi nella fase di montaggio 13. montare in Micromount 3.3.2 Papanicolaou Il campione su vetrino deve essere immerso nei seguenti liquidi, secondo la sequenza e per i tempi indicati, dopo aver filtrato i coloranti attraverso una garza 1. acqua di fonte 10’ 2. acqua distillata 30” 3. Gill II 1,15” (pap-test); 1,30” (liquidi biol.) 4. acqua di fonte 3' 5. alcool 95° 1’ 6. EA50 1,15” (pap-test); 1,30” (liquidi biol.) 7. alcool 95° 5” 8. alcool 100° 1' 9. alcool 100° 2' 10. limonene 3 passaggi 1' + 2' + 10' 11. montaggio con Micromount 3.4 Cambio limonene, alcooli e coloranti Alla fine di ogni colorazione il Tecnico (e/o l’AP nel caso dei coloranti) valuta la necessità di sostituire gli alcooli, il limonene, ed i coloranti, dalle vaschette prima di effettuare la colorazione successiva, effettua l’eventuale sostituzione e compila il modulo M01IO05PT07. A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 5 di 20 3.5 Colorazioni speciali Vengono di seguito descritte le attività che il Tecnico della U.P. deve eseguire per la realizzazione delle colorazioni speciali utilizzate. 3.5.1 Colorazioni istochimiche Le colorazioni immunoistochimiche vengono effettuate dal Tecnico della U.P. utilizzando l’Immunocoloratore DAKO TechMate500. 3.5.1.1 Accensione dell’immunocoloratore e scelta del protocollo La modalità è descritta nella Guida Rapida all’uso dell’Immunocoloratore sez.ni Accensione e scelta del protocollo. I protocolli da utilizzare sono elencati nella tabella 1 “Pretrattamento e Diluizione Anticorpi”. 3.5.1.2 Caricamento dell’immunocoloratore La modalità è descritta nella Guida Rapida all’uso dell’Immunocoloratore sez.ni Posizionamento dei reattivi e dei prodotti accessori 3.5.1.3 Preparazioni 3.5.1.3.1 Diluizioni di lavoro degli anticorpi primari (AB1) ed eventuale pretrattamento in MW Utilizzando la tabella 1 “Pretrattamento e Diluizione Anticorpi” viene effettuato: il trattamento a MW (se previsto) secondo le modalità seguenti: - porre i vetrini sparaffinati nell'apposita vaschetta contenente Buffer for Antigen Retrieval diluito 1:10 in acqua distillata - mettere la vaschetta nel forno a microonde regolato alla massima potenza, avendo cura di posizionarla al centro del piatto rotante - regolare il tempo su 5' - avviare il microonde - al termine aggiungere nella vaschetta 50 ml di acqua distillata - regolare la potenza a 600 w per 5 ' - avviare il microonde - lasciare raffreddare i vetrini a temperatura ambiente vengono preparate le diluizioni degli anticorpi necessarie all’effettuazione delle colorazioni richieste. Per l'Ab monoclonale LP34 viene utilizzato il seguente protocollo: - vetri all'acqua distillata - inibizione della perosssidasi endogena con H2O2 al 30% diluita 1:10 in acqua distillata per 7' - lavaggio prolungato in acqua distillata - digestione enzimatica con Pronase allo 0.1% in PBS per 20' a 37°C - lavaggio prolungato in acqua distillata A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica - Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 6 di 20 porre i vetri nell' immunocoloratore utilizzando il programma MSIPE-Y verde o MSIP-Y verde 3.5.1.3.2 Enzima (ENZ) L’enzima Proteinase K viene diluito con Proteinase K Diluent nella proporzione di 1 gtt in 1,6ml. La soluzione deve essere posta nel trays nella posizione corrispondente al vetrino che deve essere pretrattato con enzima. 3.5.1.3.3 Ematossilina (HEMA) Viene preparata una soluzione di lavoro di ematossillina diluita 1:2 con acqua distillata. 3.5.1.3.4 Cromogeno (CHROM) Viene preparata una soluzione di lavoro del reattivo cromogeno secondo le istruzioni contenute nel kit del cromogeno. La preparazione deve essere effettuata entro i 30’ dal suo utilizzo sull’immunocoloratore. A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 7 di 20 TABELLA 1: PRETRATTAMENTO E DILUIZIONE ANTICORPI Anticorpi Ditta primari P=policlon Clone ale) (per Ab Diluizione monoclonali) lavoro di Pretrattamen con to M=monocl Antibody MW= onale) Diluent mw protocolli immunocoloratore (*) forno E = enzima N= no pretratt. CD 45 R Dako M 4KB5 1:100 MW MSIP-Y verde o MSIPE-Y v. CD 45 RO " M UCHL1 1:300 MW " Cromogranina " M DAK-A3 1:200 MW " CD43 " M DF-T1 1:100 MW " CA 125 " M OC125 1:20 MW " CEA " M II-7 1:25 MW " Vimentina " M V9 1:100 MW " Neurofilamenti " M 2F11 1:200 MW " Desmina " M D33 1:200 MW " CD 15 " M C3-D1 1:50 MW " CD 3 " P 1:100 MW " CD 3 " M CD 20 " M L26 1:300 MW " CA 15-3 " M DF3 1:50 MW " CD 8 " M C8/144B 1:100 MW " M LP34 1:30 N " Ck LP34**** " PSA " M ER-PR8 1:40 MW " CD 30 " M Ber-H2 1:40 MW " AE1/AE3 " M AE1/AE3 1:50 MW " CD 31 " M JC/70A 1:40 MW " CD 68 " M PG-M1 1:100 MW " CD 34 " M QBEnd 10 1:50 MW " CD 79a " M JCB117 1:50 MW " Ck alto peso " M 34BE12 1:50 MW " EMA " M E29 1:500 N " NSE " M BBS/NC/VI-H14 1:1000 N " Anti muscolo " M 1A4 1:500 N " liscio A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica Anti Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 8 di 20 muscolo " M Alpha-Sr-1 1:200 N " muscolo " M HHF35 1500 N " hTG " M DAK-Tg6 1:1000 N " CD 4 " M OPD4 1:800 N " Glicoforina C " M Ret40f 1:500 N " AFP " P 1:300 N " CA 19-9 " M 116-N5-19-9 1:50 N " CD 5 " M CD5/54/F6 1:50 N " MPO " P 1:9000 N " Mioglobina " P 1:800 N " Antimesotelio " M HBME-1 1:50 N " Amiloide A " M mc1 1:300 E MSIPE-Y v. HCG " P 1:1000 E " IgG " P 1:1500 E " IgA " P 1:5000 E " IgM " P 1:10.000 E " Catene legg. k " P 1:10.000 E " Catele legg. " P 1:10.000 E " Anti " M HMB45 1:500 E " DBA44 " M DBA.44 1:25 E " MNF 116 " M MNF116 1:400 E " S 100 " P 1:6000 E " Ck 19 " M BA17 1:500 E " Ck 20 " M KS20.8 1:300 E " Helicobacter " P 1:80 E " LCA " M 2B11+PD7/26 1:800 E " Rec. estrogeni " M 1D5 1:50 MW MSIP bianco Rec. " M PgR636 1:100 MW " Ki67 " P 1:50 MW " c-erbB-2 " P 1:200 MW " striato Anti totale melanoma py. progestrone (*) Vengono utilizzati di routine i seguenti protocolli: MSIPE-Y verde quando è previsto il pretrattamento con enzima MSIP-Y verde quando non è previsto il pretrattamento con enzima MSIP bianco quando viene effettuata la colorazione per recettori ER e PgR, Ki-67 e c-erb-B2. A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 9 di 20 3.5.1.4 Avvio dell’immunocoloratore La modalità è descritta nella Guida Rapida all’uso dell’Immunocoloratore sez.ni Avvio. 3.5.1.5 Colorazioni immunoistochimiche manuali Nei casi in cui sia necessario effettuare colorazioni immunoistochimiche con metodo manuale, vengono utilizzati gli stessi reagenti usati per l'immunocoloratore, rispettando gli stessi passaggi per il medesimo tempo. Indicazioni dettagliate sulle modalità di utilizzo dei diversi reagenti IIC sono contenute nel raccoglitore apposito posto nel pensile situato nella stanza dove vengono effettuate le colorazioni. A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 10 di 20 3.5.2 COLORAZIONE IMPREGNAZIONE ARGENTICA Viene utilizzato il KIT ARGENTAFFIN RETICULAR FIBERS e viene utilizzato il seguente metodo: - Portare la sezione all’acqua distillata - Porre sulla sezione 5 gocce di reattivo A e 5 gocce del reattivo B: lasciare agire per 5’ - Lavare in acqua distillata per 5’ - Porre sulla sezione 10 gocce del reattivo C: lasciare agire per 3’ - Lavare in acqua distillata per 5’ - Porre sulla sezione 10 gocce del reattivo D: lasciare agire per 2’ - Lavare in acqua distillata per 10’ - Porre sulla sezione 10 gocce del reattivo E: lasciare agire per 2’ - Lavare in acqua distillata per 5’ - Porre sulla sezione 10 gocce del reattivo F: lasciare agire per 2’ - Lavare in acqua distillata per 5’ - Porre sulla sezione 10 gocce del reattivo G: lasciare agire per 4’ - Lavare in acqua di fonte per 5’ - Disidratare attraverso la serie ascendente degli alcool: limonene e montare le sezioni con Micromount A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 11 di 20 3.5.3 COLORAZIONE MALLORY TRICROMICA Viene utilizzato il KIT MALLORY TRICROMICA MODIFICATA e viene utilizzato il seguente metodo: - Portare la sezione all’acqua distillata - Porre sulla sezione 5 gocce di reattivo A e aggiungervi 15 gocce di acqua distillata: lasciare agire per 10’ - Lavare in acqua distillata per 5’ - Porre sulla sezione 10 gocce di acqua distillata aggiungere 2 gocce della soluzione B e 3 gocce della soluzione C: lasciare agire per 2’ - Lavare rapidamente con acqua di fonte (2”-3”) e porre sulla sezione 10 gocce del reattivo D: lasciare agire per 5’ - Senza lavare, sgocciolare il vetrino e porre sulla sezione 10 gocce della soluzione E: lasciare agire per 1’ - Lavare in acqua distillata - Disidratare attraverso la serie ascendente degli alcool: limonene e montare le sezioni con Micromount A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 12 di 20 3.5.4 COLORAZIONE ROSSO CONGO Viene utilizzato il KIT CONGO RED e viene utilizzato il seguente metodo: - Portare la sezione all’acqua distillata - Porre sulla sezione 10 gocce di reattivo A: lasciare agire per 30’ - Senza lavare, sgocciolare il vetrino e porre sulla sezione 10 gocce del reattivo B: lasciare agire per 10’ - Lavare in acqua distillata per 5’ - Porre sulla sezione 10 gocce di reattivo C: lasciare agire per 30” - Lavare in acqua di fonte per 5’ - Porre sulla sezione 10 gocce di reattivo D: lasciare agire per 5’ - Lavare in acqua distillata per 5’ - Far virare in acqua di fonte per circa 10’ - Disidratare attraverso la serie ascendente degli alcool: limonene e montare le sezioni con Micromount A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 13 di 20 3.5.5 COLORAZIONE ALCIAN BLEU Viene utilizzato il seguente metodo: - Portare la sezione all’acqua distillata - Ricoprire la sezione del colorante ALCIAN BLEU (ottenuto secondo quanto descritto nel §3.6.2) per 30’ - Lavare in acqua di fonte per 10’ - Immergere in una soluzione Emallume Carazzi (ottenuta secondo quanto descritto nel §3.6.1) per 10’ - Lasciare la sezione in acqua distillata per 2’-3’ - Lavare in acqua di fonte per 10’ - Disidratare attraverso la serie ascendente degli alcool: limonene e montare le sezioni con Micromount A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 14 di 20 3.5.6 COLORAZIONE FERRO Viene utilizzato il seguente metodo: - Portare la sezione all’acqua distillata - Ricoprire la sezione con la soluzione di ferro (ottenuto secondo quanto descritto nel §3.6.3) per 30’ - Lavare in acqua distillata per 10’ - Ricoprire la sezione con la soluzione di carmallume (ottenuto secondo quanto descritto nel §3.6.4) per 20’-30’ - Veloce lavaggio in acqua distillata - Disidratare attraverso la serie ascendente degli alcool: limonene e montare le sezioni con Micromount A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 15 di 20 3.5.7 COLORAZIONE PAS Viene utilizzato il seguente metodo: - Portare la sezione all’acqua distillata - Immergere la sezione in una soluzione di acido periodico al 4% (ottenuto secondo quanto descritto nel §3.6.5) per 10’ - Lavare in acqua distillata - Immergere la sezione nel reattivo di Schiff al buio per 5’ - Veloce lavaggio in acqua distillata - Lavaggio in acqua solforosa (ottenuta secondo quanto descritto nel §3.6.6) - Lavare in acqua di fonte per 30’ - Immergere in una soluzione Emallume Carazzi (ottenuta secondo quanto descritto nel §3.6.1) per 10’ - Lavare in acqua distillata - Lavare in acqua di fonte per 20’-30’ - Disidratare attraverso la serie ascendente degli alcool: limonene e montare le sezioni con Micromount 3.5.8 COLORAZIONE PAS DIASTASI Viene utilizzato il seguente metodo: - Portare la sezione all’acqua distillata - Immergere la sezione in una soluzione di Diastasi (ottenuto secondo quanto descritto nel §3.6.7) per 30’ a 37°C - Lavare in acqua distillata - Immergere la sezione in una soluzione di acido periodico al 4% (ottenuto secondo quanto descritto nel §3.6.5) per 10’ - Lavare in acqua distillata - Immergere la sezione nel reattivo di Schiff al buio per 5’ - Veloce lavaggio in acqua distillata - Lavaggio in acqua solforosa (ottenuta secondo quanto descritto nel §3.6.6) - Lavare in acqua di fonte per 30’ - Immergere in una soluzione Emallume Carazzi (ottenuta secondo quanto descritto nel §3.6.1) per 10’ - Lavare in acqua distillata - Lavare in acqua di fonte per 20’-30’ - Disidratare attraverso la serie ascendente degli alcool: limonene e montare le sezioni con Micromount A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 16 di 20 3.5.9 COLORAZIONE DI GIEMSA Viene utilizzato il seguente metodo: - Portare la sezione all’acqua distillata - Immergere la sezione in una soluzione di Giemsa (ottenuto secondo quanto descritto nel §3.6.9) per 1h - Lavare in acqua distillata per 10’ - Immergere la sezione per pochi secondi in una soluzione circa 300 ml.di acqua distillata, con l’aggiunta di 3 gocce di acido acetico glaciale, agitando la sezione - Immergere rapidamente la sezione in alcool a 95° e differenziare il colore fino al grado desiderato (controllo visivo) - Immergere la sezione in alcool isopropilico in 3 vaschette con durata di 2’ ciascuna - Immergere in limonene e montare le sezioni con Micromount 3.5.9.1 Per sezione di Biopsia Osteomidollare Viene utilizzato il seguente metodo: - Portare la sezione all’acqua distillata - Immergere la sezione in una soluzione di PBS (ottenuto secondo quanto descritto nel §3.6.8) per una “over night” - Lavare in acqua distillata - Immergere la sezione in una soluzione di Giemsa (ottenuto secondo quanto descritto nel §3.6.9) per 1h - Lavare in acqua distillata per 10’ - Immergere la sezione per pochi secondi in una soluzione circa 300 ml. di acqua distillata, con l’aggiunta di 3 gocce di acido acetico glaciale, agitando la sezione - Immergere rapidamente la sezione in alcool a 95° e differenziare il colore fino al grado desiderato (controllo visivo) - Immergere la sezione in alcool isopropilico in 3 vaschette con durata di 2’ ciascuna Immergere in limonene e montare le sezioni con Micromount A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 17 di 20 3.5.10 COLORAZIONE DI ZIEHL-NIELSEN Viene utilizzato il seguente metodo: - Portare la sezione all’acqua distillata - Immergere la sezione in una soluzione di Fucsina fenicata (ottenuto secondo quanto descritto nel §3.6.10) per 3h a 60°C - Lavare in acqua corrente - Differenziare la sezione in una soluzione di alcool acidulato (100 ml. di alcool 70° con 1 ml. di HCl concentrato) per 12” c.ca - Immergere la sezione in Blue di Toluidina al 0,5% in acqua per 5’ - Lavare in acqua corrente - Disidratare attraverso la serie ascendente degli alcool: limonene e montare le sezioni con Micromount A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica 3.5.11 Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 18 di 20 IBRIDIZZAZIONE IN SITU PER HPV Viene utilizzato il seguente metodo: Sonda: Human Papillomavirus (HPV) DNA Probes, Biotinylated DAKO Le sonde utilizzate per la diagnosi di screening e di specificità sono: - Wide spectrum HPV DNA Cocktail (per diagnosi di screening) - 6/11 (per diagnosi di specificità) - 16/18 (per diagnosi di specificità) - 31/33 (per diagnosi di specificità) Viene utilizzato il Kit “Sistema di rivelazione Gen Point TM DAKO” e la metodica in esso contenuta. 3.6 Preparazione coloranti per colorazioni Vengono di seguito descritte le attività che il Tecnico di Laboratorio deve porre in atto per la realizzazione dei coloranti successivamente utilizzati per le colorazioni sopraindicate. 3.6.1 Soluzione di Emallume Carazzi Sciogliere a caldo 100 gr. di allume potassico in 1400 ml. di acqua distillata in un pallone di vetro posizionato su una piastra riscaldante. A completa solubilizzazione sospendere il riscaldamento e aggiungere 2 gr. di Ematossillina. In altro recipiente sciogliere a freddo 0,4 gr. di iodato potassico in 200 ml di acqua distillata. Quando la soluzione di ematossillina è raffreddata aggiungere quella di iodato potassico e 400 ml. di glicerina mescolando bene. Filtrare ed aggiungere qualche cristallo di timolo. 3.6.2 Soluzione di Alcian Bleu Solubilizzare 0,1 gr. di Alcian Bleu 8 GS in 100 ml. di acido acetico al 3% in acqua. 3.6.3 Soluzione di Ferro Preparare mescolando in parti uguali le soluzioni di HCl al 2% (1 ml. di HCl al 37% con 17,5 ml. di acqua distillata) e ferricianuro di potassio al 2% in acqua distillata. 3.6.4 Soluzione di Carmallume Sciogliere a caldo 10 gr. di allume potassico in 200 ml. di acqua distillata in un pallone di vetro posizionato su una piastra riscaldante. A completa solubilizzazione sospendere il riscaldamento e aggiungere 1 gr. di Acido Carminio. Lasciare raffreddare e depositare. Filtrare ed aggiungere qualche cristallo di timolo. A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 19 di 20 3.6.5 Soluzione di Acido Periodico Solubilizzare 8 gr. di acido periodico in 200 ml. di acqua distillata. 3.6.6 Soluzione di Acqua solforosa Preparare mescolando: - 10 ml. di soluzione di HCl 1N - 10 ml. di soluzione sodio metabisolfito al 10% in acqua - 180 ml. di acqua distillata 3.6.7 Soluzione di Diastasi Sciogliere 0,1 gr. di -amilasi in 100 ml. di acqua distillata 3.6.8 Soluzione di PBS Sciogliere la polvere di PBS in acqua distillata secondo la proporzione indicata nella confezione. 3.6.9 Soluzione di Giemsa Filtrare la soluzione di Giemsa concentrata e diluirne 20 ml. con 80 ml. di acqua distillata. 3.6.10 Soluzione di Fucsina Sciogliere in 10 ml. di alcool etilico a 95° 1 gr. di fucsina basica, aggiungere 5 gr. di acido fenico cristallizzato e lentamente 100 ml. acqua distillata. Filtrare. 3.6.11 Soluzione di Eosina Mescolare: - 250 ml. di una soluzione di Eosina all’1% in acqua distillata - 12,5 ml. di una soluzione di Floxina all’1% in acqua distillata - 5 ml. di Acido acetico Glaciale - 1950 ml. di Alcool etilico a 95° 3.6.12 Soluzione di Blue di Toluidina allo 0,5% Mescolare: - 100 ml. di acqua distillata - 0,5 gr. di Blue di Toluidina Filtrare dopo completa solubilizzazione. A.S.U.R. Zona Territoriale n. 5 – Jesi Dipartimento Diagnostico U.O.Patologia Clinica Doc:IO05APTPT07 ISTRUZIONE OPERATIVA DI Rev. 2 COLORAZIONE DEI CAMPIONI del 28/06/2006 ISTOLOGICI E CITOLOGICI Pagina 20 di 20 4. ELENCO DEGLI ALLEGATI 1. DAKO TechMate: Guida Rapida all’uso dell’immunocoloratore 2. M01IO05PT07 Modulo Registrazione controllo e cambio alcooli e limonene
