Studio dei meccanismi precoci che collegano le alterazioni del

PROGETTI A CONCORSO 2009-2010 - VINCITORI
PROGETTO N. 12
CDR / 220/02
RESPONSABILE PROGETTO: BRIGIDA BREZZI
FINANZIAMENTO: € 40.000,00
Studio dei meccanismi precoci che collegano le alterazioni del metabolismo minerale alle nefropatie
SINOSSI DEL PROGETTO
La malattia renale cronica è diventata un’emergenza sanitaria a livello mondiale, non solo per l’incremento di
nefropatie associate a sindrome metabolica, ipertensione e diabete, ma soprattutto perché è stato
chiaramente dimostrato che i pazienti nefropatici vanno incontro ad eventi cardiovascolari e morte prematura
con frequenza da 10 a 100 volte più elevata che nella popolazione generale. Tra le motivazioni di questa
aumentata incidenza di complicanze cardiovascolari si riconosce la particolare alta propensione alle
calcificazioni vascolari. Si stima che circa il 10% della popolazione generale in Europa e Stati Uniti sia
affetta da danno renale e che 2/3 di questi soggetti decedano per complicanze cardiovascolari (CV). Tra i
fattori endocrini e metabolici che sono alla base di questa elevata incidenza di calcificazioni vascolari e
mortalità CV, le alterazioni del metabolismo minerale e osseo sembra possano svolgere un ruolo di
prioritaria importanza. Manca però una conoscenza precisa delle basi fisio-patologiche della connessione
“rene-osso” e degli eventi precoci che la caratterizzano, indispensabile premessa all’ottimizzazione delle
procedure diagnostiche e all’individuazione di nuovi e più efficaci target terapeutici.
Nel glomerulo renale, il podocita è la cellula chiave nel mantenimento della barriera di filtrazione
glomerulare. Nell’osso, l’osteoblasto è la cellula centrale nel mantenimento di un corretto equilibrio del
metabolismo minerale.
Il nostro gruppo in campo renale ed alcuni gruppi in ambito osseo, hanno recentemente ottenuto una serie di
evidenze sperimentali a favore dell’esistenza di sistemi di comunicazione simil-neuronali di tipo
glutamatergico e GABAergico sia nei podociti che negli osteoblasti. Tali sistemi di signaling sembrano
essere cruciali per la funzione di entrambe queste cellule.
In particolare, una serie di lavori sperimentali ha dimostrato che glutamato e GABA costituiscono importanti
meccanismi di regolazione della formazione di osso da parte degli osteoblasti. In vitro, inibitori del recettore
ionotropico del glutamato NMDAR si sono dimostrati capaci di inibire in modo dose-dipendente la
produzione e l’attività di molecole cruciali nella formazione dell’osso, quali fosfatasi alcalina, collagene di tipo
I, e osteocalcina, e di prevenire la mineralizzazione della matrice. Inoltre specifici antagonisti dell’NMDAR
inibiscono la molecola-chiave della differenziazione dell’osteoblasto Core Binding Factor alpha-1 (Cbf -1).
Infine è stato osservato che osteoblasti coltivati in medium iperglicemico mostrano un incremento dell’attività
di trasporto del GABA.
Per quanto riguarda i podociti, la presenza di una comunicazione neuron-like in queste cellule è stata
descritta per la prima volta dal nostro laboratorio. Il nostro gruppo ha dimostrato la presenza in queste cellule
di vescicole simil-sinaptiche che contengono specifici neurotrasmettitori e vanno incontro a processi di
esocitosi/endocitosi spontanea e regolata. Inoltre abbiamo descritto la presenza dei rispettivi recettori a
livello glomerulare. Recenti risultati, non ancora pubblicati, ottenuti nel nostro laboratorio, mostrano come
alterazioni della comunicazione neurono-simile, determinate da alterazioni del rilascio vescicolare o
dall’applicazione di specifici antagonisti recettoriali causano variazioni citoscheletriche podocitarie ed
aumento di permeabilità del glomerulo isolato.
Pertanto, la nostra ipotesi di lavoro è che alterazioni del signaling simil-neuronale possano essere alla base
di concomitanti alterazioni renali e ossee nei pazienti affetti da patologia renale.
Da questo punto di vista, le osservazioni di un fenotipo sia osseo (presenza di cifoscoliosi) che renale
(proteinuria e alterazioni istologiche renali) in modelli sperimentali sembra costituire un iniziale e importante
supporto alla nostra ipotesi di lavoro.
In conseguenza di tale osservazione, e in collaborazione con l’Istituto di Scienze Biomediche dell’Università
di Cardiff, dove i ricercatori hanno acquisito notevole esperienza nello studio degli osteoblasti, abbiamo
iniziato lo studio di una linea cellulare di osteoblasti capaci di differenziare completamente con produzione di
matrice ossea. Il nostro laboratorio è già dotato di strumentazione adeguata per studi morfologici e per
l’esecuzione di metodiche di biologia molecolare e cellulare. Il personale presente ha larga esperienza nello
studio della cellula podocitaria e della cellula endoteliale glomerulare.
Il presente progetto prevede pertanto l’applicazione di un approccio multidisciplinare che comprende studi
neurofisiologici, morfologici e funzionali per analizzare in modo completo i sistemi di signaling similneuronale nei podociti e negli osteoblasti, con particolare attenzione allo studio dei meccanismi comuni di
alterazione del signaling.
Colture di podociti e osteoblasti verranno innanzitutto studiate in modo esaustivo dal punto di vista
neurofisiologico. Intendiamo dotarci di una apparecchiatura che consente di condurre studi neurofisiologici in
modo estremamente standardizzato, grazie all’utilizzo della tecnica di “chip patch-clamping”. Questo
approccio permetterà di ottenere informazioni complete sui sistemi di segnale effettivamente utilizzati da tali
cellule, sui canali ionici attivati da differenti stimoli, sui neurotrasmettitori utilizzati e sui rispettivi recettori
attivati. Inoltre verranno esaminati i meccanismi di adesione intercellulare, data la loro rilevanza nel garantire
l’efficacia del signaling. Le molecole di interesse emerse dagli studi precedenti verranno quindi silenziate o
overespresse in linee cellulari, e tecniche di immunoprecipitazione, western blot, immunocitochimica e live
microscopy saranno applicate per approfondire le interazioni molecolari.
Gli effetti cellulari dell’assenza o dell’eccesso di tali componenti saranno verificati mediante studi morfologici
e funzionali: in particolare saranno considerate le variazioni dell’assetto citoscheletrico, dell’esocitosi di
neurotrasmettitori, e alcune modificazioni funzionali valutabili in vitro, come la permeabilità ad albumina
marcata nel caso dei podociti e la produzione di matrice ossea per gli osteoblasti, e infine le variazioni di
espressione di molecole cellulo-specifiche, quali nefrina e podocina nei podociti, collagene I, fosfatasi
alcalina e Cbf-alpha negli osteoblasti.
Richieste finanziarie
Costo totale
Personale
Funzionamento
Apparecchiature
Totale
0
0
50000
50000
(max € 50.000,00)
Richiesto alla
Fondazione
0
0
40000
40000
Eventuali
cofinanziamenti
0
0
10000
10000
Eventuali Cofinanzionamenti:
Fondazione D’Amico per la Ricerca sulle Malattie Renali : ___10.000,00 __________ (Euro)
____________________: ______________________ (Euro)
____________________: ______________________ (Euro)
____________________: ______________________ (Euro)
DURATA: MESI 24