4- CenniMicroscopia per pdf

L’USO DEL
MICROSCOPIO
OTTICO
Visualizzazione dei microrganismi
La visualizzazione dei microrganismi richiede l’uso del microscopio
ottico o del microscopio elettronico.
Il microscopio ottico composto in campo chiaro permette
l’osservazione di un’immagine scura su uno sfondo luminoso, grazie
alle differenze di contrasto (capacità delle cellule di assorbire o
disperdere la luce) esistenti fra gli stessi e il mezzo circostante.
Esistono diversi tipi di microscopi ottici: in campo chiaro, a contrasto di
fase, in campo oscuro e ad interferenza.
Microscopio ottico in campo chiaro
Microscopio ottico
composto
La parte meccanica del microscopio ottico è
costituita dallo stativo formato da una base
pesante ed un braccio.
Nel braccio sono inserite le manopole per la
messa a fuoco grossolana (macrometrica) e
di precisione (micrometrica).
Il tavolino sorregge i vetrini da esaminare
che sono bloccati mediante dei fermi e porta
montato al di sotto il sistema di lenti del
condensatore.
Le parti meccaniche
fondamentali del microscopio
ottico composto.
Microscopio ottico
composto
La base porta la sorgente luminosa
La luce attraversa le varie lenti del
microscopio (condensatore, obiettivo e
oculare) fino a raggiungere l’occhio.
Un sistema di lenti convergenti, detto
obiettivo, ingrandisce l’oggetto, la cui
immagine viene ulteriormente ingrandita da
un secondo sistema di lenti, detta oculare.
CONDENSATORE
Il percorso della luce in
un microscopio ottico.
Il CONDENSATORE
Condensatore: sistema di lenti che
inviano all’obiettivo la luce.
Il condensatore è provvisto di un
diaframma ad iride (di apertura) che
regola l’ampiezza del cono di luce
che entra nell’obiettivo.
Condensatore con diaframma ad
iride.
Gli obiettivi
Obiettivi che sono sistemi di lenti convergenti
che danno la prima immagine ingrandita del
campione.
Sono avvitati su un portaobiettivo a revolver
che ne porta fino a sei a diverso
ingrandimento.
Sistema di
dell’obiettivo.
lenti
Il valore dell’ingrandimento (da 20x, 40x, 60x
e 100x) è inciso sulla montatura come lo
spessore dei vetrini coprioggetto (0,17 mm).
Sono indicati i valori dell’apertura numerica
dei diversi obiettivi.
Obiettivi montati su un portaobiettivi a revolver.
Gli obiettivi
GLI OCULARI
L’oculare può essere unico oppure doppio.
L’oculare porta inciso un numero sulla
montatura che indica il suo potere di
ingrandimento (10x, 15x).
Questo valore, moltiplicato per l’ingrandimento
dell’ obiettivo, dà l’ingrandimento totale del
microscopio nell’osservazione visiva.
Oculare con inciso sulla
montatura il proprio
ingrandimento.
Ingrandimento del microscopio
L’ingrandimento totale di un microscopio
ottico nell’osservazione visiva, è dato dal
prodotto dell’ingrandimento proprio
dell’obiettivo e quello dell’oculare.
Il microscopio ottico composto permette di
ottenere un ingrandimento utile massimo
di circa 1000-1500 X (volte).
La massima risoluzione di un microscopio
ottico è 0,2 µm. Un ingrandimento
superiore fornice un’immagine sfuocata
per via della proprietà fisica nota come Calcolo dell’ingrandimento
totale di un microscopio ottico.
risoluzione o potere di risoluzione.
Ingrandimento dell’immagine
Il microscopio ottico utilizza il sistema di lenti dell’obiettivo per indirizzare e
focalizzare i raggi luminosi in modo da produrre un’immagine ingrandita di
oggetti molto piccoli.
L’occhio umano può essere considerato un microscopio semplice.
l’immagine di un oggetto (Ob) formata sulla retina, è più piccola quando questo
è lontano dall’occhio (Im1) rispetto a quando lo stesso oggetto è più vicino
(Im2).
Microscopio semplice: ingrandimento dell’immagine nell’occhio umano.
Ingrandimento dell’immagine
L’osservatore mette a fuoco l’oggetto
regolando la distanza dalla lente
dell’oculare e da quella dell’obiettivo
fino a che non si forma un’immagine
nitida.
Nel diaframma oculare del microscopio si
forma un’immagine reale ingrandita e
capovolta rispetto all’oggetto. L’occhio
percepisce un’immagine virtuale
ingrandita e dritta rispetto all’oggetto.
Immagine
reale
Formazione dell’immagine nel microscopio ottico composto
Ingrandimento dell’immagine
Immagine
virtuale
ingrandita e
dritta rispetto
all’oggetto
Immagine reale
ingrandita e
capovolta
Formazione dell’immagine nel microscopio ottico composto.
IL POTERE DI RISOLUZIONE
La massima risoluzione di un microscopio ottico è 0,2 µm. Due oggetti che si
trovano ad una distanza inferiore l’uno dall’altro non possono essere osservati
distintamente ma appaiono come oggetto unico o come dischi sovrapposti.
D < 0,2 µm
D < 0,2 µm
D > 0,2 µm
IL POTERE DI RISOLUZIONE
Il potere di risoluzione del microscopio ottico è la distanza minima (d) che deve
intercorrere tra due punti dell’oggetto per poterli distinguere come separati.
Il potere di risoluzione (d) è funzione della lunghezza d’onda della luce utilizzata
(λ) e di una proprietà caratteristica dell’obiettivo conosciuta come apertura
numerica (n sen θ).
L’apertura numerica (n sen θ) = prodotto dall’indice di rifrazione (n) del mezzo
interposto fra il preparato e la lente frontale dell’obiettivo e l’apertura angolare
(θ), che rappresenta l’ampiezza angolare del cono di raggi di luce raccolti dalla
lente dell’obiettivo e provenienti dal campione.
Lente obiettivo
Sen θ
oggetto
Sorgente luminosa
IL POTERE DI RISOLUZIONE
Il potere di risoluzione (d) del microscopio è maggiore quando si utilizza luce
nello spettro del blu (lunghezza d’onda più breve pari a 500 nm o 0,5 µm) e un
obiettivo con un’apertura numerica elevata.
L’apertura numerica (n sen θ) può essere aumentata utilizzando diversi mezzi.
L’immersione in olio aumenta l’indice di rifrazione (n; aria=1, olio=1,5).
Il valore massimo di sen θ è 1 (sen 90°).
Modificazione dell’apertura angolare (θ) con l’immersione omogenea e non omogenea.
λ= da 200 nm (0,2 µm) luce ultravioletta a 900 nm (0,9 µm) luce nell’infrarosso
λ= 500 nm (0,5 µm) luce blu
λ= 700 nm (0,7 µm) luce rossa
n aria = 1
n olio= 1,5
n sen θ con aria = 1
n sen θ con olio= 1,5
d=
0,5
1
0,5
d = n sen θ
0,5
d = 1,5
d = 0,50
d = 0,33
0,7
d = n sen θ
0,7
d=
1
d = 0,70
d=
d = 0,46
0,7
1,5
Per aumentare il contrasto si possono colorare le cellule
microbiche o le strutture batteriche mediante colorazioni
semplici o differenziali (es. Gram reazione).
Esistono diversi tipi di microscopi ottici: in campo chiaro, a
contrasto di fase, in campo oscuro e ad interferenza.
Colorazione semplice.
Tipi di microscopio
Le cellule viventi prive di pigmenti non sono chiaramente visibili al microscopio in
campo chiaro per la scarsa differenza di contrasto esistente tra le cellule e l’acqua.
Il microscopio in campo oscuro si ottiene collocando un diaframma per campo
oscuro sotto il sistema delle lenti del condensatore di un microscopio ottico. In
questo modo si crea un cono di luce cavo che colpisce l’oggetto e solo la luce
riflessa e rifratta proveniente dal campione formerà l’immagine.
Il microscopio a contrasto di fase trasforma piccole differenze dell’indice di
rifrazione e della densità cellulare in variazioni dell’intensità luminosa facilmente
individuabili.
Fotomicrografia in campo chiaro (a), in campo oscuro (b) e a contrasto di fase (c).
Microscopia a fluorescenza
Nella microscopia a fluorescenza il campione colorato con coloranti fluorescenti
(fluorocromi) o dotato di fluorescenza naturale (autofluorescenza) esposto a
luce con bassa lunghezza d’onda (luce ultravioletta), emette luce a lunghezza
d’onda superiore. Un condensatore per campo oscuro consente di osservare
l’oggetto fluorescente che brilla sopra uno sfondo scuro.
Osservazione a fluorescenza di batteri e alghe.