valutazione degli esami istologico, ponderale e chimico sulle tiroidi

Anrr 1st. Super. Sanità
Vol. 23. N. 1 (1987), pp. 129-134
VALUTAZIONE DEGLI ESAMI ISTOLOGICO, PONDERALE E CHIMICO SULLE TIROIDI
DEI BOVINI QUALI ELEMENTI PER IL CONTROLLO DEL TRATTAMENTO ILLEGALE
CON TIREOSTATICI
(a) Laboratorio di Medicina Veterinaria, (b) Laboratorio d i Chimico del Farmaco, (C) Ospite del Laboratorio d i Chimica del Farmaco ,htituto Superiore di Sanità, Roma; (d) Centro Carni,Roma
Riasmnto. - Viene qui descritto uno studio effettuato
su tiroidi bovine allo scopo di ricercare u n procedimento
di screeningpreliminare al metodo chimico, il pid idoneo
possibile per individuare gli animali trattati illegnlmente
con tireostatici A tal fine, tiroidi di boviniadulti, per un
totale di 86 campioni, sono state prelevate presso
pubblici macelli e, successivamente, sono state sottoposte alle indagini seguenti: a) rilevamento del peso; b)
emme istologico; C ) ricerca dei residui d i tireostntici
(tioumcile, metiltioumcile, propiltioumcile, feniltioumcile e metimazolol mediante una metodica baaata sulia
cromatografi su strato sottile ad alta risoluzione con
tecnica bidimensionale. L'impiego del metodo chimico
ho consentito di mettere in evidenza che le tiroidi di
peso non superiore ai 50 g, istologicamente normali od
alterate, non contenevano residui di tireostatici AI
contrario, 3 dei 5 campioni di tiroidi dipeso superiore a
tale valore, sia con quadro istologico normale che altemto, contenevano residui di metiltioumcile. Questi
risultati mostmno che ia presenza dei residui di tireostatici è correlata, anche se in modo parziale, con
l'aumento del peso delle ghiandole e non con le alterazioni irtologiche che si riveiano, quindi, non sirettamente specifiche per le sostanze qui considemte. Sullo base
dei dati ottenuti, si ritiene opportuno proporre, per le
tiroidi di bovini, il peso di 50 g come limite massimo
della norma e, di conseguenza, si ravviso ia necessitd di
sottoporre all'indagine chimica quelle ghiandole che
superano, come peso, questo valore
Summary (Evduation o f histological, gravimetric and
chemical examinations o n thyroid glands o f cattle as
means t o eontrol the iilegal treatment with thyreostatics). - A comparative study of hwtological, gravimeiric and chemical examinationr o n thyroid giands of
cattle to evaluate the most weful screening test, preliminary t o the chemical method, t o detect the illegal
irmtment with thyreostatics, is herein dexribed. T o t h k
purpose, a total of 86 thyroids of adult bovinm sampled
in the slaughter h o w e have been submitted to the
following investigotions: a) weight determination; b )
histological examimtion; C ) detection of thyreostatics
residues (thiouracil, methylthiouracil, propylthioumcil,
phenylthioumcil and methimazole) by using a method
based o n two-dimensionnl high performance thin-iayer
chromatography. B y wing the chemical method it has
been possible t o notice that thyroidgianda with a weight
not exceeding 50 g, histologically normal or altered, did
not contain thyreostatics residues. On the contrary, 3
out of 5 thyroid giands of a weight superior t o this
d u e , with normal or altered histological aspect, showed
residues of methylthiauraciL These results show that the
presence o f thyreostatics residues is correiated, even if
partially, with un increased weight of thegiands but not
with any hixtological modificationr which indeed show
to be not sirictly specific for the above mentioned
substances. OR the basis of data hereby obtnined, we
consider suitable to suggest, for the bovine thyroids, the
weight of 50 g as maximum limit of normal weight and,
consequentiy, we belieue it necessary t o analyze with the
chemicol method thosegiands which exceed t h k wlue in
weight.
L'uso fraudolento dei tireostatici nell'allevamento
animale rappresenta u n potenziale rischio per la salute
del consumatore per una eventuale presenza nelle carni
dei residui di tali farmaci antitiroidei ad elevata attività.
Per questa ragione, precise disposizioni legielative emanate ma in ambito comunitario che nel nostro paese, si
propongono di impedire l'illecita utilizzazione dei
tireostatici in campo zootecnico. La direttiva del Consiglio deUe Comunità Europee del 31 luglio 1981 [l]
vieta infatti l'immissione sul mercato dei tireostatici e
delle sostanze stiibeniche ai fini ~ U X ~ N InC ~Italia.
già con il DM del 15 gennaio 1969 [2] era vietato agli
allevatori di detenere o somministrare agli animali
sostanze ad azione ormonale od antiormonale; succeeai-
vamente, con il DM del 3 novembre 1981 [3], veniva
proibita la vendita dei medicinali per uso veterinario
contenenti sostanze stilheniche, loro derivati, sali ed
esteri, e sostanze tireostatiche.
I farmaci ad azione antiormonale più frequentemente
utilizzati ai fini dell'ingrasso sono di tipo tiouracilico e
comprendono le seguenti sostanze: 2-tiouracile (TU);
6-metil-2-tiouracile
(MTU); 6-propil-2-tiouracile
(PTU) e 6-fenil-2-tiouracile
(PhTU). Oltre a questi
composti, risulta illecitamente somministrato con una
certa frequenza anche il metimazolo o tapamlo (TAP).
E' noto che queste mstanze agiscono mibendo la funzione della tiroide in quanto interferiscono a livello deila
biosintesi degli ormoni tiroidei [4]. Di conseguenza, si
instaura nell'animale uno stato di ipotiroidiamo che
favorisce apparentemente la sua crescita, ma in realtà
l'aumento di peno osservato è dovuto, in massima parte,
ad una ritenzione di acqua nei tessuti e al livello del tubo
gastro-enterico. La ridotta produzione degli ormoni
tiroidei provoca, a sua volta, un aumento della secrezione dell'ormone tireotropo da parte dell'ipofiai,
aumento che &mola la tiroide ad ipertrofiezarai con il
suo conseguente ingrossamento.
Alcuni autori [5], sulle base di questa constatazione,
hamo proposto di considerare l'aumento ponderale deiia
ghiandola tiroide come diegnoai indiretta di somministrazione illegale di sostanze tireostatiche nel bestiame.
Infatti, in un loro studio effettuato SU 45 bovini adulti
con tiroidi di peso normale od ingrossate (ghiandole con
peno superiore a 60 g), hanno mesm in evidenza, con
i'applicazione di una metodica analitica basata d a
cromatografia su strato sottile, che 21 di esse, con peso
tra 68 e 254 g, contenevano residui di MTU o di TPA.
Il criterio di considerare mspene le tiroidi con peso
oltre i 60 g, è stato suggerito anche da Pochard [6]. In
una indagine effettuata su 181 bovini al macello, questo
autore ha infatti riscontrato, mediante un metodo basato su& cromatografia su strato sottile, che il 67% delle
tiroidi esaminate, con peno tra 30 e 600 g, mntenevano residui di MTU. Tale ricerca, tuttavia, non consente
di trarre conclusioni definitive circa l'importanza del
peso di tale ghiandola, pur essendo emerso, dai dati
riportati daii'autore, che la percentuale dei casi positivi
era maggiore per le tiroidi con peso superiore al normale.
Per quanto riguarda L'impiego dell'esame ietologico
deila ghiandola tiroide al fine di mettere in evidenza
l'uso illegale dei tireostatici, in base agli studi effettuati
da Pottie [7], risulta che tale tecnica richiede una valutazione molto attenta e cauta. Secondo questo autore
sussiste, infatti, la possibilità di ottenere risultati falsaniente pontivi, poiché le alterazioni iatologiche che si
riscontrano, non sempre sono da considerarsi ntrettamente apecifiche per tali composti.
Tenuto conto che nei lavori sopra citati i dati sperimentali presentano varie difficoltà di interpretazione e di
valutazione, abbiamo ritenuto utile eseguire un'indagine
su tiroidi di bovini prelevate presso pubblici macelli allo
scopo di confrontare e valutare i risultati ottenuti con
l'applicazione contemporanea delle tre tecniche seguenti: esame istologico, metodo chimico specifico per la
determinazione dei tireostatici e rilevaeione del peso
delle ghiandole.
Prelievo e pesata dei campioni. - Presso pubblici
macelli di Roma, sono state prelevate 86 tiroidi da
altrettanti bovini di ambo i sessi, di età compresa fra i 2
e i 7 a m i e il cui peso vivo variava da 194 a 502 kg.
Ciascuna ghiandola, dopo la rilevazione del peso, veniva
suddivisa in due aliquote, di cui una era fissata immediatamente in formalina salata al 10% e l'altra congelata
a -20 'C. Il tempo intercorso tra l'abbattimento delI' animale ed il prelievo del campione era di 2-3 ore
circa.
Metodo istologico. - I preparati istologici delle tiroidi
mno stati allestiti mediante i due seguenti procedimenti:
1) Preparazione delle sezioni direttamente al criostato, partendo dall'aliquota congelata; la rimanente
porzione veniva conservata per le analisi con il metodo
chimico.
2) Taglio delle sezioni previa loro inclusione in
paraffina partendo dall'aliquota di tiroide precedentemente fissata in formalina.
La colora%ionedelle sezioni istologiche veniva effettuata, in entrambi i caai, mediante la metodica convenzionale basata sull'impiego di ematossilina-eosina [E]. Si
è operato con le due metodiche istologiche su ogni
campione di tiroide per escludere ogni possibile artefatto
al tipo di conservazione adottato.
Metodo chimico. - La ricerca dei residui delle sostanze tireostatiche (TU, MTU, PTU, PhTU e TAP) neUe
tiroidi è stata effettuata mediante cromatografia su
strato sottile con tecnica bidimensionale. I1 metodo
utilizzato era quello proposto in sede CEE [9], modificato da alcuni di noi per la parte concernente il procedimento di estrazione dei residui dal tessuto e di purificazione dell'estratto, allo scopo di rendere meno complessa
l'esecuzione della metodica [lo]. I1 limite di rivelazione
del metodo così modificato risulta dello stesso ordine di
grandezza di quello previsto nel metodo comunitario,
precisamente 0 , l ppm circa per ciascun tireoetatico in
esame.
In breve, il procedimento da noi impiegato consisteva
nell'estrarre le sostanze tireostatiche, sopra precisate, dal
temuto tiroideo con metanolo. La soluzione acquoso-metanolica, dopo lavaggio con etere di petrolio,
veniva evaporata fino a secchezza ed il residuo, disciolto
in cloroformio-metanolo 99:1, veniva purificato mediante passaggio attraverso una cartuccia di Sep-Pak
silica. 1 tireostatici venivano eluiti con la miscela etile
acetato-metanolo 1 : l . Succeaeivamente si procedeva
alla preparazione dei d~rivatidei residui dei tireostatici
con il reattivo NBD-CI (7-cloro4-nitrobenzo-2ossa-1,3 diazolo), derivatizzando, nelle medesime
condizioni, anche i tireostatici di riferimento. La separazione dei derivati veniva effettuata mediante cromatogafia su strato sottile con tecnica bidimensionale su
lastre HPTLC (High Performance Thii-1,ayer Chromatograpy) al gel di silice 60, senza indicatore di fluorescenza. Per lo sviluppo delle lastre si utilizzava per la
prima direzione il sistema di solventi cloroformio (stabilizzato con amilene)-etanolo assoluto 95:5 e per la
seconda direzione cloroformio (stabilizzato con amilene)-acido propionico 95:5. Successivamente la lastra
veniva spruzzata con un reattivo alla cisteina ed i derivati
dei tireostatici apparivano come macchie fluorescenti per
esame della lastra al transilluminatore (365 nm). L'identità dei tireostatici eventualmente presenti nel campione
veniva &abilita mediante confronto dei valori di Rf con
quelli ottenuti per i tireostatici di riferimento. Per i
campioni risultati positivi, si procedeva alla conferma
dell'identità del tireostatico riscontrato nel campione in
esame mediante co-cromatografia. Secondo tale tecnica
si deponeva sulla lastra, nel punto di deposizione del
campione, anche una opportuna aliquota della soluzione
del tireostatico di riferimento la cui presenza era stata
messa in evidenza nel campiono. Per lo sviluppo, lo
spruzzo e l'esame della lastra si procedeva in modo analogo a quanto sopra deucritto. Come risultato si deve
ottenere l'esatta coincidenza della macchia del tireostatic0 di riferimento, aggiunto al campione, con quella del
tireostatico presente nel campione.
Nella Fig. 1 sono riportati, per i bovini esaminati, i
dati concernenti il peso rilevato per le tiroidi ed i risultati ottenuti con l'esame istoiogico e con il m ~ t o d o
Fig. 1. - Istogramma della distribuzione di frequenza del peso
delle tiroidi esaminate ( n . 86 campioni in totale). Sul grafico
sono anche riportati i dati ottenuti con l'esame iutologico e con
quello chimico.
chimico. In relazione al loro peso le tiroidi sono state
suddivise in sette classi, i cui limiti estremi vanno da 1 0 a
80 g. Come si può rilevare dalla figura, la maggior parte
delle tiroidi risulta distribuita nelle prime tre classi, che
comprendono ghiandole con peso da 10 a 40 g.
E' da precisare che non è stata riscontrata alcuna
proporzionalità tra il peso della tiroide e il peso vivo
dell'animale, anche in relazione al sesso, in accordo con i
dati ottenuti da altri autori [6] per quanto concerne gli
animali adulti.
Sulla base del reperto istologico, invece, i campioni
sono stati suddiviai in tre gruppi e precisamente: tiroidi
con quadro istologico normale ( l 0 gruppo); tiroidi con
lieve ipertrofia dell'epitelio follicolare (2' gruppo) e
tiroidi con iperplasia dell'epitelio follicolare (3' gruppo).
I1 primo gruppo risulta il più numeroso e comprende il
79% dei campioni esaminati, nel secondo gruppo la
percentuale dei campioni scende al 15% , mentre nel
terzo eusa è relativamente modesta, essendo pari al 6% .
I risultati ottenuti con limpiego del metodo chimico,
confrontati con il reperto istologico e con il peso delle
tiroidi, consentono di formulare alcune considerazioni di
carattere generale. Si è osservato, infatti, che non esiute
alcuna correlazione tra il quadro iutologico riscontrato e
la presenza dei residui di tireostatici, mentre si potrebbe
ipotizzare una correlazione, seppure parziale, tra peso
delle ghiandole e presenza di residui. Considerando,
infatti, le tiroidi di peso 10-50 g, che secondo la letterstura rientrano neiia norma, sono risultate negative
allesame chimico sia quelle con quadro istologico
normale che quelle con epitelio follicolare ipemofico o
iperplautico. Dei cinque campioni di tiroidi con peso
superiore ai 50 g, appartenenti cioè alle ultime tre classi
di peso, ne sono risultati positivi tre: due classificati
istologicamente normali (residui di MTU non superiori a
0,s ppm) ed il terzo con epitelio follicolare iperhofico
(MTU presente alla concentrazione di 1 0 ppm circa). E'
da precisare che la valutazione della concentrazione
dell'MTU riscontrato nelle tiroidi è stata effettuata in
modo semiquantitativo mediante comparazione visuale
sulla lastra cromatografica delllntensità di fluorescenza
della macchia di MTU presente nel campione con quella
della macchia della corrispondente sostanza di riferimento a concentrazione nota.
Sulla base dei risultati da noi ottenuti, sembrerebbe
quindi utile, ai fini delle indagini di controllo, considerare l'incremento ponderale delle ghiandole come indice
di soapetto trattamento con sostanze tireostatiche,
in accordo con quanto osservato da Vos et oL [SI; tenuto
però conto dei casi positivi da noi riscontrati, il limite
massimo del peso "normale" di una tiroide dovrebbe
essere fissato a 50 g anziché sul valore di 6 0 g come
proposto da questi autori. Secondo alcune ricerche di
Verheke [ I l ] , è risultato che soltanto una somministrazione molto prolungata di tireostatici nei bovini è in
grado di provocare sintomi di ipotiroidismo, che si
maniiestano nella ghiandola con il suo ingrossamento e
con I'ipertrofia follicolare. Ciò è stato confermato anche
in una indagine eseguita recentemente da alcuni di noi
[12], nella quale la somministrazione di MTC per 35
giorni a vitelloni ha provocato un evidente aumento
ponderale delle ghiandole accompagnato da un netto
quadro di iperplasia follicolare (Fig. 2). Sempre secondo
Fig. 2. - Tiroide di vitellone canadese trattato per 35 giorni eon
metiltiouracile ed abbattuto dopo 48 ore dalla mapensione del
trattamento. Il pem della ghiandola era di 58 g. E' evidente La
caratteristica pmliferazione del'epitelio folìiwlnre (iperplasia
foliiwlare). Colorazione wn emztossilim-eosina, 250 x.
le affermazioni di Verbeke [Il], anche tiroidi di peso
normale p o s o n o contenere residui di tireostatici;
mentre questo fatto ha trovato conferma negli studi
sopra menzionati di Pochard [6], non altrettanto è
awenuto nell'indagine da noi qui descritta, nella quale i
residui delle sostanze in questione sono sempre risultati
assenti nelle ghiandole con peso considerato n o r m a l ~ .
Per spiegare la mancanza di correlazione da noi
trovata tra i risultati dellesame istologico (campioni con
aspetto ipertrofico o iperplastico) e dall'esame chimico
(assenza di residui) possono e w r e avanzate alcune ipotesi. Una prima spiegazione potrebbe essere quella dell'assunzionc, da partc dcgli animali, di sostanze ad attività
gozzigena naturalmente presenti in alcuni foraggi [7].
Può anche accadere che un esame istologico risulti
positivo quando l'animale non viene abbattuto immediatamente dopo il trattamento con tueostatici; in tal
caso le tiroidi mostrano una iperplasia persistente ed un
peso molto elevato, anche dopo 60 giorni dalla mspensione del trattamento, ma non presentano più residui
evidenziabili con l'analisi chimica [6]. Esiste infine la
possibilità che alcune tiroidi diano all'esame iatologico
risultati falsamente positivi quando tale esame non
viene eseguito entro poche ore dalla morte dell'animale, in quanto si instaurano precocemente i fenomeni
autolitici che alterano il normale quadro istologico; ciò
awiene se le tiroidi non vengono congelate entro 2448
ore dalla mscellaeione.
Dall'insieme dei dati rilevati nella presente indagine,
si può affermare quindi che l'esame istologico della
ghinndola tiroide rappresenta un parametro di screening non sempre affidabile per evidensiare un trsttament o dei bovini con tireostatici. Al contrario, le variazioni
ponderali delle tiroidi debbono far sospettare un' avvenuta somministrazione e le ghiandole di peso superiore ai normale vanno necessariamente sottoposte
au'analisi chimica per la ricerca di eventuali residui.
Riceuuto il 15 maggio 1986
Accettato
il 22 luglio 1986
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