Organismi modello

APPENDICE
Organismi modello
Batterio, Escherichia coli
Lievito gemmante, Saccharomyces cerevisiae
Muffa del pane, Neurospora crassa
Nematode, Caenorhabditis elegans
Arabetta comune, Arabidopsis thaliana
Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster
Topo domestico, Mus musculus
Gli uomini si distinguono dagli altri organismi per le
loro capacità cognitive e per lo stupore nei confronti di
ciò che li circonda, ed è questa curiosità che ci porta a
studiare la vita. Come siamo fatti? Come funzioniamo?
Per comprendere gli uomini e le altre creature viventi, i
ricercatori hanno studiato una grande varietà di organismi viventi. Questi studi hanno portato a molte scoperte, comprese alcune incredibili caratteristiche universali condivise da tutti gli esseri viventi. Tutti gli organismi usano gli stessi amminoacidi, gli stessi nucleotidi e
praticamente lo stesso codice genetico.
Nella biologia molecolare c’è qualcosa di più del
desiderio di soddisfare la nostra curiosità sul funzionamento della vita. Cerchiamo anche di comprendere le cause delle malattie e di applicare le nostre conoscenze alla medicina, all’agricoltura e alla tecnologia. In questo libro diverse volte abbiamo riportato
parecchi esempi di come abbiamo acquisito informazioni sulle malattie umane, le loro cause e talvolta su
come affrontarle, curarle o prevenirle. Gli scienziati
hanno scoperto gli antibiotici per curare la maggior
parte delle infezioni batteriche, sviluppato vaccini
per molti tipi d’infezioni virali e oggi sanno molto di
più sul cancro e sono disponibili più terapie. La maggior parte di queste scoperte e progressi deriva dallo
studio degli organismi modello.
 Pochi organismi costituiscono dei modelli
per la comprensione dei processi vitali comuni
Gli scienziati studiano vari organismi. Quando una
specie particolare viene scelta da molti laboratori per
ricerche intense viene definita organismo modello.
Questo interesse per una specie da parte di molti laboratori permette di ottenere una grande quantità di
informazioni che ci forniscono conoscenze approfondite sulle funzioni di quell’organismo vivente. L’organismo è considerato un modello perché i ricercatori
ipotizzano che quello che hanno appreso su di esso
sarà vero anche per organismi affini. Lo specifico organismo selezionato per uno studio dipende dal problema in esame. In questo libro, abbiamo visto il contributo degli organismi modello alla nostra conoscenza di biologia molecolare e molti degli organismi utilizzati più frequentemente vengono passati in rassegna in questa Appendice.
M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore
2 APPENDICE Organismi modello
Dobbiamo osservare, però, che a volte, un organismo che si trova “fuori dal cammino tracciato” viene studiato solamente da pochi laboratori, semplicemente per curiosità e anche questi studi possono avere un grande impatto sulla ricerca. Per esempio, Thermus aquaticus ci ha fornito la Taq polimerasi per la
reazione a catena della polimerasi (PCR; vedi Capitolo 7 Come è stato scoperto). Lo studio di Tetrahymena
thermophila ha portato a scoprire gli RNA catalizzatori (come i ribozimi; vedi Capitolo 16). E gli studi di alcuni virus poco noti degli insetti, i baculovirus, hanno dato origine a sistemi di espressione delle proteine ricombinanti oggi ampiamente utilizzati
(vedi Capitolo 7).
Focalizzare l’attenzione su pochi organismi diversi
è importante a livello pratico perché ci sono molte più
specie che scienziati. In effetti, fare di un organismo
uno strumento scientifico per la ricerca non è semplice. Sono necessari molti anni di studio per comprendere l’organismo e acquistare familiarità con il suo ciclo vitale, la sua corretta alimentazione, la sua crescita
ottimale e le condizioni di conservazione. Particolarmente dispendioso in termini di tempo è lo sviluppo
di tecniche genetiche per la manipolazione del genoma dell’organismo. Non ci sono “procedure standard”
per questo; le tecniche genetiche sono per lo più specifiche per quell’organismo e spesso vengono trovate
per tentativi ed errori. Questa è la ragione per cui è importante che molti laboratori lavorino sullo stesso organismo e condividano le loro conoscenze. Una massa
critica d’interesse per un organismo modello porta alla fine a congressi internazionali, banche dati online, e
alla formazione di centri di stoccaggio che mantengono e distribuiscono i ceppi.
Perché fra tutti gli organismi esistenti al mondo ne
sono stati scelti proprio alcuni? Le scelte sono spesso
state fatte con una buona dose di casualità. Tuttavia,
alcune caratteristiche comuni sottolineano l’utilità di
un organismo come modello. Gli organismi modello
devono avere un ciclo di vita rapido. Devono dar vita a
un’ampia progenie, così che i ricercatori possano trovare e studiare eventi genetici rari. Anche la dimensione
è importante, perché gli organismi grandi e la loro ampia progenie esaurirebbero velocemente lo spazio di un
laboratorio. Gli organismi modello dovrebbero potersi propagare velocemente usando una fonte alimentare semplice ed economica. Ci dovrebbe essere un modo conveniente per una conservazione a lungo termine in modo da poter accumulare i ceppi per studi successivi. La Tabella A.1 riassume alcune caratteristiche
degli organismi modello qui descritti.
Gli studi di genetica e delle vie metaboliche dei
primi anni del Novecento utilizzarono organismi pluricellulari complessi come le piante, i moscerini della
frutta, i ratti e i topi. Poi i ricercatori si accorsero che
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anche gli organismi unicellulari sono idonei per studi fondamentali sui geni e sul metabolismo cellulare. Negli anni Quaranta, microrganismi come Escherichia coli, il lievito e Neurospora crassa sono diventati
i modelli più utili per la comprensione della chimica
di base della vita. Forniscono anche un materiale di
partenza migliore per i biochimici rispetto ai tessuti
animali, perché gli organismi unicellulari sono una
popolazione di cellule identiche, mentre i tessuti sono costituiti da tipi cellulari diversi.
Nessun organismo modello può fornire le risposte
a tutte le domande sulla vita. Gli organismi unicellulari continuano a dirci molto sugli aspetti centrali dei
processi fondamentali della vita, come la replicazione cromosomica, la riparazione del DNA, la ricombinazione, l’espressione genica, le vie di trasduzione del
segnale e il controllo del ciclo cellulare. Ma gli organismi unicellulari non sono sufficienti per rispondere a
domande sullo sviluppo degli organismi pluricellulari
e sulla maggior parte delle malattie. Per questo vengono molto utilizzati il verme nematode e il moscerino
della frutta, per scoprire come sono organizzati gli organismi pluricellulari e per i fondamenti di base di come è determinato il piano di sviluppo corporeo animale. Questi organismi ci forniscono anche informazioni
su molti tipi di malattie. Allo stesso modo, Arabidopsis
thaliana è stata scelta come organismo modello per lo
sviluppo delle piante.
Fra tutti, il modello più utile per lo studio delle malattie umane è il topo. Questo non è però il più semplice tra gli organismi modello. Per facilità di allevamento
e manipolazione del DNA, il topo crea molte più difficoltà degli altri organismi modello. Ottenere ceppi di
topo geneticamente alterati è costoso e lungo. Ma uno
dei grandi vantaggi del topo è che il 99% dei suoi geni
ha degli omologhi nell’uomo, e tra questi ci sono anche
geni associati a malattie umane. Quindi, nonostante le
difficoltà, il topo è un modello interessante per studiare le malattie che ci colpiscono.
In questa Appendice presentiamo una breve panoramica dei diversi organismi modello oggi in uso,
spiegando anche come hanno contribuito e continuano a contribuire alla nostra comprensione della vita.
Come abbiamo notato, anche molti altri organismi
hanno contribuito significativamente alla nostra comprensione dei processi viventi, tra cui i batteriofagi e
altri virus, Tetrahymena thermophila (un protozoo),
Schizosaccharomyces pombe (un lievito che si divide
per scissione), Xenopus laevis (un rospo), e Brachydanio rerio (pesce zebra). Prima di entrare nei dettagli
di particolari organismi modello, descriviamo brevemente alcuni episodi di come, studiando gli organismi modello e utilizzando la genomica e le tecniche
di coltura cellulare, abbiamo ampliato le nostre conoscenze sulle malattie umane.
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Intestino
dell’animale
1-2 μm
Fissione asessuata;
a volte
coniugazione
20 minuti
Capsule Petri
o colture liquide
Estratto di lievito
e brodo di triptoni;
si possono usare
terreni definiti
Stock congelati
in glicerolo;
cellule liofilizzate
Habitat naturale
Dimensione
Riproduzione
Tempo
di generazione
Condizioni
di crescita
Fonte alimentare
Conservazione
Caratteristiche di base
Tipo di organismo
Batterio unicellulare
E. coli
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Stock congelati
in glicerolo;
cellule liofilizzate
Estratto di lievito,
peptone;
si possono usare
terreni definiti
Capsule Petri
o colture liquide
70-90 minuti
Asessuata,
gemmazione
(mitosi); sessuata,
sporulazione
(meiosi)
4-6 μm
Superficie delle
piante
Eucariote, fungo
ascomicete
unicellulare
S. cerevisiae
Spore
congelate-anidre
Mezzi completi o
definiti (zuccheri,
sali inorganici,
biotina e azoto)
Capsule Petri,
provette graduate
o coltura liquida
3-4 settimane
(per riproduzione
sessuata)
Asessuata,
formazione
di filamenti;
asessuata,
sporulazione
Irregolare
Eucariote, fungo
ascomicete
filamentoso
multinucleato
Vegetazione morta
N. crassa
TABELLA A.1 Informazioni principali su sette organismi modello comuni
10-20 cm
Clima temperato
globale
Eucariote, pianta
angiosperma
A. thaliana
2,5 mm
Frutta marcia
Eucariote, insetto
D. melanogaster
Congelati a –80 °C
Batteri
(E. coli)
Capsule Petri
o colture liquide
50 ore
Semi
Luce, acqua,
fonte di azoto
e altri minerali
(per esempio
fertilizzanti)
Capsule Petri
o piccoli vassoi
orticoli
6 settimane
Propagazione vitale
Lievito e melassa,
frutta
Bottiglie o provette
12 giorni
Sessuata, auto- e
Sessuata, auto- e
Sessuata,
cross-fecondazione;
cross-fecondazione
accoppiamento
alcuni asessuati
1 mm
Suolo
Eucariote, verme
nematode
C. elegans
(segue)
Embrioni congelati
Sostanze vegetali
Gabbie
9 settimane
Sessuata,
accoppiamento
17 cm
Abitazioni, campi
Eucariote,
mammifero
M. musculus
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APPENDICE Organismi modello 3
1 (aploide)
4 639 675 bp
Numero di geni
4410
Geni simili all’uomo 8%
Nomenclatura
dnaA
genica
convenzionale
Nomenclatura
DnaA
proteica
convenzionale
Sito web
www.ecocyc.org
del genoma
Numero
di cromosomi
Statistica genetica
Dimensione
del genoma
E. coli
ww.broadinstitute. www.wormbook.org
w
org/annotation/
genome/
neurospora/
MultiHome.html
www.yeastgenome.
org
FEM-3
arg
Gcn4
21 035
25%
fem-3
11 (diploide,
maschio), 12
(diploide,
ermafrodita)
100 269 917 bp
C. elegans
11 000
6%
arg
7 (aploide); 14
(diploide)
42 900 000 bp
N. crassa
6000
30%
GCN4
16 (aploide); 32
(diploide)
12 070 898 bp
S. cerevisiae
TABELLA A.1 Informazioni principali su sette organismi modello comuni (continua)
RY
14 065
50%
ry
8 (diploide)
166 600 000 bp
D. melanogaster
www.arabidopsis.org www.flybase.org
AAO
25 540
18%
AAO
10 (diploide)
119 186 997 bp
A. thaliana
www.jax.org
Cdc20
29 083
99%
Cdc20
40 (diploide)
2 729 273 687 bp
M. musculus
4 APPENDICE Organismi modello
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APPENDICE Organismi modello 5
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 Per studiare le malattie umane si usano
tre metodi
Che cosa determina un infarto, il diabete, le malattie
neurodegenerative o il cancro? Come possono queste
o altre malattie essere prevenute, trattate o curate? Lo
studio degli organismi modello è in genere il primo passo per comprendere i processi cellulari che possono essere modificati nelle malattie umane. Usando un omologo, possiamo studiare una mutazione che porta a una
malattia umana in un organismo modello e capire come la mutazione alteri processi molecolari, cellulari o
dell’organismo. Inoltre, i modelli murini sono spesso
usati per valutare approcci terapeutici per le malattie,
come primo passaggio nello sviluppo di un farmaco.
Gli organismi modello sono spesso il primo passo per
la comprensione delle malattie umane, ma la genomica
umana e le colture cellulari possono fornire una comprensione ancora più profonda.
La disponibilità della sequenza del genoma umano
completa è stata di enorme aiuto sia per la comprensione a livello molecolare dei geni coinvolti nelle malattie
umane, che per gli studi bioinformatici sull’evoluzione
umana e sulle migrazioni (vedi Capitolo 8). Importanti
sono stati i progressi nella comprensione della genetica
delle malattie umane. In particolare, le persone cercano attivamente opinioni mediche e scientifiche su una
malattia e spesso possono costruire un albero genealogico familiare andando indietro per generazioni, che
può fornire informazioni sulla modalità di trasmissione della malattia. In questo testo vi sono esempi di tutto ciò, come l’emofilia nella famiglia reale (vedi Figura
2.27), l’anemia falciforme (vedi Approfondimento 2.1)
e l’Alzheimer a esordio rapido (vedi Figura 8.11). L’identificazione dei geni coinvolti nelle malattie umane è
un compito difficile ma importante e si sta realizzando
sempre più velocemente. La conoscenza della genetica
coinvolta nella trasmissione di una malattia può aiutare
le coppie a pianificare le loro famiglie e ad affrontare le
possibili malattie che possono essere trasmesse ai figli
o alle figlie. Per i ricercatori, la conoscenza di un gene
responsabile di una malattia può aiutare a sviluppare
un trattamento o una cura.
Un terzo modo con cui studiamo noi stessi è mediante la coltivazione di specifiche cellule umane in
vitro. Le cellule primarie, prese direttamente dal corpo e poi cresciute in coltura, muoiono di norma in 40
(o meno) generazioni. Ma le cellule ottenute dal tessuto tumorale hanno un controllo della crescita alterato e spesso possono essere fatte crescere per un
indefinito numero di generazioni; sono dette, quindi, “immortalizzate”. A volte le cellule possono essere perfino rimosse dal tessuto normale e poi immortalizzate in coltura mediante l’infezione con particolari virus. Con questi e altri mezzi, vengono cresciuti e mantenuti in coltura molti tipi diversi di cellule
di tessuti umani, tra cui gli epatociti (fegato), le cellule renali (rene), i fibroblasti (pelle), le cellule gliali
(tessuto nervoso), i linfociti (sangue) e i miociti (muscoli). Analizzando le cellule cancerose e gli agenti
di trasformazione, abbiamo anche imparato molto
sui geni coinvolti nel cancro (vedi Approfondimento
12.1). Gli studi di colture cellulari di cellule umane
e di altri primati hanno fornito importanti informazioni sui recettori di superficie, sul traffico proteico,
sull’infezione virale e sulla riproduzione cellulare. Le
cellule umane possono anche essere fatte crescere in
quantità idonee agli studi biochimici (vedi Capitolo
7). Gli studi recenti nel campo della ricerca sulle cellule staminali sono promettenti per il trattamento di
molte malattie e per lo sviluppo di tessuti sostitutivi
(vedi Capitolo 22).
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6 APPENDICE Organismi modello
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Batterio, Escherichia coli
Escherichia coli è un batterio
unicellulare, che risiede normalmente nell’intestino animale e in genere non è dannoso, anche se esistono rare varietà tossiche. E coli è piccolo
(microscopico), si riproduce
Janice Haney Carr/CDC
velocemente per scissione, formando colonie di cloni sulle piastre di agar, producendo
decine di milioni di cellule in un giorno e può crescere
anche sui mezzi liquidi, producendo un numero incredibile di cellule figlie, una caratteristica importante per
studi di eventi genetici rari. E. coli ha un solo cromosoma circolare, e studiare i mutanti è molto più facile in un
organismo aploide che diploide, perché non ci sono geni dominanti a mascherare la mutazione. Fenotipi mutanti comuni sono la resistenza ai batteriofagi, la capacità di crescere su alcune fonti di carbonio, la resistenza agli antibiotici e la dimensione e forma della colonia.
E. coli fornisce anche una ricca e uniforme fonte di materiale di partenza per studi biochimici. Quindi, lo studio di E. coli combina la forza della genetica con il potere della biochimica per comprendere i processi vitali a
livello molecolare.
E. coli non è un eucariote e quindi ha poca omologia
con gli uomini. Questo limita la sua utilità nello studio di
tutti i processi tranne di quelli cellulari di base. Per esempio, E. coli è privo di nucleosomi e nella maggior parte le
sue proteine non sono modificate. Le proteine eucariotiche espresse in E. coli trasformato a volte non funzionano,
perché richiedono modificazioni post-traduzionali che il
batterio non riesce a compiere.
 I primi studi con E. coli come organismo
modello
L’unione della biochimica e della genetica rese E. coli
una ricca risorsa per la scoperta di nuove informazioni. Il famoso “test di fluttuazione” di Salvador Luria e
Max Delbruck nel 1943 dimostrò che E. coli muta spontaneamente per diventare resistente al batteriovirus a e
trasmette questa resistenza al fago alla nuova progenie,
rendendo quindi E. coli un sistema modello per comprendere la natura e la funzione dei geni. La scoperta da parte di Joshua Lederberg e Edward Tatum che
E. coli va incontro a una sorta di incrocio e crossing over
(coniugazione del DNA mediata dal plasmide F) rende
possibile lo scambio del DNA e i saggi di complementazione e rende E. coli un valido modello per la genetica. Nel 1952, Alfred Hershey e Martha Chase usarono
E. coli per dimostrare che il DNA è il materiale genetico
del fago T2 (vedi Capitolo 2, Come è stato scoperto). Nel
1958, Matthew Meselson e Frank Stahl selezionarono E.
coli per i loro studi, per dimostrare che la replicazione
del DNA avviene con un meccanismo semiconservativo
(vedi Figura 11.1). Nello stesso anno, Arthur Kornberg e
i suoi collaboratori pubblicarono i risultati sulla purificazione e la caratterizzazione della prima DNA polimerasi scoperta (vedi Capitolo 11, Come è stato scoperto).
Francis Crick e Sydney Brenner usarono la genetica
di E. coli per stabilire la tripla natura del codice genetico
nel 1961. Nel 1966 il codice genetico era stato descritto da
Marshall Nirenberg, Heinrich Matthaei, Gobind Khorana
e i loro collaboratori, usando oligonucleotidi sintetici ed
estratti di E. coli (vedi Capitolo 17). Il lavoro di François
Jacob e Jacques Monod con gli studi dettagliati dell’operone lac aveva aperto un’era completamente nuova della
ricerca sulla regolazione genica (vedi Capitolo 20 e Capitolo 5, Come è stato scoperto). L’identificazione di plasmidi in E. coli e delle tecniche per maneggiarli ci ha portato
nell’era della tecnologia del DNA ricombinante. I plasmidi continuano a essere degli strumenti meravigliosi per le
biotecnologie, dal valore ancora incommensurabile (vedi Capitolo 7).
 Ciclo vitale
Come la maggior parte dei batteri, E. coli si riproduce
per scissione binaria (Figura A.1). Man mano che la cellula cresce, percepisce quando ha raggiunto la dimensione giusta per iniziare la replicazione. I cromosomi
duplicati si distribuiscono ai poli opposti della cellula.
La citochinesi divide la cellula a metà, formando due
cellule figlie, ciascuna delle quali contiene un cromosoma identico. L’intero processo richiede solamente 20
minuti circa a 37 °C, la temperatura corporea media dei
mammiferi. Quindi in appena 24 ore su una piastra Petri contenente un mezzo completo si forma una colonia
grande e visibile, con milioni di batteri identici. Grosse
quantità di E. coli possono essere cresciute anche in una
coltura liquida in un giorno.
 Tecniche genetiche
Per una descrizione completa di molte di queste tecniche
vedi Capitolo 7.
Mutagenesi La frequenza di mutazione in E. coli può es-
sere aumentata con sostanze chimiche o con la luce UV.
Le cellule mutanti possono essere selezionate in base al
fenotipo oppure ricercate mediante piastratura delle repliche su mezzi di coltura diversi.
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APPENDICE Organismi modello 7
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ni positivi (cellule che sopravvivono in condizioni in cui il
mutante non sopravvive) possono poi essere sequenziati
per identificare il gene di complementazione.
E. coli
DNA
Il ciclo
si ripete
Replicazione
del DNA
Espressione di una proteina ricombinante La crescita ve-
loce e non costosa di E. coli fa di questo organismo il veicolo più ampiamente usato per l’espressione e la purificazione di proteine estranee. Queste in genere sono espresse
da geni posti su plasmidi presenti in un elevato numero
di copie. L’espressione è indotta usando elementi di regolazione derivanti da promotori ben noti di E. coli e di fagi.
Formazione
delle cellule
figlie
 E. coli come organismo modello ai nostri giorni
Citochinesi
Separazione
dei filamenti di DNA
FIGURA A.1 Il ciclo vitale di Escherichia coli.
Plasmidi E. coli possiede molti plasmidi naturali che pos-
sono portare del DNA estraneo nella cellula. Questi plasmidi sono utili ai ricercatori per far esprimere delle proteine, come vettori navetta, o per costruire e sequenziare grossi genomi.
Macchine multiproteiche Gli studi biochimici e struttura-
li stanno oggi descrivendo i dettagli atomici di strutture e
processi di trasferimento dell’informazione che un tempo
erano sconosciuti. Tra questi ci sono la struttura e la funzione dell’apparato di replicazione del DNA, delle proteine di riparazione e ricombinazione del DNA, della regolazione dell’RNA polimerasi e della struttura e della chimica del ribosoma. Queste strutture e processi multiproteici si trovano sia nei batteri che negli eucarioti, ma sono
esemplificati nella semplice cellula di E. coli.
Studi citologici I processi possono essere visualizzati nel-
Introduzione di DNA Mediante trasformazione chimica
o con l’elettroporazione, E. coli può essere reso in grado
di accettare del DNA estraneo. Le cellule trasformate con
un plasmide contenente un gene per la resistenza all’antibiotico possono essere selezionate e mantenute aggiungendo l’antibiotico al mezzo di coltura.
le cellule viventi di E. coli grazie all’uso di proteine di fusione fluorescenti. Per esempio, studi recenti di questo tipo hanno permesso di rilevare le proteine coinvolte nella
replicazione del cromosoma e il loro movimento lungo il
cromosoma durante la replicazione.
Tecnologia del DNA ricombinante E. coli detiene una po-
Knockout genico I plasmidi privi di un’origine di replica-
zione ma contenenti un gene che conferisce resistenza a
un antibiotico possono essere selezionati per essere integrati in un cromosoma batterico. L’integrazione di norma
viene ottenuta con la ricombinazione omologa, utile per
la delezione genica, o knockout.
sizione centrale nella tecnologia del DNA ricombinante.
I suoi plasmidi sono ampiamente usati come vettori navetta per amplificare e mantenere le librerie di DNA di altri organismi. E. coli è ancora uno dei veicoli più utilizzati
per l’espressione e la purificazione di proteine estranee.
Biologia dei sistemi Il suo genoma piuttosto piccolo fa
Complementazione Questa tecnica viene spesso utilizza-
ta per dimostrare che una mutazione si trova in un gene
particolare e consiste nell’aggiunta di un gene wild-type
che ristabilisca la funzione. L’analisi di complementazione delle cellule mutanti può essere effettuata con plasmidi che contengono una copia wild-type del gene d’interesse. L’analisi di complementazione di mutazioni sconosciute spesso utilizza una libreria di plasmidi genomici. I clo-
di E. coli un sistema interessante in cui tentare studi di
biologia dei sistemi. Sono stati costruiti chip di DNA per
esaminare la risposta di ogni trascritto in molte condizioni diverse. La funzione di circa il 35% dei geni di E. coli è
ancora sconosciuta e una raccolta genomica di knockout
dei geni di questo batterio sta permettendo di assegnare
una funzione a questi geni e di identificare nuove reti di
interazioni geniche.
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8 APPENDICE Organismi modello
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Lievito gemmante, Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae è un fungo ascomicete microbico, usato
per secoli dagli uomini per fare il
pane, la birra e il vino. Generalmente gli scienziati lo chiamano
lievito gemmante, ma è detto anAlamy
che lievito del pane, lievito di birra o semplicemente lievito. Il lievito ha molte caratteristiche che lo rendono adatto come organismo modello. È un
organismo unicellulare aploide, si riproduce velocemente nei terreni liquidi, forma colonie clonali sulle piastre di
agar e può essere conservato congelato. Come per E. coli,
queste caratteristiche fanno del lievito un eccellente organismo modello per studiare la genetica e la biochimica
di processi vitali fondamentali, come la replicazione, la
trascrizione e la traduzione. Però, a differenza di E. coli, il
lievito è un eucariote dotato di tutti gli organelli intracellulari, come i mitocondri e il nucleo, ha il DNA compattato nella cromatina e una struttura citoscheletrica. Quindi S. cerevisiae è un modello adatto per studiare meccanismi unici degli eucarioti, come il controllo del ciclo cellulare, la regolazione delle proteine mediante fosforilazione, la struttura cromosomica e la funzione mitocondriale.
Il genoma di S. cerevisiae è lungo solamente 12 Mbp
e contiene circa 6000 geni. Contiene anche omologhi di
molti geni umani responsabili di malattie e questo lo rende un modello per la comprensione delle funzioni di base dei prodotti genici coinvolti in alcune malattie; inoltre questi omologhi indicano come alcune malattie umane derivino dalla distruzione di processi vitali piuttosto
semplici e fondamentali. Però, il lievito unicellulare non
serve come modello di sviluppo e le molte malattie umane che derivano da mutazioni che provocano difetti dello
sviluppo non possono essere studiate nel lievito, limitandone l’utilità nella ricerca medica.
La natura aploide del lievito rende possibili alcuni utili
studi di mutazione. Il lievito viene anche facilmente trasformato con il DNA esogeno. Il DNA si integra frequentemente nel cromosoma per ricombinazione omologa, rendendo possibile la costruzione di ceppi knockout per un
gene specifico. La facilità della genetica, unita alla facilità di crescita, fa di S. cerevisiae, come di E. coli, un organismo modello che combina perfettamente gli studi genetici con quelli biochimici.
 I primi studi con il lievito come organismo
modello
zucchero ad alcool e CO2, e stabilì che la fermentazione
è una forza vitale che non può essere separata dagli organismi viventi. Nel 1897, Eduard Buchner notò casualmente che un estratto di cellule di lievito fermentava e
chiamò la sostanza fermentante “zimasi”. Studi successivi dimostrarono che la zimasi era di fatto una miscela di molti enzimi differenti. Il suffisso –asi è usato per
molti nomi di enzimi anche oggi.
 Ciclo vitale
Il lievito gemmante può esistere sia allo stato aploide che
diploide (Figura A.2). Entrambe le cellule aploidi e diploidi si possono riprodurre asessualmente per gemmazione.
Il sesso in S. cerevisiae è determinato dai prodotti del gene del locus del tipo sessuale (MAT), per il quale esistono
due alleli, a e a (vedi Figura 13.22). Aploidi di tipi sessuali diversi possono essere incrociati per formare dei diploidi piastrandoli insieme. Il lievito diploide a/a può essere
convertito allo stato aploide in terreni che lo inducono a
sporulare, andando incontro a meiosi per produrre quattro spore aploidi contenute in un asco. La tetrade di spore
può essere dissezionata con un micromanipolatore e ciascun fenotipo aploide può essere analizzato dopo che le
spore sono cresciute formando delle colonie.
 Tecniche genetiche
Mutagenesi Gli studi mutazionali in S. cerevisiae sono
semplificati dalla sua capacità di crescere come aploide. Il lievito può essere replicato su piastra per studiare
i fenotipi mutanti per la capacità di crescere su fonti di
carbonio differenti e per cercare la presenza di geni letali condizionali (per esempio geni che, se mutati, permettono all’organismo di crescere solamente a particolari temperature).
Complementazione Il lievito aploide può essere incrocia-
to per produrre cellule diploidi per l’analisi di complementazione dei mutanti aploidi. Le mutazioni nei geni essenziali possono essere mantenute portandoli allo stato diploide. Quando un diploide con una mutazione in un gene essenziale va incontro a sporulazione, due delle quattro spore non saranno vitali. L’isolamento di tutti e quattro
i prodotti della meiosi in un asco è utile per l’analisi della
ricombinazione durante la meiosi.
Introduzione del DNA Il DNA può essere introdotto in S.
Il lievito è stato un organismo modello per più di cento anni e, di fatto, ha dato origine alla biochimica moderna. Louis Pasteur dimostrò che il lievito fermenta lo
cerevisiae per abrasione chimica o fisica della spessa parete cellulare. Il DNA lineare, con un marcatore selezionabile ed estremità omologhe al cromosoma, s’integra fa-
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APPENDICE Organismi modello 9
© 978-88-08-19531-9
del genoma (vedi Figura 7.7). Inoltre, S. cerevisiae è dotato di un plasmide naturale di 2 m che può essere usato per
mantenere nella cellula il DNA esogeno.
Tetrade di spore
a
a
a
 Il lievito come organismo modello ai nostri
giorni
Asco di
S. cerevisiae
Sporulazione
(meiosi)
a
a
Gemmazione
aploide
(mitosi)
a
a
Gemmazione
aploide
(mitosi)
Meccanismi fondamentali di trasmissione dell’informazione La struttura semplice e unicellulare, la capacità di
a
crescere in grandi quantità per studi biochimici e la facilità della manipolazione genetica, tutto ciò rende il lievito
ideale per lo studio di meccanismi dettagliati dei processi fondamentali, quali la replicazione, la regolazione genica, la riparazione del DNA, la trascrizione, la traduzione e la ricombinazione.
a/
Il ciclo di divisione cellulare Quando il lievito si divide, la
a/ Gemmazione
a/
diploide
a/
(mitosi)
a/
a
Incrocio
FIGURA A.2 Il ciclo vitale di Saccharomyces cerevisiae.
cilmente nel genoma per ricombinazione omologa. Questa configurazione può portare le estremità a ricombinare
con le sequenze a loro omologhe nel cromosoma di lievito, sostituendo il gene d’interesse con un marcatore selezionabile e distruggendo il gene.
gemma è visibile al microscopio così come i cambiamenti
di forma nelle diverse fasi del ciclo cellulare. L’accumulo di
cellule mutate, bloccate nella fase gemmante, è stato usato
come fenotipo tramite il quale identificare diversi mutanti del ciclo cellulare (cdc), utili per la dissezione genetica
e biochimica del ciclo cellulare. Gli uomini hanno omologhi di molti dei geni del ciclo cellulare scoperti nel lievito.
Le vie di trasduzione del segnale Il lievito è un model-
lo per lo studio delle vie di trasduzione del segnale, come
quelle coinvolte nelle risposte di accoppiamento ai feromoni prodotti da cellule di tipi sessuali opposti.
Ricombinazione meiotica Dato che S. cerevisiae produce
un asco con quattro spore derivanti da una sola cellula, i
ricercatori possono seguire gli eventi che avvengono durante la meiosi. Questo ha portato a modelli molecolari
dettagliati della ricombinazione meiotica.
Marcatori selezionabili La selezione nel lievito è effettua-
ta principalmente con gli auxotrofi, ceppi che sono privi di
un gene che codifica un enzima di una via della biosintesi
degli amminoacidi e quindi richiedono quell’amminoacido per crescere. Le cellule vengono fatte crescere in mezzi definiti privi di quell’amminoacido ora essenziale. Solamente le cellule che hanno acquisito il marcatore e quindi
sono in grado di sintetizzare l’amminoacido a partire da
materiale grezzo sopravviveranno. Per la selezione possono anche essere usati marcatori di resistenza ai farmaci.
Plasmidi Il DNA può anche essere mantenuto nel lievito
come plasmide circolare, usando una fra le tante origini
cromosomiche note come ARS (autonomously replicating
sequence, sequenza di replicazione autonoma). Gli YAC
(yeast artificial chromosome, cromosomi artificiali di lievito) possono mantenere inserti molto grandi (da 300 kbp
a 1 Mbp), e questo è utile nei progetti di sequenziamento
Biologia dei sistemi Uno degli scopi della biologia dei si-
stemi consiste nel comprendere la maggior parte delle interazioni genetiche, fisiche e molecolari dei 6000 geni di
lievito. Allo stesso modo lo studio delle interazioni genetiche tra i knockout di questi geni sta portando alla scoperta
di nuove vie. Gli approcci proteomici sono stati usati per le
prime volte nel lievito. È stato determinato il numero delle copie intracellulari di quasi tutte le proteine di lievito
su tutto il genoma. Sono state determinate anche le interazioni proteina-proteina e proteina-RNA a livello globale, usando le tecniche del doppio ibrido e del triplo ibrido
(vedi Capitolo 7) e la spettrometria di massa dei complessi proteici. Gli studi di biologia cellulare sono facilitati da
una libreria di marcatori proteici fluorescenti posti, nel
genoma di lievito, in ogni cornice di lettura aperta. Inoltre, il lievito è usato come sistema di espressione proteica
per lo studio di geni esogeni.
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10 APPENDICE Organismi modello
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Muffa del pane, Neurospora crassa
La muffa del pane, Neurospora crassa, è un fungo ascomicete filamentoso. È stato uno dei
primi microrganismi eucariotici utilizzato per studi genetici.
All’incirca il 75% di tutti i funWoodfall Wild Images/Photoshot
ghi è ascomiceto; la restante
parte è data dai basidiomiceti (funghi). Circa il 90% degli ascomiceti è filamentoso (ovvero multinucleato, come spiegato meglio di seguito), mentre il resto è costituito da lieviti unicellulari. Il genoma di N. crassa (spesso detto semplicemente Neurospora) è dato da circa 43
Mbp e 11 000 geni, paragonabile al moscerino della frutta per complessità genomica.
La lotta tra funghi filamentosi e batteri ha prodotto
importanti antibiotici, inclusa la penicillina. Queste molecole organiche complesse non si trovano da nessuna altra parte in natura e, in accordo con ciò, più del 40% dei
geni di Neurospora non ha una controparte simile in nessun altro organismo studiato. La nicchia ecologica occupata dai funghi filamentosi comprende molti tipi di materiali biologici in decomposizione. Questo può spiegare
perché Neurospora può crescere su fonti di carbonio e azoto insolite, il che probabilmente si riflette nella presenza
di altri geni insoliti.
Una caratteristica unica di Neurospora è la disposizione delle spore prodotte dalla meiosi di un solo nucleo diploide nell’apposito involucro (asco). Le spore
sono disposte linearmente nell’ordine in cui sono state prodotte con le divisioni meiotiche. Con la possibilità di separare le spore precisamente e di studiarle singolarmente, i ricercatori hanno un modello ideale per
l’analisi della ricombinazione meiotica. Neurospora è interessante anche per lo studio di numerosi meccanismi
di silenziamento genico, alcuni dei quali esistono anche
negli eucarioti pluricellulari.
 I primi studi con Neurospora come organismo
modello
All’inizio Neurospora è stato un modello importante per il
suo stato aploide, la sua crescita veloce, la produzione di
milioni di spore per colonia e la facilità di coltura su terreni semplici e definiti. Negli anni Quaranta, la capacità
di sintetizzare tutte le biomolecole essenziali a partire da
terreni di coltura dalla composizione nota ha velocemente portato Neurospora alla ribalta, come modello ideale in
cui studiare la genetica delle vie metaboliche conservate
in tutte le cellule. Un’importante nota storica è stato l’uso
di Neurospora da parte di George Beadle e Edward Tatum
negli studi che hanno portato all’ipotesi “un gene-un po-
lipeptide”. Questo lavoro ha dato l’avvio a una nuova era
della genetica molecolare e all’uso dei microrganismi in
studi di genetica (vedi Figura 2.23).
 Ciclo vitale
Il ciclo vitale asessuato di Neurospora inizia con le spore
aploidi rilasciate dai microconidi e dai macroconidi (Figura A.3, in alto). Quando la spora aploide germina, dall’estremo in crescita si allunga una proiezione tubolare che
porta alla formazione di un micelio, contenente le ife ramificate. La crescita avviene mediante la replicazione e
divisione dei nuclei aploidi e non è accompagnata dalla
formazione di setti cellulari. La crescita è veloce, fino a 10
cm in un solo giorno. Sulle piastre Petri, la rete compatta
di filamenti produce una colonia. Di fatto questa rete di
ife in una colonia è essenzialmente una sola grande cellula continua, con molti nuclei aploidi. La colonia aploide sporula formando i sacchi dei conidi e una colonia può
produrre milioni di spore.
Due diversi alleli del gene del tipo sessuale, MATA
e MATa, controllano il ciclo sessuale di Neurospora. Le
spore contengono l’allele MATA o MATa e il contatto
tra le colonie dei diversi tipi sessuali porta alla fusione
della parete cellulare seguita dalla fusione dei nuclei
aploidi. I nuclei diploidi ottenuti vanno velocemente
incontro a divisioni meiotiche e ogni nucleo diploide
produce quattro spore aploidi in un asco (Figura A.3,
in basso). Le spore aploidi vanno incontro a un’altra divisione mitotica, producendo otto spore disposte secondo la loro origine cellulare, e s’impilano in fila all’interno di un asco lungo e sottile. Più aschi sono contenuti in
una struttura detta peritecio. Ogni spora nel peritecio
è aploide e può formare un’altra colonia di Neurospora.
Ci vogliono circa 3-4 settimane per passare da spora, a
ifa aploide, a nuclei diploidi, e per tornare indietro alla
produzione di spore.
 Tecniche genetiche
Mutagenesi Neurospora può essere mutagenizzata trat-
tando le spore con radiazioni ionizzanti. Le spore irradiate vengono fatte germinare in un terreno completo e lasciate sporulare, producendo una grande quantità di spore. Le spore possono essere poi analizzate per la presenza di mutazioni.
Introduzione del DNA Neurospora assume facilmente il
DNA del plasmide esogeno grazie al meccanismo di trasformazione. Il DNA deve integrarsi nel genoma per poter
essere ereditato stabilmente. L’antibiotico igromicina può
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APPENDICE Organismi modello 11
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Asessuato (aploide)
Macroconidi (multinucleati)
e microconidi (uninucleati)
Dispersione
tation; mutazione puntiforme indotta dalla ripetizione).
La RIP avviene nei nuclei aploidi delle cellule premitotiche; il DNA ripetuto viene cercato e distrutto mediante
l’introduzione di transizioni da GC a AT, su entrambe le copie del gene duplicato. Questo processo porta di
fatto a un ceppo knockout.
Sporulazione Non appena i cromosomi di Neurospora se-
gregano durante la meiosi, le cellule figlie si dispongono
linearmente su un asse lungo. La frequenza di crossing
over può essere usata per mappare la distanza di un locus
allelico mutante dal centromero.
Micelio
Germinazione
Sessuato (diploide)
Singolo
asco
con 8
spore
aploidi
Il contatto tra colonie MATA
e MATα produce cellule diploidi
2n
Meiosi 1 Meiosi 2
Mitosi
n
a
a
a
a
A
A
A
A
Sviluppo dell’asco
 Neurospora come organismo modello ai nostri
giorni
Ricombinazione meiotica Come abbiamo visto, Neuro-
spora, a partire da un solo evento meiotico, impacchetta
le proprie spore con una disposizione (nell’asco) che rispecchia l’ordine di segregazione cromosomica durante
la meiosi. Questa caratteristica rende Neurospora un sistema interessante per gli studi di ricombinazione da crossing over durante la meiosi.
Ritmi circadiani Neurospora segue un ritmo circadiano
Peritecio con più aschi
FIGURA A.3 Il ciclo vitale di Neurospora crassa. [Fonte:
(Micelio) da Neurospora: Contributions of a Model Organism by
Roland Davis. © 2000 Oxford University Press, Inc. Fotografia
per gentile concessione di Matthew L. Springer, University
of California, San Francisco. (Germinazione) M. G. Roca et
al., Eukaryot. Cell 4: 911-919, 2005. (Asco singolo) Per gentile
concessione di Namboori B. Raju, Stanford University. (Peritecio)
Per gentile concessione di Louise Glass.]
giornaliero nella formazione delle spore dei conidi. Queste sono visibili a occhio nudo e, quindi, il fenotipo di un
comportamento ritmico può essere studiato nelle piastre
Petri o in tubi graduati, lunghe provette in cui si può misurare la crescita rapida delle ife. Perché esista questo ritmo in Neurospora non è chiaro, ma è un modello utile per
la comprensione delle basi molecolari del comportamento ritmico.
Meccanismi di silenziamento Neurospora è dotata di al-
essere usato per selezionare la Neurospora con un transgene. A differenza del lievito, l’inserzione del DNA in Neurospora avviene raramente per ricombinazione omologa;
l’inserzione è più spesso casuale e senza alcun bersaglio.
Knockout genico Il modo per produrre uno specifico
knockout in Neurospora è insolito. Con un processo a
quanto pare specifico di questo organismo, una cellula
con un gene duplicato, quando viene incrociata va incontro a un processo detto RIP (repeat-induced point mu-
meno tre meccanismi di silenziamento diversi, che probabilmente si sono evoluti come difese genomiche contro il DNA invasore, come i trasposoni e i virus. Il silenziamento meiotico è un processo tramite il quale un gene
non appaiato, rilevato durante la meiosi, viene silenziato.
L’inibizione detta “quelling” avviene nelle cellule aploidi
e rivela le sequenze duplicate. La RIP rivela le sequenze
duplicate subito prima della meiosi, mutando da GC ad
AT entrambe le copie della sequenza duplicata. Il silenziamento meiotico e la RIP sembrano essere meccanismi
specifici di Neurospora, mentre il quelling sembra essere
correlato all’interferenza da RNA.
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12 APPENDICE Organismi modello
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Nematode, Caenorhabditis elegans
I piccoli microrganismi unicellulari, come E. coli e il lievito, sono modelli di incredibile successo per lo studio a livello cellulare
Per gentile concessione di Wormatlas
della chimica fondamentale dei
(www.wormatlas.org).
processi vitali, ma per studiare
la complessità dello sviluppo e del sistema nervoso servono modelli pluricellulari. Nel 1960, Sideny Brenner si rese conto che era il momento di porsi delle domande sul
sistema nervoso e su come un organismo pluricellulare si
formi a partire da una sola cellula. Brenner decise di usare come modello per studiare questi argomenti un verme
nematode, un piccolo metazoo traslucido.
Caenhorabditis elegans è un membro della famiglia
Rhabditidae dei nematodi, ma, a differenza di altri membri della famiglia, non è patogeno o parassita di altri animali. C. elegans è una buona scelta come modello di sviluppo animale perché cresce velocemente e, in funzione
della temperatura, si può sviluppare da uovo ad adulto
sessualmente maturo in 21/2-31/2 giorni. I vermi sono facili
da crescere su piastre di agar con E. coli come fonte di nutrimento, e possono perfino essere congelati per una conservazione a lungo termine. Gli ermafroditi di C. elegans si
possono autofecondare, una caratteristica che permette di
ottenere velocemente mutanti omozigoti a partire da una
popolazione di vermi mutagenizzati. I maschi, che si formano in piccola percentuale, possono accoppiarsi con gli
ermafroditi, formando dei ceppi con nuove combinazioni
di mutanti, un aspetto essenziale di qualunque organismo
modello genetico. Inoltre, C. elegans è trasparente, e questo permette di vedere ogni cellula durante lo sviluppo.
Anche se l’ermafrodita contiene solamente 959 cellule somatiche, il nematode è molto complesso ed è dotato di un
sistema nervoso, di muscoli, di sistemi digestivi e riproduttivi e mostra una serie di comportamenti utili per gli studi
di genetica neurologica. Ciascun verme produce centinaia
di discendenti, permettendo la ricerca di mutanti per tutti i tipi di cambiamenti morfologici e comportamentali.
 I primi studi con C. elegans come organismo
modello
Per porre le fondamenta degli studi sullo sviluppo di un
organismo pluricellulare, Brenner e altri hanno mappato la posizione di tutte le 959 cellule presenti nel verme
ermafrodita, ricostruendo immagini tratte da fettine di
tessuto. Durante lo sviluppo, ciascuna cellula migratoria si muove verso una posizione precisa nell’animale.
Ulteriori studi hanno portato i ricercatori a scoprire che
circa il 12% delle cellule muore sempre durante lo sviluppo e che la morte cellulare è programmata genetica-
mente. Oggi sappiamo che la morte cellulare programmata è importante per lo sviluppo di organismi superiori, tra cui l’uomo, e che difetti in questo processo possono portare allo sviluppo del cancro.
Uno dei primi esempi di C. elegans come modello di sviluppo è dato dagli studi sulla vulva. Lo sviluppo di questo
organo di 22 cellule è stato studiato intensamente, perché
le sue singole cellule sono facilmente visibili al microscopio. Le ricerche per identificare i difetti nello sviluppo della vulva sfruttano il fatto che le uova fecondate nell’utero
devono essere deposte nella vulva per poi schiudersi al di
fuori del corpo. Se la vulva ha difetti di sviluppo, le uova
non possono essere depositate e si schiudono all’interno.
Il microscopio evidenzia molti vermi interni alla madre (a
volte si parla di “un sacco di vermi”). Utilizzando questo
evidente fenotipo mutato, i ricercatori hanno identificato molti geni che controllano lo sviluppo della vulva, tra
cui geni appartenenti a una via di fosforilazione conservata che controlla la crescita cellulare. Gli omologhi di alcuni di questi geni nei mammiferi codificano soppressori
tumorali e oncogeni.
La morte cellulare programmata nello sviluppo di
C. elegans porta alla morte di una delle due cellule della
progenie che derivano dalla divisione cellulare durante diversi stadi di sviluppo. Questo meccanismo è essenziale
in diversi stadi dello sviluppo affinché la progenie cellulare sopravvissuta si sviluppi correttamente. In C. elegans
ci sono numerosi esempi di morte cellulare programmata, molti dei quali avvengono durante lo sviluppo del sistema nervoso. La morte cellulare programmata è importante anche nello sviluppo embrionale umano, come, per
esempio, nella rimozione di tessuto tra le dita.
 Ciclo vitale
In C. elegans ci sono due sessi, ermafrodita e maschio.
Gli ermafroditi sono dotati di due copie del cromosoma
X. Una piccola percentuale di cellule germinali dell’ermafrodita (dallo 0,05% all’1,0%) va incontro a una nondisgiunzione dei cromosomi X durante la meiosi, formando dei gameti detti gameti X-nulli, e quindi una progenie
(maschile) X0. Gli ermafroditi sono molti di più dei maschi e quindi la maggior parte della progenie è prodotta per autofecondazione, la quale in genere dà origine a
200-300 uova fecondate che vanno incontro a un ciclo vitale a più stadi (Figura A.4). Dopo l’embriogenesi, che richiede circa 12 ore a 25 °C, le uova si schiudono, producendo delle larve lunghe 80 mm. La larva iniziale contiene
558 cellule. Lo sviluppo procede attraverso quattro stadi
larvali (da L1 a L4) separati da mute. La muta finale porta a vermi adulti sessualmente maturi. L’intero processo
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APPENDICE Organismi modello 13
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Uovo
25˚C
Adulto
L1
(12 h)
di inserimento casuale di un trasposone. L’integrazione del
DNA in un gene d’interesse può essere cercata mediante PCR usando un primer interno al trasposone e un altro
primer che ibrida con il gene in esame.
Interferenza da RNA L’interferenza da RNA, originaria-
mente scoperta nel nematode, può essere usata per silenziare la funzione di un gene introducendo RNA a doppio
filamento omologo al gene in esame (vedi Capitolo 22).
Dauer
L2
(7 h)
L4
(9 h)
 C. elegans come organismo modello ai nostri
giorni
L3 (7 h)
Vie di trasduzione del segnale La morte cellulare pro-
FIGURA A.4 Il ciclo vitale di Caenorhabditis elegans. [Fonte:
(Uovo) Center for Cell Dynamics. (L1-L4 e Dauer) ristampato
per gentile concessione di Wormatlas (www.wormatlas.org).
(Adulto) Per gentile concessione di Ian Chin-Sang, PhD, Queen’s
University, Kingston, Ontario.]
grammata e lo sviluppo della vulva utilizzano vie di trasduzione del segnale che sono utili modelli per le vie di
segnalazione umane. Gli studi eseguiti sullo sviluppo di
C. elegans continuano a rivelare caratteristiche importanti di questi processi.
richiede circa 52 ore a 25 °C. Gli adulti vivono approssimativamente 15 giorni. In condizioni di stress, le larve L2
possono entrare in una fase dormiente, la larva “dauer”
che può sopravvivere per diversi mesi, aspettando che le
condizioni migliorino.
 Tecniche genetiche
Mutagenesi I vermi possono essere mutagenizzati con
trattamenti chimici o irradiazioni. I vermi mutanti possono essere osservati direttamente al microscopio, per cercare la presenza di alterazioni fenotipiche che determinano
un comportamento o uno sviluppo aberrante, l’incapacità
di alcune cellule di andare incontro a morte cellulare programmata, un’aspettativa di vita modificata, l’incapacità
delle larve di entrare nello stadio dauer.
Autofecondazione e fecondazione incrociata L’autofe-
condazione porta da un solo ermafrodita a circa 300 discendenti e permette di ottenere velocemente, a partire
da singoli vermi mutanti, alleli mutanti recessivi. Anche
se i maschi vengono prodotti solo raramente, questi forniscono un’opportunità di produrre nuovi ceppi genetici
incrociandoli con un ermafrodita.
Introduzione di DNA Negli studi di trasformazione, del
DNA ricombinante lineare viene iniettato direttamente nella gonade prima che si formino le uova. Rari eventi d’integrazione portano a ereditare stabilmente più
transgeni. Raramente si ha un’integrazione per ricombinazione omologa.
Knockout genico La distruzione per mezzo di un traspo-
sone sopprime la funzione di un gene. Negli organismi dotati di trasposoni attivi, le mutazioni insorgono per eventi
Malattie umane C. elegans ha molti geni omologhi a geni
umani responsabili di malattie, compresi quelli che appartengono alla via del segnale dell’insulina, così come i geni
coinvolti nelle malattie cardiache, renali e neurologiche.
Lo studio di questi geni dovrebbe portare a comprendere
le basi delle malattie umane.
Invecchiamento Gli studi genetici della larva dauer hanno
portato a identificare una serie di geni che, quando vengono attivati nell’adulto, aumentano significativamente
la durata della vita del verme. La presenza di omologhi di
questi geni in altri animali ha ovvie implicazioni nello studio dell’invecchiamento.
Controllo dell’espressione genica basato sull’RNA Gli
studi sull’interferenza da RNA (scoperti per la prima
volta nel nematode) hanno portato a identificare dei
miRNA coinvolti nell’espressione genica. Infatti, è noto che i
miRNA possono regolare l’espressione genica sia nelle
piante che negli animali.
Neurosviluppo Il sistema nervoso di C. elegans rappre-
senta l’organo più grosso dell’animale e comprende più
di un terzo delle sue cellule (302 neuroni e 56 cellule gliali). A differenza delle connessioni neuronali dei vertebrati, altamente ramificate, la connettività dei neuroni in
C. elegans è piuttosto semplice, con circa 5000 sinapsi e
2000 giunzioni neuromuscolari. Le anomalie comportamentali sono facili da osservare e possono essere mappate
con precisione su specifiche reti neuronali. La conoscenza
della connettività neuronale completa permette ai ricercatori di studiare come viene guidata la crescita dell’assone
e come si formano le sinapsi. Inoltre, C. elegans ha molte
classi di neuroni differenti che permettono studi genetici
sul differenziamento neuronale.
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14 APPENDICE Organismi modello
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Arabetta comune, Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thaliana è un’angiosperma, una dicotiledone della
famiglia della senape (Brassicaceae) che comprende i più familiari broccoli, cavolo e rapanello. Arabidopsis è considerata generalmente un’erbaccia e non
ha importanza economica, ma
le sue caratteristiche la rendoNigel Cattlin/Alamy
no speciale come modello sperimentale. Arabidospis è piuttosto piccola; pertanto possono essere fatte crescere molte piante in uno spazio ristretto. Ha un ciclo vitale breve, circa 5-6 settimane dal seme al fiore e ogni pianta è capace di autoimpollinazione,
producendo migliaia di semi per ampi studi di mappatura
genetica. Inoltre, il genoma di Arabidopsis ha una dimensione di meno del 5% del genoma del mais (2500 Mbp) e
di meno dell’1% di quello del grano (16 000 Mbp). Molti
laboratori nel mondo studiano Arabidospis e molti centri
di stoccaggio pubblici conservano scorte di semi di linee
mutanti e varianti naturali di Arabidopsis dette ecotipi, così come risorse genomiche.
Arabidopsis rappresenta un modello per quel che riguarda fisiologia, sviluppo, genetica e struttura di tutte
le piante. È anche un modello di come le piante interagiscono con l’ambiente e di come percepiscono la lunghezza del giorno, il freddo, l’aridità e la presenza di sale e di
come rispondono ai patogeni. Potremmo aspettarci che ci
siano molte differenze tra le piante e gli animali nella genetica dei programmi di sviluppo. Però gli studi sullo sviluppo della corona (whorl) del fiore mostrano uno stret-
Pistillo
(carpelli)
Stigma
Stilo
Antera
Petali
Sepali
(Whorl 1)
Petali
(Whorl 2)
Stami
(Whorl 3)
Carpelli
(Whorl 4)
FIGURA A.5 Anatomia del perigonio del fiore di Arabidopsis
thaliana. [Fonte: Per gentile concessione del Prof. Dr. Sabine
Zachgo.]
to collegamento con gli animali. La corona del fiore è formata da quattro anelli concentrici (Figura A.5). L’anello
esterno (whorl 1) è costituito da quattro sepali; il whorl
2 da quattro petali, il 3 da sei antere e quello interno da
due carpelli che si fondono, formando il pistillo. Lo studio
delle piante con mutazioni omeotiche ha mostrato un’alterazione nell’identità dei whorl. Per esempio, in un mutante, i carpelli si ritrovano nel whorl 1 al posto dei sepali. Questo comportamento genetico ricorda le mutazioni
nei geni omeotici in Drosophila, in cui gli arti si estendono da segmenti del corpo scorretti. Inoltre, come in Drosophila, i geni omeotici di Arabidopsis codificano fattori
di trascrizione che agiscono tramite la formazione di gradienti di concentrazione nell’embrione in via di sviluppo
(vedi Capitolo 22).
 I primi studi con Arabidopsis come organismo
modello
Arabidopsis è stato aggiunto piuttosto di recente al gruppo di organismi modello, ed è diventato un modello affermato solamente negli anni Ottanta. Nel 1907, Friedrich
Laibach ha identificato il numero di cromosomi di Arabidopsis e nel 1940 ha proposto di usare questa pianta come
organismo modello. Con l’aiuto di Albert Kranz, Laibach
ha raccolto e organizzato molti ecotipi, che hanno contribuito alla collezione attuale di 750 ceppi di Arabidopsis. Il
nascere di una comunità scientifica dedita alla ricerca su
Arabidopsis divenne chiaro con la pubblicazione di un bollettino nei primi anni Sessanta, e con la prima Conferenza Internazionale su Arabidopsis tenutasi nel 1965. Negli
anni Ottanta, Arabidopsis era uno tra i numerosi modelli
vegetali tra i quali era anche compreso il mais, un modello genetico ben consolidato. Con lo sviluppo della trasformazione mediata dal T-DNA (vedi più avanti) nel 1986,
Arabidopsis è diventato velocemente il modello principale per la ricerca vegetale.
 Ciclo vitale
Arabidopsis ha un ciclo vitale comune delle piante (Figura A.6). Come in molte angiosperme, sia le cellule germinali maschili che quelle femminili risiedono nello stesso
fiore e l’autofecondazione (autoimpollinazione) avviene
facilmente. Le piante possono andare incontro anche a
una fecondazione incrociata (impollinazione incrociata).
Ciascuna pianta produce molti fiori che insieme possono
produrre più di 10 000 semi. Il ciclo vitale completo, dalla
germinazione del seme al nuovo raccolto di semi, richiede da 5 a 6 settimane, con lo sviluppo di radici, foglie, fiori, e alla fine i semi.
M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore
APPENDICE Organismi modello 15
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Giorno 0
Seme
Giorno 1
Germinazione
Giorno 45
Sviluppo del seme
e senescenza
Giorno 40
Giorno 2
Comparsa
dell’ipocotile
e dei cotiledoni
Giorno 3
Sviluppo
della radice
Giorno 30
Infiorescenza
Giorno 23
Gemma il primo fiore
Giorno 7
Sviluppo
della foglia
Giorno 11
ne usata negli studi dei vegetali. Però sono disponibili vaste collezioni di mutanti di Arabidopsis sequenziati e nei
centri di stoccaggio è possibile ordinare inserzioni specifiche in singoli geni.
Interferenza da RNA Una funzione genica in Arabidop-
sis può essere eliminata con efficacia utilizzando l’RNAi
(vedi Capitolo 22).
 Arabidopsis come organismo modello ai nostri
giorni
Evoluzione della pianta I quasi 750 differenti ceppi di
Arabidopsis sono molto diversi per sviluppo e forma (per
esempio per la forma della foglia, il tempo di fioritura, la
setosità e la resistenza alle malattie) e sono stati usati per
spiegare l’evoluzione delle caratteristiche e le risposte della pianta all’ambiente.
Sensibilità alla luce Le piante hanno molte risposte diver-
FIGURA A.6 Il ciclo vitale di Arabidopsis thaliana. [Fonte: C.
Douglas et al., Plant Cell 13: 1499-1510, 2001. Copyright © 2001,
American Society of Plant Biologists.]
 Tecniche genetiche
Mutagenesi Le piante possono essere mutagenizzate
trattando i semi con radiazioni ionizzanti o mutageni
chimici. Le piante che sono omozigoti recessivi per i geni mutati possono essere facilmente ottenute con l’autofecondazione.
so alla luce e Arabidopsis è un modello genetico per alcune di queste. Una tipica risposta è quella di passare dalla
produzione di foglie a quella di fiori. Arabidopsis fiorisce
quando la lunghezza del giorno aumenta ed è un modello per la sensibilità alla luce del giorno. Inoltre, una ridotta luce nel periodo di germinazione dei semi porta a una
crescita alterata a causa di una modificazione di sviluppo
programmata che porta a piccole piante con un sistema
radicale ridotto. Arabidopsis è stata usata come modello
per comprendere la genetica che controlla come la luce
influenzi questo sviluppo precoce. Un altro processo sensibile alla luce in Arabidopsis in studio è il modo in cui la
pianta evita l’ombra.
Complementazione Arabidopsis fiorita può essere auto-
fecondata o incrociata con altre piante con tecniche simili a quelle usate da Gregor Mendel, in cui le antere vengono tagliate, permettendo quindi il controllo dell’impollinazione e l’incrocio genetico (vedi Capitolo 2).
Ritmi circadiani Come potremmo aspettarci per organi-
smi con uno stile di vita immobile e dipendenti dalla luce,
le piante mostrano forti ritmi circadiani. Arabidopsis è un
modello eccellente per studiare le basi genetiche dei ritmi
circadiani e la natura del misterioso “oscillatore ritmico”.
Introduzione del DNA La trasformazione con il DNA ri-
combinante è mediata dal T-DNA (DNA di trasferimento) di Agrobacterium tumefaciens, che normalmente s’inserisce nei cromosomi in modo casuale. A. tumefaciens è
un batterio gram-negativo che causa tumori nelle piante. Contiene un plasmide di 200 kbp che induce il tumore (Ti), il quale include geni che facilitano il trasferimento replicativo del DNA in una cellula vegetale. Una volta
introdotto nella cellula vegetale, il plasmide integra un
particolare segmento del suo DNA, il T-DNA, nel genoma della pianta. Quando nel T-DNA si trova del DNA
ricombinante, anche questo viene inserito nel genoma.
Knockout genico La ricombinazione omologa di DNA
transgenico, determinando un knockout genico, avviene solo raramente nelle piante e normalmente non vie-
Resistenza della pianta ai patogeni Le piante sono do-
tate di un’ampia gamma di strategie per sopravvivere alle
condizioni di stress, come l’invasione di patogeni, e Arabidopsis è un modello per lo studio dei patogeni e la difesa contro di essi. Tra queste difese ci sono le molecole antimicrobiche, lo sviluppo di barriere fisiche e l’induzione
della morte cellulare programmata.
Genetica di sviluppo delle piante Come organismo plu-
ricellulare, Arabidopsis ha un’ampia varietà di organi e tipi tissutali, ciascuno dotato di una propria genetica di sviluppo. Le aree di studio dello sviluppo comprendono la
crescita della foglia, la formazione della corona dei fiori,
dei semi e delle radici, lo sviluppo del tessuto vascolare,
l’embriogenesi e il piano di sviluppo del fiore.
M.M. Cox, J.A. Doudna, M. O'Donnell, Biologia molecolare © 2013 Zanichelli editore
16 APPENDICE Organismi modello
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Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster
Siamo tutti abituati a considerare il moscerino della frutta come un fastidio cosmopolita, ma
Drosophila melanogaster ha una
storia lunga 100 anni come imPer gentile concessione di Marcos
Teixeira de Freitas
portante organismo modello per
studi di genetica e dello sviluppo. Il corpo del moscerino
della frutta è diviso in segmenti diversi che formano tre
sezioni principali: la testa, il torace e l’addome. Le sezioni
corporee sono racchiuse in una dura cuticola di chitina,
secreta dalle cellule epidermiche sottostanti, e sono ricche di particolari anatomici (indentazioni, peli) che servono come marcatori fenotipici per gli studi di genetica.
 I primi studi con Drosophila come organismo
modello
Nel 1908 Thomas Hunt Morgan cercava un organismo
idoneo per gli studi di genetica animale. A quel tempo
i finanziamenti per la scienza erano ridotti e quindi alla fine decise di concentrarsi sulla Drosophila, in quanto economica e facile da crescere. Nel 1910, dopo due
anni di studi senza successo, Morgan trovò un maschio
con una mutazione spontanea che causava occhi bianchi (questa mosca normalmente ha gli occhi rossi). Studi
eleganti e dettagliati di quest’unico mutante hanno dimostrato che i geni si trovano sui cromosomi, che ogni
gene ha due alleli, che gli alleli si distribuiscono in maniera indipendente durante la meiosi e che i geni posti su cromosomi diversi si assortiscono in maniera indipendente. Queste e altre scoperte importanti hanno
rafforzato le leggi di Mendel nel contesto fisico dei geni
localizzati sui cromosomi (vedi Capitolo 2).
Il moscerino della frutta è stato anche il primo organismo per il quale si è ottenuta una mappa genetica. Alfred Sturtevant, uno studente del laboratorio di Morgan,
mappò la distanza relativa tra i geni lungo i cromosomi in
funzione delle loro frequenze di ricombinazione per crossing over. Calvin B. Bridges portò ancora più avanti questi studi identificando la posizione esatta dei geni lungo
i cromosomi politenici. Questi cromosomi giganti, posti
nelle ghiandole salivari del moscerino della frutta, sono
costituiti da gruppi di cromosomi impacchettati insieme
e sono caratterizzati da schemi di bandeggio unici quando vengono colorati (Figura A.7). Bridge identificò più di
5000 bande disposte secondo uno schema tipico. Non si sa
perché si formino i cromosomi politenici, ma potrebbero
essere collegati al ruolo della ghiandola salivare di secrezione dell’involucro della pupa durante la metamorfosi.
Molte mutazioni basate sulla ricombinazione sono state
identificate con bande mancanti o con posizioni in cui i
FIGURA A.7 Cromosoma politenico d’insetto. [Fonte: S. F. Werle
et al., Can. J. Zool. 82: 118-129, 2004, Fig. 2. © 2004, NRC, Canada.]
cromosomi si erano invertiti permettendo di mappare i
geni su un cromosoma, così come di stabilire la posizione
dei geni sui cromosomi.
 Ciclo vitale
Le mosche hanno un breve ciclo vitale diploide (12 giorni) (Figura A.8). Il sesso nelle mosche è determinato dal
numero di copie di cromosoma X, non dal cromosoma Y
(XX è femmina e il raro X0 è maschio), anche se il cromosoma Y è necessario alla produzione dello sperma. All’incirca un giorno dopo l’accoppiamento, la femmina inizia
a deporre centinaia di uova. Le divisioni nucleari nell’embrione sono le più rapide di qualunque altro organismo
Femmina
Maschio
Embrione
Pupa
Ciclo vitale di
Drosophila
melanogaster
1° stadio larvale
Prepupa
2° stadio larvale
3° stadio larvale
FIGURA A.8 Ciclo vitale di Drosophila melanogaster. [Fonte:
Prof. Dr. Christian Klambt, Westfalische Wilhelms-Universitat
Munster, Institut fur Neuor- und Verhaltensbilogie.]
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APPENDICE Organismi modello 17
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pluricellulare e le uova si schiudono in un giorno circa.
Il baco passa attraverso tre stadi larvali, separati da mute che richiedono circa 5 giorni. Le larve contengono i dischi imaginali di tessuto destinati a trasformarsi nelle appendici della mosca adulta (come gli occhi, le antenne, le
zampe, le ali, le altere, cioè ali modificate che funzionano come stabilizzatori del volo) e le parti della bocca. Le
ghiandole salivari del terzo stadio larvale secernono l’involucro della pupa, in cui la metamorfosi avviene in 31/241/2 giorni fino alla mosca adulta. Le mosche vivono approssimativamente 30 giorni.
 Tecniche genetiche
Mutagenesi Le mosche possono essere mutagenizzate
esponendole alle radiazioni ionizzanti o nutrendole con
sostanze chimiche mutagene. Le mutazioni che portano
a cambiamenti nel colore dell’occhio, nella forma dell’ala
o di parti del corpo possono essere identificate mediante
l’osservazione visiva.
nell’adulto anche grazie all’uso di una ricombinasi di lievito inducibile dal calore (detta FLP) ingegnerizzata nel
genoma. L’induzione del calore comporta un’elevata frequenza di ricombinazione mitotica nei tessuti riscaldati,
formando dei mosaici genetici. Anche se le alterazioni genetiche possono essere letali per gli embrioni, non necessariamente uccidono l’adulto, dato che la loro espressione è localizzata solamente in alcune cellule.
Knockout genici È difficile ottenere dei knockout genici
in Drosophila perché le tecniche di ricombinazione omologa non sono ancora perfette. Esistono, però, delle procedure in due passaggi in cui un gene è inserito a caso, seguito dall’espressione delle proteine che determinano l’escissione del gene. Una volta escisso, il frammento di DNA
lineare può andare incontro alla ricombinazione omologa
con il gene wild-type.
Interferenza da RNA L’RNAi può essere usata per dimi-
nuire efficacemente il prodotto di uno specifico gene invece che eliminare realmente il gene.
Introduzione di DNA Per inserire il DNA ricombinante
viene usato un processo noto come trasformazione dell’elemento P, di norma usato per studiare gli effetti dell’espressione proteica sugli elementi di controllo della trascrizione. L’elemento P è un trasposone di 3 kbp che può
portare una sezione di DNA ricombinante tra le sue ripetizioni terminali al posto della trasposasi e del repressore
da esso codificati (vedi Capitolo 14). Il DNA dell’elemento
P ricombinante viene iniettato nell’uovo fecondato, insieme a un plasmide che codifica una trasposasi. L’inserimento è casuale e il plasmide che codifica il gene della trasposasi viene perso durante le divisioni cellulari, impedendo
in questo modo la reintroduzione del trasposone in altri
punti nel genoma.
 Drosophila come organismo modello ai nostri
giorni
Malattie umane Il genoma di Drosophila, di circa 170 Mbp,
è all’incirca venti volte più piccolo del genoma di topo e
di quello umano, eppure codifica approssimativamente lo
stesso numero di famiglie geniche. All’incirca il 60% dei
geni noti per essere coinvolti in malattie umane ha degli
omologhi nel moscerino della frutta. Per esempio, gli studi dei geni embrionali letali in Drosophila hanno permesso di spiegare la base genetica di difetti della nascita umana. Altri modelli di malattia sono i difetti immunologici,
il diabete, il cancro, il morbo di Huntington, di Alzheimer
e di Parkinson.
Cromosomi bilanciatori Alleli letali recessivi possono
essere mantenuti stabilmente nei moscerini della frutta
quando sono appaiati a un cromosoma bilanciatore, un
cromosoma che non può ricombinare con il suo omologo
per la presenza di molte inversioni interne che impediscono l’allineamento completo durante la meiosi. I cromosomi bilanciatori sono letali quando sono omozigoti, quindi l’unica progenie che sopravvive è eterozigote per il gene letale recessivo e il bilanciatore.
Piano di sviluppo del corpo La localizzazione dell’mRNA
Mosaici genetici Con l’induzione della ricombinazione
Comportamento Drosophila fornisce un modello per la
mitotica mediante irradiazione con raggi X, nel moscerino della frutta adulto si possono formare dei mosaici
genetici, porzioni di tessuti geneticamente alterati. I mosaici sono particolarmente utili quando si studiano i geni
letali. I mosaici genetici dei geni letali possono formarsi
comprensione della base cellulare e molecolare di alcuni tipi di comportamento. Le anomalie di comportamento del moscerino della frutta comprendono cambiamenti
nell’apprendimento e nella memoria, nella ricerca del cibo, del riposo, e in altri comportamenti, e nell’alcoolismo.
materno nelle uova porta a un’espressione genica localizzata che stabilisce gli assi antero-posteriore e dorso-ventrale in Drosophila. Questi geni controllano il piano di sviluppo corporeo e hanno i loro corrispondenti negli animali più complessi. Quindi il moscerino serve come sistema piuttosto semplice per comprendere la formazione
del piano corporeo (vedi Figura 16.24 e Capitoli 21 e 22).
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Topo domestico, Mus musculus
Il topo domestico, Mus musculus, è stato collezionato e allevato dagli “amanti” dei topi per
centinaia di anni, e alcuni dei
ceppi puri, sviluppati da questi,
sono usati oggi come standard
per gli studi scientifici. Il topo
iStockphoto
domestico è il modello di mammifero principale ed è più simile agli uomini di quanto ci
piaccia ammettere (vedi Figura 1.12). Il genoma del topo
ha quasi la dimensione di quello umano e codifica essenzialmente lo stesso numero di geni; il 99% di questi ha un
omologo nell’uomo. Infatti, una gran parte del genoma
murino è sintenico con il nostro, ovvero interi blocchi di
geni si ritrovano nello stesso ordine in entrambe le specie
(vedi Figura 8.4).
Rispetto ad altri organismi modello, lavorare con i topi è più complicato sotto ogni aspetto. Sono più grandi,
ovviamente, ma hanno anche un tempo di generazione
di circa 8-10 settimane e producono, in media, solamente da 6 a 8 piccoli per nidiata. Questi numeri sono molto
interessanti se confrontati con altri mammiferi, ma poco se confrontati con altri organismi modello. Le colonie
di topo sono anche costose da mantenere e non possono essere trattati i numeri necessari per attuare grandi
screening genetici, come avviene con altri organismi modello. Però, a differenza del nematode e del moscerino della frutta, i topi hanno sistemi biologici senza paralleli in
modelli animali inferiori, come il sistema immunitario e
l’apparato scheletrico, o sono semplicemente modelli migliori per studi di sistemi complessi come l’apparato cardiovascolare, il sistema endocrino e molti altri. Il topo è
un modello per le malattie umane, come il cancro, praticamente in tutti questi sistemi.
 I primi studi sul topo come organismo modello
Gli studi genetici sui topi iniziarono nei primi anni del
Novecento, quando la selezione e l’incrocio erano i principali metodi per ottenere una progenie con i caratteri desiderati. Questi primi studi portarono a un modello generale che spiegava il colore della pelliccia in tutti
gli altri mammiferi con pelo. I topi e i ratti hanno anche
una lunga storia negli studi nutrizionali, specialmente
per l’identificazione di vitamine e sintomi causati dalla mancanza di vitamine nella dieta. L’utilizzo dei topi
in un modello di malattia umana è stato avviato da Clarence Cook Little. Negli anni Venti, mediante incroci
tra consanguinei, questi sviluppò un ceppo di topo, il
C57BL/6 (comunemente detto Black6), che alla fine divenne il ceppo di topo usato per determinare la sequen-
za del genoma. Little fondò anche il Jackson Laboratory
in Bar Harbor, Maine, un centro di genetica del topo che
serve anche come deposito pubblico di modelli murini
per la ricerca scientifica.
 Ciclo vitale
I cromosomi X e Y determinano il sesso nei topi, come negli uomini. La fecondazione dà origine a una blastocisti
contenente alcune cellule non differenziate unite assieme
nella massa cellulare interna, la fonte di cellule staminali
embrionali. La gestazione dura 19-21 giorni e porta a una
nidiata di 3-14 piccoli. La maturità sessuale richiede circa 6 settimane per le femmine e 8 settimane per i maschi,
ma l’accoppiamento può avvenire in soli 35 giorni. I topi
vivono 1-2 anni e le femmine possono dare 5-10 nidiate,
sostanzialmente nel primo anno di vita.
 Tecniche genetiche
Mutagenesi Gli incroci tra consanguinei per molte gene-
razioni hanno portato a molti ceppi utili di topi mutati.
L’aggiunta di sostanze chimiche mutagene al nutrimento
facilita lo sviluppo di ceppi mutati.
Introduzione di DNA Il DNA estraneo può essere inietta-
to direttamente nel nucleo delle uova fecondate, seguito
dall’impianto delle uova nell’ovidotto della femmina ricevente. L’integrazione casuale avviene con elevata frequenza. Il DNA ricombinante usato di norma ha un promotore
di topo che dirige l’espressione di un gene reporter, come
lacZ o GFP (proteina fluorescente verde), in modo che l’espressione del transgene possa essere seguita durante lo
sviluppo. Circa metà dei topi transgenici contiene DNA
ricombinante nella linea germinale e quindi passa il gene
ricombinante alle generazioni future.
Knockout genico Il knockout mirato come modello di una
malattia murina viene ottenuto a partire dalle cellule staminali embrionali (Figura A.9). Le cellule staminali sono
estratte dalla massa cellulare interna della blastocisti e
fatte crescere in coltura. Le cellule staminali coltivate sono poi trasformate con del DNA lineare contenente una
copia mutata del gene in esame, insieme ai geni per la resistenza alla neomicina (neor) e la timidina chinasi (tk).
DNA omologo fiancheggia il gene mutato (genemut nella
Figura A.9) e il gene neor, in maniera tale che l’integrazione omologa sostituisca il gene wild-type con il gene mutato insieme a quello per la neor. Al contrario, il DNA che
si inserisce casualmente porta all’integrazione dell’intero
frammento di DNA, compresa la tk.
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APPENDICE Organismi modello 19
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Blastocisti
Cellule
della massa
interna
(cellule staminali)
Estratto
di cellule staminali
genemut neor
tk
Trasformazione
genemut neor
Nessuna
integrazione
Integrazione
omologa
genemut neor
tk
Integrazione
non omologa
 Il topo come organismo modello ai nostri
giorni
Uso della neomicina
per selezionare la neor
genemut neor
Nessuna
integrazione
Integrazione
omologa
genemut neor
tk
Integrazione
non omologa
Uso del ganglocivir
per selezionare contro la tk
genemut neor
Integrazione
omologa
omologa, perché queste cellule contengono la tk, e la timidina chinasi trasforma il ganciclovir in una tossina che
uccide queste cellule. Solamente le cellule che contengono i knockout genici prodotti dalla ricombinazione omologa sopravvivono a entrambe le selezioni. Le cellule staminali ingegnerizzate vengono iniettate in un embrione
ospite wild-type allo stadio di blastocisti. Questo porta alla formazione di un embrione che è una chimera dell’ospite wild-type e delle cellule ingegnerizzate donatrici. Le
chimere risultanti vengono incrociate per trasmettere la
modificazione genetica attraverso la linea germinale. I topi eterozigoti della F1 (prima generazione) vengono poi incrociati per ottenere una progenie F2 wild-type, eterozigote e omozigote, nell’atteso rapporto mendeliano 1:2:1.
Accoppiamenti selezionati portano a topi knockout omozigoti. Sono state sviluppate tecniche per conservare, tramite crioconservazione di sperma e di cellule uovo, ceppi
di topo preziosi e difficili da ottenere.
genemut neor
tk
Integrazione
non omologa
Malattie umane Il topo è un modello importante per lo
studio delle malattie umane. I modelli delle malattie possono essere ottenuti tramite accoppiamento tra consanguinei o producendo knockout di noti geni responsabili
di malattie. I modelli murini di malattie umane comprendono il cancro, l’arteriosclerosi, l’invecchiamento, l’ipertensione, le malattie metaboliche, le malattie del sistema
immunitario, il diabete di tipo 1 e tipo 2, la sindrome di
Down, il morbo di Alzheimer, il glaucoma, l’osteoporosi,
l’obesità, l’epilessia, la malattia Lou Gehrig (la sclerosi laterale amiotrofica), il morbo di Huntington, le malattie
del sangue e molte altre.
Iniezione nell’embrione
Mappatura dei geni mutati I geni mutati possono essere
Eterozigote knockout
Incrocio della progenie
per ottenere un topo
omozigote recessivo
FIGURA A.9 Costruzione di un topo knockout.
identificati più velocemente nel topo rispetto ai geni mutanti negli uomini. Ceppi di topo molto simili (come Mus
musculus e Mus spretus) possono essere incrociati per produrre ibridi che generalmente presentano sequenze diverse in posizioni polimorfiche, permettendo ai ricercatori di usare l’analisi di associazione per sviluppare mappe genetiche dettagliate e localizzare un gene responsabile di una malattia.
Comportamento Esistono modelli murini per certi tipi di
comportamento, come l’alcoolismo, la dipendenza da droghe, disturbi ansiosi e comportamento aggressivo.
Per selezionare le cellule con il gene knockout opportuno,
sono necessari due passaggi. La selezione per la neor, grazie all’uso della neomicina, uccide tutte le cellule che non
hanno integrato il DNA trasformante. La selezione contro
la tk, con l’uso dell’antivirale ganciclovir, uccide le cellule che hanno integrato del DNA per ricombinazione non
Sviluppo del mammifero I topi transgenici sono usati per
studiare la posizione e la modalità di espressione di particolari geni in vari momenti dello sviluppo. Inoltre, esistono modelli per studiare alcune malattie dello sviluppo
umano, come il labbro leporino e la palatoschisi.
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