WWW.QIAGEN.COM Manuale per il kit QIAamp® DSP 96 Virus MDx
annuncio pubblicitario
Ottobre 2004 Manuale per il kit QIAamp® DSP 96 Virus MDx 1152 Il sistema BioRobot® MDx DSP è un sistema generico che si avvale della tecnologia QIAamp per l’isolamento e la purificazione in automatico degli acidi nucleici virali da campioni umani di plasma o siero per analisi diagnostiche in vitro. Per uso diagnostico in vitro 61762 1027740IT 10/2004 QIAGEN GmbH, D-40724 Hilden Tel: +49-2103-29-0 WWW.QIAGEN.COM Marchi: QIAGEN®, QIAamp®, BioRobot® (QIAGEN Group); AMPLICOR®, COBAS® (Roche Molecular Systems, Inc., concesso in licenza a Roche Diagnostic Systems, Inc.); BD Falcon™, BD PPT™, BD Vacutainer®, (Becton, Dickinson and Company); CryoTube® (Nalge Nunc International); LCx® (Abbott Laboratories); MONITOR®, TaqMan® (Roche Group); Monovette® (Sarstedt AG & Co.); Nalgene® (Nalge Corp.); Vacuette® (C.A. Greiner & Söhne GmbH). Il processo PCR è protetto dai brevetti USA 4,683,195 e 4,683,202 e dai rispettivi equivalenti degli altri Paesi, di proprietà di Hoffmann-La Roche AG. © 2004 QIAGEN, tutti i diritti riservati. Sommario Contenuto del kit 4 Simboli 5 Conservazione 6 Controllo di qualità 6 Uso previsto 6 Limiti all’utilizzo del prodotto 7 Informazioni di sicurezza 7 Introduzione 9 Principio e procedura 10 Caratteristiche di prestazione del sistema BioRobot MDx DSP 14 Strumenti e reagenti forniti dall’operatore 24 Note importanti 25 Punti generali importanti 25 Preparazione dell’RNA 26 Conservazione dei campioni 26 Preparazione di reagenti e tamponi 26 Preparazione degli oggetti in plastica 30 Preparazione dei contenitori grandi di liquido 31 Eluizione di acidi nucleici virali 31 Resa e qualità degli acidi nucleici virali 32 Impostazione della stazione di lavoro BioRobot MDx 32 Pulizia della stazione di lavoro BioRobot MDx 32 Protocollo Isolamento e purificazione in automatico degli acidi nucleici virali da plasma e siero 36 Appendice A: messaggi visualizzati 41 Appendice B: file dei risultati 61 Appendice C: calcolo della quantità di controllo interno 63 Distributori QIAGEN 66 Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 3 Contenuto del kit Kit QIAamp DSP 96 Virus MDx Numero di catalogo 61762 Numero preparazioni 1152 Kit principale QIAamp DSP 96 Virus MDx 1 scatola QIAamp 96 Piastra QIAamp 96 12 CARRIER RNA carrier (tappo rosso) 12 x 1350 μg QP Proteasi QIAGEN® * 12 fiale PS Solvente della proteasi 12 x 6 ml AL Tampone di lisi† 12 x 33 ml AW1 Tampone di lavaggio 1† (concentrato) 4 x 151 ml AW2 Tampone di lavaggio 2‡ (concentrato) 4 x 127 ml AVE Tampone di eluizione‡ (tappo viola) 108 x 2 ml TOPE Fluido di eluizione (tappo arancione) 48 x 1,4 ml Q-Card§ 1 Manuale 1 Materiali in plastica QIAamp DSP 96 Virus MDx 1 scatola SB S-Block 12 CAP Tappi per strisce 3 x 55 EMT Microprovette di eluizione CL 12 DT Recipiente monouso 3 x 10 BOT Flacone di etanolo 1 * Volume di risospensione: 6 ml. † Contiene idrocloruro di guanidina. Vedere pagina 7 per le informazioni di sicurezza. ‡ Contiene sodio azide come conservante. § Non smaltire la Q-Card. Le informazioni contenute nel codice a barre sulla Q-Card sono necessarie per avviare il sistema BioRobot MDx DSP. 4 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Simboli Il contenuto è sufficiente per <N> test <N> Fare riferimento alle informazioni riportate nel manuale Da utilizzarsi entro Dispositivo medico per diagnostica in vitro Numero di catalogo Numero di lotto Numero di materiale Componenti Numero Volume Limiti di temperatura Produttore autorizzato Nota importante ______ Trascrivere la data corrente dopo aver aggiunto etanolo al flacone Aggiunta Contiene Etanolo puro Idrocloruro di guanidina Liofilizzato Ricostituire in Subtilisina Da utilizzarsi esclusivamente con ¨ Porta a Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 5 Conservazione Il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx deve essere conservato alla temperatura indicata sull’etichetta del kit stesso. La data di scadenza del kit è stampata sulla Q-Card e sull’etichetta del kit ed è valida solo se il kit è conservato alla temperatura indicata sull’etichetta. L’RNA carrier può essere disciolto soltanto nel tampone di eluizione (AVE); l’RNA carrier disciolto deve essere aggiunto immediatamente al tampone di lisi (AL), come descritto a pagina 27. Questa soluzione deve essere preparata al momento e rimane stabile per diverse ore se conservata a 2–8 °C. La QIAGEN proteasi (QP) ricostituita è stabile fino a un anno se conservata a 2–8 °C, ma comunque non oltre la data di scadenza del kit. Il tampone di lavaggio 1 (AW1) e il tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituiti sono stabili per un anno se conservati a temperatura ambiente (15–25 °C), ma comunque non oltre la data di scadenza del kit. Controllo di qualità In conformità al sistema certificato di QIAGEN per la gestione della qualità totale, ogni lotto del kit QIAamp DSP 96 Virus MDx viene testato in rapporto a specifiche prestabilite, per garantire la costante qualità del prodotto. Uso previsto Il sistema BioRobot MDx DSP è un sistema generico che si avvale della tecnologia QIAamp per l’isolamento e la purificazione in automatico degli acidi nucleici virali da campioni umani di plasma o siero per analisi diagnostiche in vitro. Il sistema BioRobot MDx DSP è progettato per essere usato esclusivamente come un sistema chiuso. Il sistema è composto dalla stazione di lavoro BioRobot MDx, dagli armadietti del laboratorio e degli accessori, da un computer con il software QIAsoft MDx DSP e il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx e dal kit QIAamp DSP 96 Virus MDx. Il sistema BioRobot MDx DSP è concepito per l’uso da parte di personale professionista, come tecnici e medici esperti nelle tecniche di biologia molecolare. Qualsiasi risultato diagnostico in vitro generato tramite la procedura di preparazione del campione, in combinazione con un qualunque test diagnostico in vitro di analisi degli acidi nucleici (NAT) downstream, deve essere interpretato in un quadro più ampio che tenga conto di eventuali altri riscontri clinici o di laboratorio. 6 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Per ridurre al minimo il rischio di un impatto negativo sui risultati diagnostici in vitro, all’utente sono fornite informazioni per l’utilizzo di un controllo interno durante i processi di preparazione, amplificazione e rilevamento del campione, conformemente al test downstream in uso, al fine di controllare eventuali irregolarità. Limiti all’utilizzo del prodotto Il sistema BioRobot MDx DSP non deve essere utilizzato per l’isolamento e la purificazione dell’RNA e del DNA da campioni di sangue intero, tessuto, midollo spinale e cellule in coltura umani. Inoltre, non deve essere impiegato per isolare e purificare acidi nucleici di origine batterica, di funghi o parassiti. Non sono state determinate le prestazioni del prodotto per campioni di liquido cerebrospinale, urina e sospensioni fecali. Informazioni di sicurezza Quando si utilizzano sostanze chimiche, indossare sempre un adeguato camice da laboratorio, guanti monouso e occhiali di protezione. Per ulteriori informazioni, consultare le appropriate schede di sicurezza (MSDS). Le schede MSDS, nel pratico e compatto formato PDF, sono disponibili online all’indirizzo www.qiagen.com/ts/msds.asp. Qui è possibile trovare, visualizzare e stampare la scheda MSDS per ciascun kit QIAGEN e i relativi componenti. ATTENZIONE: NON aggiungere candeggina o soluzioni acide direttamente alle preparazioni di campione da eliminare. Il tampone di lisi (AL) e il tampone di lavaggio 1 (AW1) contengono idrocloruro di guanidina, che può formare composti altamente reattivi in combinazione con la candeggina. Nel caso in cui si rovesciassero dei liquidi contenenti questi tamponi, pulire con acqua e detergente idoneo per l’uso in laboratorio. Se il liquido rovesciato contiene agenti potenzialmente infetti, pulire l’area interessata con acqua e detergente da laboratorio, quindi con una soluzione di ipoclorito di sodio all’1% (v/v). Se i flaconi di tampone sono danneggiati o si riscontrano perdite, indossare guanti e occhiali di protezione per l’operazione di smaltimento, onde evitare lesioni personali a sé o ad altri. QIAGEN non ha testato i liquidi di scarico generati dalla procedura QIAamp DSP 96 Virus MDx per la presenza di materiali infetti residui. La contaminazione dei liquidi di scarico da parte di materiali infetti residui è altamente improbabile, ma non può essere esclusa completamente. Pertanto i liquidi di scarico devono essere considerati infetti e vanno smaltiti in conformità alle normative di sicurezza locali vigenti in materia. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 7 Ai componenti del kit QIAamp DSP 96 Virus MDx sono associate le seguenti frasi di rischio e consigli di prudenza. Tampone di lisi (AL) e tampone di lavaggio 1 (AW1) Xn Contengono idrocloruro di guanidina: pericoloso, irritante. Frasi di rischio e consigli di prudenza:* R22-36/38, S13-26-36-46 Proteasi QIAGEN (QP) Xn Contiene subtilisina (proveniente da Bacillus subtilis): sensibilizzante, irritante. Frasi di rischio e consigli di prudenza:* R37/38-41-42, S22-24-26-36/37/39-46 Informazioni di emergenza 24 ore su 24 È possibile ottenere informazioni mediche di emergenza in inglese, francese e tedesco, 24 ore su 24, presso: Centro di informazioni antiveleni, Mainz, Germania. Tel: +49-6131-19240 * R22: nocivo per ingestione; R36/38: irritante per gli occhi e la pelle; R37/38: irritante per le vie respiratorie e la pelle; R41: rischio di gravi lesioni oculari; R42: può provocare sensibilizzazione per inalazione; S13: conservare lontano da cibi, bevande e alimenti per animali; S22: non respirare le polveri; S24: evitare il contatto con la pelle; S26: in caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico; S36: usare indumenti protettivi adeguati; S36/37/39: usare indumenti protettivi, guanti e dispositivi di protezione per gli occhi e il viso adeguati; S46: in caso di ingestione consultare immediatamente un medico e mostrargli il contenitore o l’etichetta. 8 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Introduzione Il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx si avvale di una tecnologia consolidata per isolare e purificare simultaneamente il DNA e l’RNA virale da un’ampia gamma di virus. Il kit combina le proprietà di legame selettivo di una membrana alla silice con un formato a 96 pozzetti ad alta velocità di elaborazione ed è progettato per l’elaborazione simultanea e completamente computerizzata di 96 campioni sul sistema BioRobot MDx DSP. Il processo completamente computerizzato, che comprende la lettura del codice a barre, il controllo del caricamento, il monitoraggio dei campioni e la documentazione completa del processo, richiede un massimo di 2,5 ore per elaborare 96 campioni, senza alcun intervento da parte dell’utente. La manipolazione manuale di campioni potenzialmente infetti è ridotta, assicurando la sicurezza per l’utente nonché un’elaborazione affidabile dei campioni. Il tempo di elaborazione tra analisi consecutive è di circa 25 minuti per la preparazione dei reagenti e per l’avvio della stazione di lavoro BioRobot MDx DSP, più 15 minuti per la pulizia degli strumenti. La procedura è idonea per campioni di plasma e siero, contenenti citrato o EDTA. I campioni di plasma che contengono eparina non devono essere utilizzati, poiché questo anticoagulante può interferire con i test diagnostici downstream eseguiti in un secondo tempo, come la reazione di polimerizzazione a catena. I campioni possono essere prelevati di recente, liofilizzati o congelati, purché non siano stati congelati e scongelati più volte. Gli acidi nucleici virali vengono eluiti nel tampone di eluizione (AVE) e sono pronti per essere utilizzati in reazioni di amplificazione. Il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx consente di scegliere tra due procedure di lavaggio diverse. Il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx standard utilizza procedure di lavaggio con tampone di lavaggio 2 (AW2) ed etanolo (EtOH). Il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) fornisce una procedura di lavaggio più rigida, eseguita con entrambi i tamponi di lavaggio (AW1 e AW2) ed etanolo (EtOH). In questo modo, si gode della flessibilità di scegliere la purezza desiderata per le analisi downstream da eseguire in un secondo tempo. L’utente deve convalidare il protocollo che meglio si adatta a un test specifico, seguendo le linee guida della International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) in ICH Q2A: Validation of analytical methods: Definitions and terminology e ICH Q2B: Validation of analytical methods: Methodology. Entrambi i protocolli possono essere eseguiti sullo stesso sistema BioRobot MDx DSP, secondo le necessità. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 9 Principio e procedura La procedura QIAamp DSP 96 Virus MDx prevede 6 fasi: installazione guidata da un software del sistema BioRobot MDx, compresa la lettura dei codici a barre dei campioni; la lisi delle particelle del virus nel campione; il legame degli acidi nucleici virali presenti nei lisati alle membrane di una piastra QIAamp 96; il lavaggio degli acidi nucleici virali legati alle membrane; l’eluizione degli acidi nucleici virali dalle membrane; la creazione di un file di risultati. Volume del campione Il sistema BioRobot MDx DSP è in grado di rimuovere un volume di campione di 265 μl da provette primarie e secondarie di diverse grandezze, come le provette CryoTube® o BD Vacutainer®, che contengono un volume di campione minimo di 500 μl. Le tabelle 1–3 (pagine 10–11) elencano le provette compatibili con i diversi portaprovette del BioRobot MDx DSP. L’uso del BioRobot MDx DSP non è limitato a queste provette. Se l’utente preferisce utilizzare altre provette, il tecnico specializzato per lo strumento QIAGEN le testerà durante l’installazione del BioRobot MDx DSP. Nota: le provette con dimensioni identiche possono essere disponibili con diversi numeri di catalogo, ma con anticoagulanti diversi. Tabella 1. Provette compatibili per portaprovette, STS MDx, 15 mm (contiene provette con diametro interno di 14–16 mm) Produttore/ marchio Altezza Forma provetta Volume Distributore N. cat.* BD Falcon™ 14 ml 96 mm Rotonda BD 352051 BD Vacutainer 10 ml 100 mm Rotonda BD 368430/ 366457 VENOJECT II 10 ml 100 mm Rotonda Terumo VP-100 SHL * I numeri di catalogo sono soggetti a modifica; verificare con il produttore o con il fornitore. 10 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Tabella 2. Provette compatibili per portaprovette, STS MDx, 12 mm (contiene provette con diametro interno di 11–13 mm) Produttore/ marchio † Volume Altezza Forma provetta Sarstedt 7 ml 81 mm Rotonda Sarstedt 60550109 VENOJECT II 5 ml 78 mm Rotonda Terumo VP-050 SDK Distributore N. cat.† I numeri di catalogo sono soggetti a cambiamento; verificare con il produttore o con il fornitore. Tabella 3. Provette compatibili per portaprovette, STS MDx, 9 mm (contiene provette con diametro interno di 8–10 mm) Produttore/ marchio Volume Altezza Forma provetta BD Falcon 5 ml 75 mm Rotonda BD 352063 KABE EDTA 5 ml 75 mm Rotonda KABE 53101 NALGENE® 2 ml 45 mm Fiala criogenica Nalge 5000-0120 NUNC 1,8 ml 40 mm Rotonda Nunc 363401 NUNC 3,6 ml 60 mm Rotonda Nunc 366524 NUNC 4,5 ml 80 mm Rotonda Nunc 363452 Sarstedt 2 ml 45 mm Conica Sarstedt 72693005 Sarstedt 5 ml 75 mm Rotonda Sarstedt 62526028 BD Vacutainer 6 ml 75 mm Rotonda BD 367815 Distributore N. cat.* * I numeri di catalogo sono soggetti a modifica; verificare con il produttore o con il fornitore. Lisi delle particelle virali I campioni vengono lisati in condizioni denaturanti a temperature elevate. La lisi viene eseguita in presenza di proteasi QIAGEN (QP) e di tampone di lisi (AL), che insieme assicurano l’inattivazione delle RNasi. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 11 Legame degli acidi nucleici alle membrane della piastra QIAamp 96 Per ottimizzare il legame di DNA e RNA virale con le membrane della piastra QIAamp 96, si aggiunge etanolo ai lisati. Successivamente si applica il lisato a un pozzetto della piastra QIAamp 96 e gli acidi nucleici virali, al passaggio dei lisati, vengono assorbiti sulla membrana in gel di silice per effetto della pressione indotta dal vuoto. Rimozione dei residui contaminanti Mentre gli acidi nucleici virali rimangono legati alle membrane della piastra QIAamp 96, nel protocollo standard QIAamp DSP 96 Virus MDx i contaminanti vengono rimossi efficacemente dal lavaggio eseguito mediante tampone di lavaggio 2 (AW2) e infine etanolo (EtOH). In alternativa, il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) fornisce una procedura di lavaggio più rigida. Questo protocollo differisce dal protocollo standard per l’aggiunta di un passaggio di lavaggio con il tampone di lavaggio 1 (AW1) prima del lavaggio con il tampone di lavaggio 2 (AW2) e infine con etanolo (EtOH). Eluizione di acidi nucleici puri Gli acidi nucleici virali vengono eluiti dalle membrane della piastra QIAamp 96 aggiungendo il tampone di eluizione (AVE). L’eluato dell’acido nucleico può corrispondere anche al 50% del volume di reazione, a seconda del test downstream da eseguire successivamente, senza causare alcun effetto inibitore. 12 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx QIAsoft MDx DSP Protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) Setup guidato del tavolo di lavoro QIAsoft MDx DSP Setup guidato del tavolo di lavoro Controllo caricamento Esegui scansione codici a barre dei campioni Controllo caricamento Esegui scansione codici a barre dei campioni Aliquotare i campioni di trasferimento QP e aggiungere RNA carrier contenente AL e controllo interno Aliquotare i campioni di trasferimento QP e aggiungere RNA carrier contenente AL e controllo interno Lisi del campione Lisi del campione Aggiungere etanolo Aggiungere etanolo Trasferire lisati Trasferire lisati Legare acidi nucleici Vuoto Vuoto Legare acidi nucleici Lavare con AW1 Vuoto Lavare con AW2 Lavare con AW2 Vuoto Vuoto Lavare con etanolo Lavare con etanolo Vuoto Vuoto Piastra QIAamp 96 asciutta Vuoto Piastra QIAamp 96 asciutta Vuoto Riscaldamento Aggiungere AVE e TOPE Vuoto Aggiungere AVE e TOPE Vuoto Eluire acidi nucleici Acidi nucleici virali purificati in EMT Riscaldamento Eluire acidi nucleici Acidi nucleici virali purificati in EMT Creare file di risultati Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 Creare file di risultati 13 Caratteristiche di prestazione del sistema BioRobot MDx DSP Range lineare Il range lineare di entrambi i protocolli QIAamp DSP 96 Virus è stato valutato per i virus HIV, HCV RNA e HBV DNA. I test stati eseguiti con diluizioni di pannelli di virus calibrati realizzati in plasma umano negativo a HIV, HBV e HCV. La quantificazione dei pannelli dei virus HIV e HBV è stata eseguita utilizzando gli standard internazionali dell’Organizzazione Mondiale della Sanità 97/656 e 97/746, rispettivamente, come materiale di riferimento. Un pannello di virus calibrato disponibile in commercio di AcroMetrix è stato utilizzato per la serie di diluizione dell’HCV. Le serie di diluizione con 7 titoli di virus diversi sono state testate con 24 replicati per ogni serie. Il range lineare della procedura QIAamp DSP 96 Virus MDx è stato determinato per i virus HIV, HCV RNA e HBV DNA in diversi test diagnostici successivi (Tabella 4, Figure 1–3). Il calcolo dei titoli (conversione da cp a valori in UI) è stato eseguito seguendo le specifiche del produttore corrispondente del test downstream corrispondente (Tabella 4). Tabella 4. Test diagnostici downstream utilizzati per la determinazione del range lineare delle rese con i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx Manuale test utilizzato Fattore di conversione Virus Test downstream HIV Analisi quantitativa LCx® HIV RNA (ABBOTT Laboratories) 12/2003 1 UI = 0,1412 cp HBV Test COBAS AMPLICOR® HBV MONITOR® (Roche Diagnostics GmbH) 7/2003, Revisione 1.0 1 UI = 5,26 cp HCV Test COBAS TaqMan HCV 9/2003 (Roche Diagnostics GmbH) 14 1 UI = 1 cp Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Range lineare di rese utilizzando i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx — HIV 8 Risultato (in UI/ml) A 7 6 5 4 y = 0,8867x + 0,3878 3 R = 0,9972 2 2 2 3 4 5 6 7 8 Input (in UI/ml) 8 Risultato (in UI/ml) B 7 6 5 4 y = 0,8838x + 0,3818 2 R = 0,9976 3 2 2 3 4 5 6 7 8 Input (in UI/ml) Figura 1. Il range lineare dei protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx è stato determinato utilizzando: A) l’analisi quantitativa LCx HIV RNA con il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) e B) il protocollo standard QIAamp DSP 96 Virus MDx. I valori UI sono stati calcolati utilizzando le specifiche presenti nel manuale per il test downstream (1 UI = 0,1412 cp). Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 15 Range lineare di rese utilizzando il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx — HCV Risultato (in UI/ml) 7 6 5 4 3 y = 0,9054x + 0,3011 2 R2 = 0,9982 1 1 2 3 4 5 6 7 Input (in UI/ml) Figura 2. Il range lineare del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx è stato determinato utilizzando il test COBAS TaqMan HCV. I valori UI sono stati calcolati utilizzando le specifiche presenti nel manuale per il test downstream (1 UI = 1 cp). Range lineare di rese utilizzando il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) — HBV Risultato (in UI/ml) 5 4 3 2 y = 1,0577x – 0,5599 2 R = 0,9987 1 0 0 1 2 3 Input (in UI/ml) 4 5 Figura 3. Il range lineare del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) è stato determinato utilizzando il test COBAS AMPLICOR HBV MONITOR. I valori UI sono stati calcolati utilizzando le specifiche presenti nel manuale per il test downstream (1 UI = 5,26 cp). 16 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Precisione I coefficienti di variazione (CV) sono stati determinati per le serie di diluizione dell’HIV, dell’HCV e dell’HBV nel range lineare del test successivo appropriato. Per l’analisi di precisione, sono stati utilizzati gli stessi test downstream, le stesse serie di diluizione e gli stessi insiemi di dati utilizzati per la determinazione del range lineare. Il calcolo dei titoli (conversione da cp a valori in UI) è stato eseguito seguendo le specifiche del produttore corrispondente del test downstream (vedere Tabella 4, pagina 14). I dati intra-esecuzione, interesecuzione e di precisione totali sono mostrati nel coefficiente di variazione percentuale (%CV) nelle Tabelle 5–8. Tabella 5. Precisione del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) nell’analisi quantitativa LCx HIV RNA Media titolo (UI/ml) Precisione intraesecuzione (%CV) Precisione interesecuzione (%CV) Precisione totale (%CV) 8,01 x 106 9,38 5,03 10,64 2,86 x 106 13,62 0,00 13,62 2,63 x 105 25,09 10,28 27,11 5,09 x 104 11,38 5,50 12,63 7,00 x 103 19,93 15,77 25,41 3,71 x 103 32,41 0,00 32,41 1,44 x 103 78,10 0,00 78,10 Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 17 Tabella 6. Precisione del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx nell’analisi quantitativa LCx HIV RNA Media titolo (UI/ml) Precisione intraesecuzione (%CV) Precisione interesecuzione (%CV) Precisione totale (%CV) 7,49 x 106 14,37 3,89 14,89 2,74 x 106 11,06 5,47 12,34 2,61 x 105 12,45 0,00 12,45 4,71 x 104 12,92 0,00 12,92 5,64 x 103 26,98 0,00 26,98 3,69 x 103 45,35 0,00 45,35 1,56 x 103 74,41 11,40 75,28 Tabella 7. Precisione del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx nel test COBAS TaqMan HCV Media titolo (UI/ml) Precisione intraesecuzione (%CV) Precisione interesecuzione (%CV) Precisione totale (%CV) 5,92 x 105 10,31 11,05 15,12 6,01 x 104 16,24 4,09 16,75 7,47 x 103 16,46 8,62 18,58 1,16 x 103 17,73 0,00 17,73 6,13 x 102 25,15 0,00 25,15 2,74 x 102 35,74 28,56 45,75 1,07 x 102 39,97 0,00 39,97 18 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Tabella 8. Precisione del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) nel test COBAS AMPLICOR HBV MONITOR Media titolo (UI/ml) Precisione intraesecuzione (%CV) Precisione interesecuzione (%CV) Precisione totale (%CV) 8,30 x 103 11,24 23,79 26,31 2,85 x 103 24,52 24,91 34,95 8,04 x 102 19,08 25,84 32,12 2,39 x 102 20,51 24,98 32,32 7,77 x 101 15,02 25,28 29,40 1,71 x 101 53,02 0,00 53,02 6,34 x 100 47,56 48,59 67,99 Limite di rilevamento Il limite di rilevamento è stato determinato dal valore di probit al 95% per entrambi i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx utilizzando rispettivamente gli standard internazionali sui virus HIV e HBV dell’OMS 97/656 e 97/746. Il limite di rilevamento è stato determinato elaborando le serie di diluizione dei virus appropriati (standard internazionali OMS sui virus in plasma umano negativo a HIV e HBV con citrato). Ogni passaggio di diluizione è stato testato in 3 esecuzioni sul sistema BioRobot MDx DSP, con 36 replicati per diluizione. Per il rilevamento di RNA HIV è stato utilizzando un test RT-PCR real-time interno. Il DNA dell’HBV è stato analizzando utilizzando un metodo PCR interno endpoint seguito da elettroforesi del gel dell’agarosi. Gli ampliconi della dimensione attesa sono stati contati come risultati. I dati combinati per tutti i campioni sono stati valutati utilizzando analisi di probit (Logistic regression, Arcus Quickstat, Biomedical Version 1.1). I dati sono presentati nelle Tabelle 9 e 10. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 19 Tabella 9. Limite di rilevamento di RNA HIV usando i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx e un test RT-PCR in tempo reale interno Protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx Protocollo QIAamp (AW1) DSP 96 Virus MDx Titolo di input (UI/ml) Replicati Risultati Risultati (%) Risultati Risultati (%) 800 36 36 100,00 36 100,00 600 36 36 100,00 36 100,00 400 36 36 100,00 36 100,00 200 36 36 100,00 35 97,22 100 36 35 97,22 33 91,67 50 36 23 63,89 27 75,00 10 36 6 16,67 7 19,44 0 18 0 0,00 0 0,00 Valore di probit al 95% Intervallo di confidenza 20 – 123,08 – 133,92 – – 87,84– 205,19 – 92,38– 234,94 – Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Tabella 10. Limite di rilevamento di RNA HBV usando i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx e un test PCR interno Protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx Protocollo QIAamp (AW1) DSP 96 Virus MDx Titolo di input (UI/ml) Replicati Risultati Risultati (%) Risultati Risultati (%) 50 36 36 100,00 36 100,00 35 36 33 91,67 36 100,00 20 36 31 86,11 33 91,67 10 36 27 75,00 23 63,89 5 36 11 30,56 19 52,78 2 36 9 25,00 11 30,56 0,5 36 4 11,11 4 11,11 0 18 0 0,00 0 0,00 Valore di probit al 95% Intervallo di confidenza – – 51,73 – 37,51 – 33,08– 100,01 – 24,27– 72,53 – Robustezza del sistema È stato eseguito un confronto dei risultati relativi ai campioni di plasma e siero da donatori singoli raccolti utilizzando provette di prelievo di sangue diverse (Tabella 11) a cui sono stati aggiunti standard dei virus HIV e HCV. I campioni sono stati elaborati utilizzando i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx (Figure 4 e 5). Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 21 Tabella 11. Combinazioni di provette e virus aggiunti a campioni di plasma per la determinazione della variazione del sistema Virus Provetta Abbreviazione Fornitore N. cat.* HIV Vacutainer PPT™ PPT BD 362788 HIV Vacuette® EDTA Vacuette Greiner bio-one 454036 HIV Primavette S EDTA Primavette HCV Vacutainer PPT PPT Kabe Labortechnik BD HCV Monovette® S 9NC Coagulation 9 NC Sarstedt HCV Monovette Serum Gel S 9 Sarstedt S Gel 0959 0540 362788 02.1067.001 02.1388.001 * I numeri di catalogo sono soggetti a modifica; verificare con il produttore o con il fornitore. Robustezza del sistema utilizzando provette diverse — HIV Risultato (in UI/ml) 6 5 4 3 2 1 0 PPT Vacuette Primavette Provette Figura 4. Per aggiungere ai campioni di plasma HIV a un titolo di 1,4 x 105 UI/ml è stato utilizzato uno standard funzionante interno di virus HIV calibrato allo standard internazionale dell’OMS L’RNA HIV è stato purificato utilizzando il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx e rilevato utilizzando il test COBAS TaqMan HIV-1 (Roche Diagnostics GmbH). Le provette utilizzate sono elencate nella Tabella 11. I valori UI sono stati calcolati utilizzando le specifiche presenti nel manuale per il test downstream (1 UI = 0,61 cp). 22 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Risultato (in UI/ml) Robustezza del sistema utilizzando provette diverse — HCV 4 3 2 1 0 PPT S 9NC S Gel Provette Figura 5. Ai campioni dei donatori è stato aggiunto uno standard di virus HCV calibrato disponibile in commercio di AcroMetrix a un titolo di 500 UI/ml. Per il rilevamento, è stato utilizzato il test COBAS TaqMan HCV (Roche Diagnostics GmbH) come test diagnostico downstream. La preparazione del campione è stata eseguita utilizzando il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1). Le provette utilizzate sono elencate nella Tabella 11, pagina 22. I valori UI sono stati calcolati utilizzando le specifiche presenti nel manuale per il test downstream (1 UI = 1 cp). Esclusione del carryover dei campioni Sul sistema BioRobot MDx DSP sono state effettuate sei esecuzioni, per valutare il rischio di eventi di contaminazione crociata durante e tra i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx. Il test è stato eseguito utilizzando uno standard virus HBV quantificato HBV messo in commercio da AcroMetrix. Il carico virale dei campioni positivi utilizzati per i test del carryover era di 2,0 x 105 UI/ml. Per la diluizione di campioni positivi e come campioni di controllo negativi, è stato utilizzato plasma umano negativo all’HBV con citrato. Per rilevare il carryover da campione a campione, sono state effettuate 3 esecuzioni con una disposizione a scacchiera di campioni negativi e fortemente positivi. Dopo ogni esecuzione a scacchiera, per monitorare il possibile carryover da una esecuzione all’altra, è stata effettuata un’esecuzione con campioni tutti negativi. Il DNA HBV è stato rilevato utilizzando un test PCR interno endpoint seguito da elettroforesi del gel dell’agarosi. È stato convalidato che il test è in grado di rilevare il DNA HBV con una probabilità del 95% a un titolo del virus pari a 16,76 UI/ml (probit al 95%). Tramite l’utilizzo del test PCR HBV interno, tutti i campioni altamente positivi sono stati rilevati come positivi. Tutti i campioni negativi, nelle esecuzioni a scacchiera e nelle esecuzioni in cui erano presenti solo campioni negativi, non hanno fornito risposta. Questi esperimenti dimostrano che i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx, in queste condizioni, non presentano carryover di campioni. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 23 Strumenti e reagenti forniti dall’operatore Quando si utilizzano sostanze chimiche, indossare sempre un adeguato camice da laboratorio, guanti monouso e occhiali di protezione. Per ulteriori informazioni, consultare le appropriate schede di sicurezza (MSDS), disponibili presso il fornitore dei prodotti. Il sistema BioRobot MDx DSP, compresi la stazione di lavoro BioRobot MDx, il software QIAsoft MDx DSP e il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx Puntali dei filtri monouso, 1100 μl (960) (n. di catalogo 9012598) Etanolo (96–100%, grado di purezza p.a.) Acqua distillata deionizzata Guanti monouso Cilindri di misurazione (200, 500 e 1000 ml) Centrifuga con rotore compatibile per la centrifugazione delle provette del campione Pipette e relativi puntali (per evitare la contaminazione crociata, si raccomanda di utilizzare puntali con filtro) 24 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Note importanti Punti generali importanti Dopo aver ricevuto il kit, verificare che i singoli componenti non siano danneggiati. Se le confezioni blister o i flaconi appaiono danneggiati, rivolgersi al servizio di assistenza QIAGEN o al distributore locale. In caso di rovesciamento dei liquidi, consultare le “Informazioni di sicurezza” (pagina 7). Non utilizzare componenti del kit danneggiati, poiché potrebbero inficiare le prestazioni del kit. Utilizzare sempre attrezzature prive di RNasi. Sostituire sempre i puntali delle pipette quando si eseguono trasferimenti manuali di liquidi (per es., al momento della preparazione, dell’unione o della divisione di campioni virali da posizionare sul tavolo di lavoro BioRobot MDx). Utilizzare sempre puntali dei filtri monouso di QIAGEN (vedere pagina 24) per evitare la contaminazione crociata. Utilizzare sempre guanti monouso e controllare regolarmente che non siano contaminati da materiale campione. Se i guanti risultano contaminati, gettarli. Per escludere i rischi associati all’uso di materiale potenzialmente infetto, si raccomanda di operare in condizioni di flusso d’aria laminare, finché non ha avuto luogo il posizionamento dei campioni sul tavolo di lavoro BioRobot MDx. Non utilizzare componenti appartenenti a un altro kit QIAamp DSP 96 Virus MDx, a meno che i numeri del materiale e di lotto dei due kit non siano identici. Non unire reagenti da flaconi o provette diversi, anche se provengono dallo stesso lotto o dallo stesso kit. Dopo l’utilizzo, chiudere tutti i flaconi per evitare perdite. Non utilizzare un kit o un suo componente dopo la data di scadenza. Evitare la contaminazione microbica dei reagenti del kit. Il sistema deve essere utilizzato esclusivamente da personale esperto nelle pratiche di laboratorio per la diagnostica in vitro e nel funzionamento del sistema BioRobot MDx DSP. Il personale deve inoltre far riferimento al Manuale utente BioRobot MDx DSP. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 25 Preparazione dell’RNA Il tampone di eluizione (AVE) è testato per l’assenza di livelli rilevabili di RNasi e contiene sodio azide, un agente antimicrobico in grado di impedire la crescita di organismi che producono RNasi. Tuttavia, poiché questo tampone non contiene agenti chimici di degradazione delle RNasi, non può inibire le RNasi introdotte da una manipolazione scorretta. Manipolare con cura il tampone di eluizione (AVE), onde evitare la contaminazione con le RNasi. Conservazione dei campioni Dopo il prelievo e la preparazione, è possibile conservare plasma e siero a 2–8 °C per un massimo di 6 ore. Per una conservazione a lungo termine, è consigliato il congelamento a -20 °C o -80 °C in aliquote. I campioni di siero e plasma non devono essere scongelati più volte. Congelamento e scongelamento, se ripetuti, possono provocare la denaturazione e la precipitazione delle proteine, riducendo i titoli virali e limitando di conseguenza la resa di acidi nucleici virali. Inoltre, i crioprecipitati che si formano durante il congelamento e lo scongelamento ripetuti possono ostruire le membrane della piastra QIAamp 96. Se sono visibili crioprecipitati, farli sedimentare per centrifugazione a circa 6800 x g per 3 minuti. Aspirare e processare immediatamente il sovranatante limpido, senza toccare il pellet. Prima di iniziare la procedura di purificazione dell’acido nucleico virale, i campioni scongelati devono essere equilibrati a temperatura ambiente (15–25 °C). Preparazione di reagenti e tamponi Preparazione della proteasi QIAGEN Aggiungere l’intero contenuto di un flacone di solvente della proteasi (PS) contenente 6 ml a un tubo contenente la proteasi QIAGEN (QP) liofilizzata e miscelare con cura. Per evitare la formazione di schiuma, miscelare più volte la fiala capovolgendola. Assicurarsi che la proteasi QIAGEN (QP) sia completamente disciolta. Aprire la fiala e posizionarla nel portareagenti per 1 flacone (QP) sul tavolo di lavoro BioRobot MDx. 26 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Aggiunta dell’RNA carrier al tampone di lisi L’RNA carrier svolge una duplice funzione. In primo luogo potenzia il legame degli acidi nucleici virali alla membrana della piastra QIAamp 96, soprattutto se i campioni contengono un numero molto limitato di molecole target. Secondariamente, aggiungendo grandi quantità di RNA carrier si riduce la possibilità di degradazione dell’RNA virale, nel raro caso che le molecole dell’RNasi non vengano denaturate dai sali caotropici e dal detergente nel tampone di lisi (AL). Se non si aggiunge RNA carrier al tampone di lisi (AL), si può osservare una diminuzione della quantità di DNA o RNA virale ottenuto. Inoltre l’RNA carrier può rientrare nella composizione di alcuni reagenti per controllo interno dei test commerciali downstream. In tali casi, consultare le istruzioni per l’uso fornite dal produttore del test downstream. Per preparare la soluzione di RNA carrier, aggiungere 450 μl di tampone di eluizione (AVE) a una fiala contenente 1.350 μg di RNA carrier liofilizzato. È fornita una provetta di tampone di eluizione (AVE) per ogni fiala di RNA carrier. L’RNA carrier non si dissolve nel tampone di lisi (AL). È prima necessario discioglierlo nel tampone di eluizione (AVE) e successivamente aggiungerlo al tampone di lisi (AL). Assicurarsi che l’RNA carrier sia completamente disciolto nel volume appropriato di tampone di eluizione (AVE), prima di miscelarlo con il tampone di lisi (AL). Trasferire 230 μl di RNA carrier ricostituito nel tampone di eluizione (AVE) a un flacone contenente 33 ml di tampone di lisi (AL) per ottenere una concentrazione finale di 5,6 μg di RNA carrier per la preparazione del campione. Miscelare delicatamente il flacone capovolgendolo 10 volte. Per evitare la formazione di schiuma, non utilizzare il vortex. Versare la miscela di tampone di lisi (AL) e RNA carrier in un recipiente monouso (DT) nel portareagente per 2 recipienti (posizione AL) e rimuovere tutte le bolle d’aria più grandi toccandole con il puntale di una pipetta. Versare con attenzione il tampone di lisi (AL) contenente l’RNA carrier nel recipiente monouso (DT) al fine di evitare la creazione di bolle grandi che potrebbero interferire con il sistema di rilevamento del liquido. Aggiunta di un controllo interno al tampone di lisi Si raccomanda fortemente l’impiego di un controllo interno quando si utilizza il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx in combinazione con sistemi di amplificazione diagnostici e di rilevamento. In questo caso occorre aggiungere al tampone di lisi (AL) l’RNA o il DNA di controllo interno e l’RNA carrier ricostituito, quindi miscelarli con cura, invertendo il flacone 10 volte. Per evitare la formazione di schiuma, non utilizzare il vortex. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 27 Consultare le istruzioni del produttore per stabilire la concentrazione ottimale del controllo interno. L’uso di una concentrazione diversa da quella consigliata può generare risultati scorretti. Quando si calcola la quantità appropriata di controllo interno da utilizzare, tenere in considerazione il volume iniziale del campione e quello dell’eluato. Per i calcoli, utilizzare un volume di campione di partenza di 265 μl e un volume di eluato di 83 μl (vedere “Eluizione di acidi nucleici virali”, pagina 31). Consultare l’Appendice C per un esempio di come calcolare la quantità di controllo interno da utilizzare con il sistema BioRobot MDx DSP e con i test diagnostici downstream. Utilizzare sempre il controllo interno corretto per il test downstream. Per ulteriori informazioni, vedere le istruzioni fornite dal produttore. Consultare l’Appendice C per un esempio di come calcolare la quantità di controllo interno da utilizzare con il sistema BioRobot MDx DSP. Se si aggiunge un controllo interno al tampone di lisi (AL) e all’RNA carrier, assicurarsi di trasferire non più di 33 ml della miscela nel recipiente monouso (DT). Smaltire il rimanente. L’utilizzo di volumi maggiori potrebbe comportare una misurazione di liquido non corretta da parte del sistema di rilevamento del livello del liquido, causando il fallimento della procedura di controllo caricamento. Preparazione del tampone di lavaggio 1 (esclusivamente per il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx AW1) Utilizzando un cilindro graduato, aggiungere 200 ml di etanolo (96–100%) a un flacone contenente 151 ml di tampone di lavaggio 1 (AW1) concentrato. Un flacone di tampone di lavaggio 1 (AW1) ricostituito contiene tampone sufficiente per 3 esecuzioni di 96 campioni ciascuna. Conservare il tampone di lavaggio 1 (AW1) ricostituito a temperatura ambiente (15–25 °C). Per consentire l’identificazione da parte del sistema BioRobot MDx DSP, ogni flacone di tampone di lavaggio 1 (AW1) riporta un codice a barre sull’etichetta. Il flacone aperto deve essere posizionato nel carosello dei reagenti con il codice a barre rivolto verso l’esterno. Il reagente è necessario esclusivamente per il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1). Per il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx standard, il flacone del tampone di lavaggio 1 (AW1) può essere rimosso dal rotore dei reagenti o lasciato in posizione. Miscelare sempre il tampone di lavaggio 1 (AW1) ricostituito, invertendo il flacone più volte prima di posizionarlo nel carosello dei reagenti. Dopo un’esecuzione, se non si procede immediatamente a un’altra esecuzione, chiudere il flacone. Togliere il tappo quando si inizia un’altra esecuzione. 28 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Preparazione del tampone di lavaggio 2 Utilizzando un cilindro graduato, aggiungere 300 ml di etanolo (96–100%) a un flacone contenente 127 ml di tampone di lavaggio 2 (AW2) concentrato. Un flacone di tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituito contiene tampone sufficiente per 3 esecuzioni di 96 campioni ciascuna. Conservare il tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituito a temperatura ambiente (15–25 °C). Per consentire l’identificazione da parte del sistema BioRobot MDx DSP, ogni flacone di tampone di lavaggio 2 (AW2) riporta un codice a barre sull’etichetta. Il flacone aperto deve essere posizionato nel carosello dei reagenti con il codice a barre rivolto verso l’esterno. Miscelare sempre il tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituito, invertendo il flacone più volte prima di posizionarlo nel carosello dei reagenti. Dopo un’esecuzione, se non si procede immediatamente a un’altra esecuzione, chiudere il flacone. Togliere il tappo quando si inizia un’altra esecuzione. Preparazione dell’etanolo Riempire il flacone vuoto di etanolo (BOT) con 350 ml di etanolo (96–100%). Aggiungere 350 μl di tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituito a tale flacone (per una diluizione finale 1/1000 di AW2); ciò consente al sistema BioRobot MDx DSP di rilevare il livello di riempimento nel flacone attraverso misurazioni della conducibilità. Il flacone riempito contiene etanolo sufficiente per 2 esecuzioni di 96 campioni ciascuna. Conservare il flacone a temperatura ambiente (15–25 °C). Per consentire l’identificazione da parte del sistema BioRobot MDx DSP, il flacone di etanolo (BOT) riporta un codice a barre sull’etichetta. Il flacone aperto deve essere posizionato nel carosello dei reagenti con il codice a barre rivolto verso l’esterno. Miscelare sempre l’etanolo invertendo il flacone più volte prima di posizionarlo nel carosello dei reagenti. Dopo un’esecuzione, se non si procede immediatamente a un’altra esecuzione, chiudere il flacone. Togliere il tappo quando si inizia un’altra esecuzione. Assicurarsi che siano aggiunti a 350 ml di etanolo (EtOH) 350 μl di tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituito, come descritto precedentemente, al fine di consentire la misurazione della conducibilità da parte del sistema BioRobot MDx DSP. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 29 Preparazione del liquido di sistema Riempire il flacone del liquido di sistema vuoto nel rotore dei reagenti con almeno 700 ml di acqua deionizzata. Il flacone riempito contiene liquido di sistema sufficiente per 1 esecuzione di 96 campioni e per la procedura di pulizia successiva all’esecuzione. Il flacone aperto deve essere posizionato nell’alloggiamento corrispondente nel carosello dei reagenti. Preparazione del tampone di eluizione Per 1 esecuzione di 96 campioni, sono necessarie 8 provette di tampone di eluizione (AVE). Aprire tali provette e posizionarle nel portareagente per microprovette e nel recipiente (posizione AVE). Fare attenzione a non contaminare i tamponi con RNasi. Smaltire il tampone di eluizione (AVE) in eccesso dopo ogni esecuzione. Preparazione del fluido di eluizione Per 1 esecuzione di 96 campioni, sono necessarie 4 provette di fluido di eluizione (TOPE). Aprire tali provette e posizionarle nel portareagente per microprovette e nel recipiente (posizione TOPE). Smaltire il fluido di eluizione (TOPE) in eccesso dopo ogni esecuzione. Preparazione degli oggetti in plastica S-Block Per ogni esecuzione, deve essere posizionato 1 S-Block (SB) nell’adattatore di trasferimento del calore argentato del sistema di riscaldamento e raffreddamento. Assicurarsi che la posizione A1 si trovi nell’angolo in alto a sinistra. Smaltire l’S-Block dopo ogni esecuzione. Recipienti monouso Per ogni esecuzione, devono essere posizionati 2 recipienti monouso (DT) nel portareagente per 2 recipienti (posizioni AL e EtOH) nella fessura 2 dell’MP. Smaltire i recipienti monouso (DT) dopo l’esecuzione. Microprovette di eluizione CL Per ogni esecuzione, 1 provetta di eluizione CL (EMT) deve essere posizionata nell’adattatore blu per microprovette di eluizione. L’insieme delle provette di eluizione CL (EMT) e dell’adattatore deve essere posizionato sulla parte superiore del portareagente per microprovette e del recipiente. Assicurarsi che il codice a barre delle microprovette di eluizione CL (EMT) sia rivolto verso destra. 30 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Piastra QIAamp 96 Per ogni esecuzione, una piastra QIAamp 96 deve essere posizionata nell’apposito portapiastra a pozzetti multipli argentato. Assicurarsi che la posizione A1 si trovi nell’angolo in altro a sinistra e che il codice a barre della piastra QIAamp 96 sia rivolto verso destra. Smaltire la piastra QIAamp 96 dopo l’esecuzione. Preparazione dei contenitori grandi di liquido All’avvio del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx sul sistema BioRobot MDx DSP, appariranno sul display dei messaggi relativi alla preparazione del contenitore del liquido di sistema, del contenitore dei rifiuti e della trappola del vuoto. Contenitore del liquido di sistema Svuotare il contenitore del liquido di sistema (sotto la stazione di lavoro). Per aprire il contenitore del liquido di sistema, scollegare prima i tubi e poi rimuovere il coperchio. Sciacquare il contenitore accuratamente con acqua fresca deionizzata e riempirlo nuovamente con acqua fresca deionizzata. Dopo aver riempito il contenitore del liquido di sistema con acqua deionizzata, chiudere il coperchio e collegare i tubi. Irrorare il sistema del diluitore con 30 ml di acqua deionizzata selezionando “Tools/Flush System” (Strumenti/ Lava sistema). Contenitore di scarico e trappola del vuoto Svuotare la trappola del vuoto e il contenitore di scarico (sotto la stazione di lavoro). Quando si apre la trappola del vuoto, scollegare prima i tubi e poi rimuovere il coperchio. Dopo aver svuotato la trappola del vuoto, chiudere il coperchio e collegare i tubi. La trappola e il contenitore, e i rispettivi coperchi e tubi, possono essere puliti con detergente e sciacquati con acqua. I liquidi di scarico generati dalla procedura QIAamp DSP 96 Virus MDx non sono stati testati per la presenza di materiali infetti residui. La contaminazione dei liquidi di scarico da parte di materiali infetti residui è altamente improbabile, ma non può essere esclusa completamente. Pertanto i liquidi di scarico devono essere considerati infetti e smaltiti in conformità alle normative di sicurezza locali vigenti in materia. Eluizione di acidi nucleici virali Gli acidi nucleici virali sono raccolti in microprovette di eluizione CL (EMT). Il volume medio di tampone di eluizione (AVE) aggiunto dal sistema BioRobot Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 31 MDx DSP per ciascun pozzetto della piastra QIAamp 96 è 91 μl. Il volume medio di ogni eluato raccolto nelle microprovette di eluizione CL (EMT) è 83 μl. Resa e qualità degli acidi nucleici virali La resa e la qualità degli acidi nucleici virali isolati sono idonee per tutti i tipi di applicazioni di diagnostica molecolare downstream. La resa e la purezza degli acidi nucleici virali possono variare, a seconda che il protocollo venga utilizzato con o senza tampone di lavaggio 1 (AW1). L’utente deve convalidare il protocollo che meglio si adatta allo specifico test downstream, sulla base delle linee guida ICH in ICH Q2A: Validation of analytical methods: Definitions and terminology e ICH Q2B: Validation of analytical methods: Methodology. Eseguire i test diagnostici attenendosi alle istruzioni dei produttori. Impostazione della stazione di lavoro BioRobot MDx Dopo aver aperto il software QIAsoft MDx DSP e avviato uno dei protocolli di preparazione dei campioni (vedere protocollo, pagina 37), appare una serie di messaggi che guidano l’utente attraverso l’impostazione della stazione di lavoro BioRobot MDx per la procedura di purificazione computerizzata degli acidi nucleici virali. È importante seguire ogni messaggio visualizzato prima di passare al successivo. La Figura 6 (pagina 33) e le Tabelle 12 e 13 (pagine 34 e 35) riassumono il layout del tavolo di lavoro BioRobot MDx e le posizioni nelle quali devono essere collocati gli elementi. Pulizia della stazione di lavoro BioRobot MDx Alla fine dell’esecuzione di un protocollo, il software QIAsoft MDx DSP visualizza una serie di messaggi che guidano l’utente attraverso i passaggi della procedura di pulizia. Dopo ogni esecuzione, smaltire sempre gli oggetti in plastica e i reagenti rimanenti sul tavolo di lavoro (AL, AVE, TOPE ed etanolo), al fine di evitare il carryover di acidi nucleici virali all’esecuzione successiva del protocollo. I reagenti rimasti nel carosello dei reagenti (AW1 e AW2) possono essere utilizzati in diverse esecuzioni di protocollo fino alla data di scadenza specificata sulle etichette dei flaconi. Non unire reagenti da flaconi o provette diversi, anche se provengono dallo stesso lotto o dallo stesso kit. I liquidi di scarico generati dalla procedura QIAamp DSP 96 Virus MDx non sono stati testati per la presenza di materiali infetti residui. La contaminazione dei liquidi di scarico da parte di materiali infetti residui è altamente improbabile, ma non può essere esclusa completamente. Pertanto i liquidi di scarico devono essere considerati infetti e smaltiti in conformità alle normative di sicurezza locali vigenti in materia. 32 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Tavolo da lavoro BioRobot MDx Vassoio per puntali Portapiastra a pozzetti multipli nero (contiene l’adattatore di canalizzazione) Portapiastra a pozzetti multipli argentato (contiene una piastra QIAamp 96) Base apparato da vuoto Coperchio apparato da vuoto Parte superiore dell’apparato da vuoto Sistema di riscaldamento e raffreddamento Portareagente per 1 flacone QP Portareagente per microprovette e recipiente Posizione TOPE Posizione AVE Sistema di monitoraggio campioni Microprovette di eluizione CL (sull’adattatore di microprovette di eluizione) Portareagente per 2 recipienti (posizione EtOH) Portareagente per 2 recipienti (posizione AL) Figura 6. Panoramica del tavolo di lavoro BioRobot MDx e dei suoi componenti principali. Fare riferimento alle Tabelle 12 e 14 per maggiori dettagli. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 33 Tabella 12. Caricamento degli oggetti in plastica e degli accessori Articolo Posizione Microprovette di eluizione CL (EMT) Portareagente per Adattatore microprovette microprovette e recipiente di eluizione blu Recipiente monouso (DT) Fessura 2 MP Contenitore/adattatore Portareagente per 2 recipienti (EtOH e AL) Piastra QIAamp 96 Portapiastra a pozzetti multipli argentato Adattatore di canalizzazione Portapiastra a pozzetti multipli nero S-Block (SB) Sistema di riscaldamento Adattatore di trasferimento e raffreddamento di calore argentato Puntali monouso (1100 μl) Porta puntale rosso Coperchio apparato da vuoto A destra della base dell’apparato da vuoto Parte superiore dell’apparato da vuoto A destra della base dell’apparato da vuoto e sopra il coperchio dell’apparato da vuoto 34 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Tabella 13. Caricamento dei tamponi e dei reagenti Articolo Posizione Volume Tampone di lisi (AL)* Recipiente monouso (DT) 33 ml nel portareagente per 2 recipienti (posizione AL) Proteasi QIAGEN (QP)† Portareagente per 1 flacone (QP) Tampone di eluizione (AVE) Portareagente per Otto provette da 2 ml microprovette e recipiente (tappo viola) (posizione AVE) Fluido di eluizione (TOPE)‡ Portareagente per microprovette e recipiente (posizione TOPE) Quattro provette da 1,5 ml (tappo arancione) Tampone di lavaggio 1 (AW1)§ Carosello dei reagenti Minimo di 164 ml (ricostituito) Tampone di lavaggio 2 (AW2) Carosello dei reagenti Minimo di 191 ml (ricostituito) Etanolo Carosello dei reagenti Minimo di 350 ml Liquido di sistema Carosello dei reagenti Minimo di 700 ml di acqua deionizzata Campioni Sistema di monitoraggio Minimo di 500 μl di campioni campione in ogni provetta 6 ml * Contenente RNA carrier e controllo interno. † Ricostituito in 6 ml di solvente della proteasi (PS). ‡ La presenza di fluido di eluizione (TOPE) non è monitorata nel controllo di caricamento. § Necessario esclusivamente per il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1). Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 35 Protocollo: isolamento e purificazione in automatico degli acidi nucleici virali da plasma e siero Per isolare e purificare acidi nucleici virali da 265 μl di plasma o siero trattati con EDTA o citrato utilizzando il sistema BioRobot MDx DSP. Punti importanti prima di iniziare Ogni campione deve essere etichettato con un codice a barre; in caso contrario, non sarà elaborato. La persona con accesso da supervisore al software QIAsoft MDx DSP può selezionare se usare codici a barre univoci (l’impostazione predefinita) o codici a barre non univoci. Per dettagli, fare riferimento al Manuale utente BioRobot MDx DSP. Utilizzando l’opzione con codici a barre non univoci, lo stesso codice a barre può essere utilizzato per etichettare campioni diversi. In tal caso, prestare attenzione a non confondere i campioni aventi lo stesso codice a barre. Orientare i campioni etichettati con codice a barre nei portaprovette del sistema di monitoraggio dei campioni in modo tale che i codici a barre siano rivolti verso la telecamera del lettore di codici a barre sul lato sinistro della stazione di lavoro BioRobot MDx. Le etichette dei codici a barre devono essere attaccate alle provette dei campioni in modo tale che le linee dei codici a barre siano orizzontali. Le etichette dei codici a barre devono essere compatibili con la stazione di lavoro BioRobot MDx (per dettagli, vedere il Manuale utente BioRobot MDx DSP). Ogni provetta deve contenere almeno 500 μl di campione. Il contenitore di smaltimento dei puntali deve contenere una borsa di smaltimento dei puntali completamente aperta e vuota. Il cassetto con il contenitore di smaltimento dei puntali deve essere completamente inserito. Il contenitore del liquido di sistema, il contenitore dei rifiuti e la trappola del vuoto devono essere posizionati correttamente nei rispettivi contenitori e la loro parte esterna deve essere asciutta. Il sensore del contenitore del liquido di sistema deve essere asciutto. Se il sistema BioRobot MDx DSP visualizza un errore (per es., pressione indotta dal vuoto insufficiente) durante la preparazione computerizzata dei campioni, seguire le istruzioni visualizzate nei messaggi sullo schermo o fare riferimento al Manuale utente BioRobot MDx DSP. I messaggi visualizzati (che appaiono in inglese) o le loro traduzioni sono elencati nell’Appendice A, pagina 41. 36 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Operazioni da eseguire prima di iniziare Aggiungere l’RNA carrier ricostituito in tampone di eluizione (AVE) e il controllo interno al tampone di lisi (AL), secondo le istruzioni a pagina 27. Assicurarsi che il tampone di lavaggio 1 (AW1), il tampone di lavaggio 2 (AW2), la proteasi QIAGEN (QP) e l’etanolo siano stati preparati secondo le istruzioni della sezione “Preparazione di reagenti e tamponi” a pagina 26. Procedura 1. Lasciar equilibrare i campioni a temperatura ambiente (15–25 °C) e miscelare bene diverse volte per inversione. I crioprecipitati che si formano durante il congelamento e lo scongelamento ripetuti possono ostruire le membrane della piastra QIAamp 96. Se sono visibili crioprecipitati, farli sedimentare per centrifugazione a circa 6800 x g per 3 minuti. Aspirare e processare immediatamente il sovranatante limpido, senza toccare il pellet. Evitare la creazione di bolle grandi, poiché potrebbero interferire con il sistema di rilevamento del liquido. 2. Assicurarsi che la stazione di lavoro BioRobot MDx sia accesa. L’interruttore è posizionato in basso a destra sul pannello frontale della stazione di lavoro BioRobot MDx DSP. 3. Accendere il computer e il monitor. 4. Avviare il software QIAsoft MDx DSP. Il software può essere avviato dal desktop. 5. Effettuare il login con il nome utente e la password. Il nome utente e la password di ogni operatore possono essere definiti dal supervisore. Per informazioni dettagliate su come assegnare un nome utente e una password a ogni operatore, fare riferimento al Manuale utente BioRobot MDx DSP. 6. Fare clic su per attivare la finestra di dialogo adiacente. Utilizzare il lettore di codice a barre manuale per effettuare la scansione del codice a barre della Q-Card in tale campo. Per ogni protocollo, sull’etichetta della Q-Card è stampato un codice a barre. Dopo aver eseguito la scansione del codice a barre appropriato, il protocollo è selezionato automaticamente. Assicurarsi di scegliere il protocollo appropriato. Scegliere il codice a barre superiore per il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1), con lavaggio AW1. Scegliere il codice a barre inferiore per il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx, senza lavaggio AW1. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 37 Il codice a barre della Q-Card contiene informazioni sul numero di materiale, sul numero di lotto e sulla data di scadenza dei reagenti. Queste informazioni e il protocollo scelto saranno registrati in un file di risultati generato per ogni esecuzione. per avviare il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx. 7. Fare clic su 8. Scegliere se inserire un ID specifico dell’utente per l’esecuzione del protocollo. Se si sceglie questa opzione, appare una finestra di dialogo per l’immissione di un ID specifico utilizzando esclusivamente lettere e numeri (l’ID deve essere univoco e non può essere utilizzato nuovamente). Alla fine dell’esecuzione del protocollo, il software crea dei file di risultati il cui nome sarà lo specifico ID inserito. I contenuti di tali file saranno gli stessi di quelli dei file di risultati predefiniti. 9. Attenersi alle istruzioni sullo schermo per impostare il tavolo di lavoro. Per i passaggi rimanenti necessari per impostare la stazione di lavoro BioRobot MDx (vedere pagina 41), è possibile scegliere di essere guidati da una serie di messaggi visualizzati o da una tabella di riferimento. L’ultima opzione dovrebbe essere scelta solo da utenti esperti. Versare con attenzione il tampone di lisi (AL) contenente l’RNA carrier (e il controllo interno opzionale) nel recipiente monouso (DT) al fine di evitare la creazione di bolle grandi che potrebbero interferire con il sistema di rilevamento del liquido. Quando il coperchio del tavolo di lavoro è bloccato, il sistema BioRobot MDx DSP controlla che ogni componente necessario per il protocollo sia in posizione e che sia possibile leggere i codici a barre. Se viene rilevato un errore (per es., manca un componente o il volume di un reagente è troppo basso), la stazione di lavoro si arresta e un messaggio suggerisce di ricontrollare attentamente la causa dell’errore. Seguire i passaggi dettagliati in ogni messaggio prima di continuare. 38 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Se non è stato possibile leggere alcuni codici a barre, appare la finestra di dialogo seguente: I campioni non identificati sono evidenziati in rosso. Dopo aver corretto la causa dell’errore di lettura dei codici a barre, fare clic su Scan Again (Nuova scansione) per eseguire nuovamente la scansione di tutti i codici a barre oppure su Scan Failed Positions Manually (Scansione manuale posizioni non riuscite) per eseguire solo la scansione dei codici a barre dei campioni non identificati. Se si seleziona Scan Failed Positions Manually, appare la finestra di dialogo seguente: Eseguire la scansione di ogni codice a barre utilizzando il lettore di codici a barre manuale oppure digitare il numero di ogni codice a barre. Quando si digitano i numeri dei codici a barre, ogni codice a barre deve essere inserito due volte. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 39 Quando il protocollo ha superato il controllo di caricamento, completerà il processo di purificazione senza interruzioni. 10. Il sistema BioRobot MDx DSP genera file di risultati. Una volta completata l’esecuzione, sono generati due file di risultati che riassumono tutti i dati rilevanti per l’esecuzione. I file sono salvati automaticamente in formato .rtf e .csv nella directory predefinita C:\Programmi\QIAsoft MDx DSP\UserData\ReportData. Il nome del file è il codice a barre di identificazione delle microprovette di eluizione CL (EMT) elaborate. Inoltre, i codici a barre sono salvati con un nome file specifico dell’utente se è stata scelta l’opzione all’inizio del protocollo: tali file sono salvati nella stessa directory predefinita. Il contenuto dei 4 file è lo stesso (vedere l’esempio a pagina 61 e la Tabella 14 a pagina 62). 11. Pulire la stazione di lavoro BioRobot MDx. Il software mostra una serie di messaggi che guidano l’utente attraverso i passaggi della procedura di pulizia (vedere pagina 41). 40 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Appendice A: messaggi visualizzati Di seguito sono elencati i messaggi visualizzati dal protocollo del software durante l’impostazione e la pulizia del tavolo di lavoro (passaggi 9 e 11). I numeri dei messaggi elencati di seguito corrispondono ai numeri dei messaggi visualizzati dal software. Nota: alcuni dei messaggi elencati di seguito potrebbero non apparire durante l’esecuzione del protocollo (per es., messaggi di errore). Tipo di messaggio Testo del messaggio Azioni/commenti Errore 1. You scanned or entered the Assicurarsi di utilizzare il kit wrong Q-Card bar code (È stata QIAamp DSP 96 Virus MDx. eseguita la scansione o è stato inserito il codice a barre Q-Card non corretto). The protocol can only be stopped (Il protocollo sarà interrotto). Errore 2. The QIAGEN kit has exceeded È stato utilizzato un kit the expiration date (Il kit QIAamp DSP 96 Virus QIAGEN ha superato la data di MDx scaduto. scadenza). The protocol can only be stopped (Il protocollo sarà interrotto). Guida 3. Do you want to enter a specific run ID? (Si desidera inserire un ID esecuzione specifico?) A result file will be generated with the name of the entered run ID (Sarà generato un file di risultati con il nome dell’ID esecuzione inserito). Guida 4. Please enter a specific run ID (Inserire un ID esecuzione specifico). Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 41 Tipo di messaggio Testo del messaggio Errore 5. You did not enter a specific run ID (Non è stato inserito un ID esecuzione specifico). No separate result files with your run ID will be generated (Non saranno generati file di risultati separati con l’ID esecuzione). Guida 6. Disconnect the tubing of the system liquid container and remove the lid (Scollegare i tubi del contenitore del liquido di sistema e rimuovere il coperchio). Refill the container with deionized water (Riempire il contenitore con acqua deionizzata). Close the lid and reconnect the tubing (Chiudere il coperchio e ricollegare i tubi). Errore 7. The system liquid container sensor is defective or incorrectly adjusted (Il sensore del contenitore del liquido di sistema è difettoso o non regolato correttamente). The protocol can only be stopped (Il protocollo sarà interrotto). Guida 8. Disconnect the tubing of the waste container and remove the lid (Scollegare i tubi del contenitore dei rifiuti e rimuovere il coperchio). Empty the container (Svuotare il contenitore). Close the lid and reconnect the tubing (Chiudere il coperchio e ricollegare i tubi). 42 Azioni/commenti Se si desiderava inserire un ID esecuzione specifico, interrompere il protocollo e riavviarlo. Riprovare con un contenitore di liquido di sistema pieno o rivolgersi al servizio di assistenza QIAGEN. Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Tipo di messaggio Testo del messaggio Errore 9. The waste container sensor is defective or incorrectly adjusted (Il sensore del contenitore dei rifiuti è difettoso o non regolato correttamente). The protocol can only be stopped (Il protocollo sarà interrotto). Guida 10. Disconnect the tubing of the vacuum trap and the condensate trap (Scollegare i tubi della trappola del vuoto e della trappola di condensa). Remove the lid of the vacuum trap (Rimuovere il coperchio della trappola del vuoto). Empty both traps (Svuotare entrambe le trappole). Close the vacuum trap lid and reconnect the tubing (Chiudere il coperchio della trappola del vuoto e ricollegare i tubi). Errore 11. The vacuum trap sensor is defective or incorrectly adjusted (Il sensore della trappola del vuoto è difettoso o non regolato correttamente). The protocol can only be stopped (Il protocollo sarà interrotto). Guida 12. Attach a new tip-disposal bag (Inserire una nuova borsa di smaltimento dei puntali). Guida 13. Do you want to be guided by the wizard to set up the worktable? (Usare la procedura guidata per impostare il tavolo di lavoro?) Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 Azioni/commenti Riprovare con un contenitore di rifiuti vuoto o rivolgersi al servizio di assistenza QIAGEN. Riprovare con una trappola del vuoto vuota o rivolgersi al servizio di assistenza QIAGEN. 43 Tipo di messaggio Testo del messaggio Guida 14. Reconstitute wash buffer 1 (AW1) and wash buffer 2 (AW2) according to the instruction on the bottle label (Ricostituire il tampone di lavaggio 1 (AW1) e il tampone di lavaggio 2 (AW2) seguendo le istruzioni sull’etichetta del flacone). Fill the ethanol bottle (BOT) with 350 ml 100% ethanol, and add 350 μl reconstituted wash buffer 2 (AW2) (for a final 1/1000 dilution of AW2) (Riempire il flacone di etanolo (BOT) con 350 ml etanolo al 100% e aggiungere 350 μl di tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituito (per una diluizione finale 1/1000 di AW2)). Guida 15. Place open bottles of wash buffer 1 (AW1), wash buffer 2 (AW2), and ethanol into compatible slots in the reagent carousel (Posizionare i flaconi aperti di tampone di lavaggio 1 (AW1), tampone di lavaggio 2 (AW2) ed etanolo in alloggiamenti compatibili nel carosello dei reagenti). Ensure that the bar codes face outward (Assicurarsi che i codici a barre siano rivolti verso l’esterno). Place the system liquid bottle filled with a minimum of 700 ml deionized water into the reagent carousel (Posizionare il flacone di liquido di sistema riempito con almeno 700 ml di acqua deionizzata nel carosello dei reagenti). 44 Azioni/commenti Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Tipo di messaggio Testo del messaggio Guida 16. Place the black multiwell-plate holder onto the worktable (Posizionare il portapiastra a pozzetti multipli nero sul tavolo di lavoro). Place the black channeling adapter into this holder (Posizionare l’adattare di canalizzazione nero in questo contenitore). Guida 17. Place a silver multiwell-plate holder onto the worktable (Posizionare un portapiastra a pozzetti multipli argentato sul tavolo di lavoro). Place a QIAamp 96 plate into this holder (Posizionare la piastra QIAamp 96 in questo contenitore). Make sure well A1 is orientated to the left and the bar code faces toward the right (Assicurarsi che il pozzetto A1 sia orientato verso sinistra e che il codice a barre sia rivolto a destra). Guida 18. Place a new S-Block onto the heat transfer adapter in the cooling and heating system (Posizionare un S-Block nuovo sull’adattatore di trasferimento del calore nel sistema di riscaldamento e raffreddamento). Make sure well A1 is orientated to the left (Assicurarsi che il pozzetto A1 sia orientato verso sinistra). Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 Azioni/commenti 45 Tipo di messaggio Testo del messaggio Guida 19. Place the vacuum manifold lid onto the slot that is to the right of the vacuum manifold base (Posizionare il coperchio dell’apparato da vuoto sull’alloggiamento a destra della base dell’apparato stesso). Place the vacuum manifold top above the vacuum manifold lid (Posizionare il tappo dell’apparato da vuoto sopra il coperchio dell’apparato stesso). Guida 20. Pull the tip-tray drawer outwards (Aprire il cassetto del vassoio dei puntali tirando verso l’esterno). Place red tip trays with 1100 μl disposable tips into the red tiptray holders 1, 2, 4–8 (Posizionare i vassoi dei puntali rossi con 1100 μl di puntali monouso negli appositi supporti per puntali rossi 1, 2, 4–8). Guida 21. Reconstitute QIAGEN Protease (QP) as described in the QIAGEN kit handbook (Ricostituire la proteasi QIAGEN (QP) come descritto nel manuale del kit QIAGEN). Mix carefully (Miscelare con cura). Place the open bottle containing a minimum of 6 ml reconstituted QIAGEN Protease (QP) into the reagent holder for 1 bottle (QP) (Posizionare il flacone aperto contenente un minimo di 6 ml di proteasi QIAGEN (QP) ricostituita nel portareagente per 1 flacone (QP)). 46 Azioni/commenti Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Tipo di messaggio Testo del messaggio Guida 22. Into the reagent holder for 2 troughs, load 2 disposable troughs (DT) (Nel portareagente per 2 recipienti, caricare 2 recipienti monouso (DT)). Place the reagent holder into MP Slot 2 (Posizionare il portareagente nella fessura 2 MP). Ensure AL is on the left and EtOH is on the right (Assicurarsi che l’AL sia a sinistra e che l’EtOH sia a destra). Guida 23. Prepare a bottle of lysis buffer (AL) with carrier RNA and internal control (refer to the QIAGEN kit handbook) (Preparare un flacone di tampone di lisi (AL) con RNA carrier e controllo interno (fare riferimento al manuale del kit QIAGEN)). Carefully transfer the contents of the bottle into the trough at position AL in order to avoid creating large air bubbles (Trasferire con attenzione i contenuti del flacone nel recipiente nella posizione AL al fine di evitare la creazione di grandi bolle d’aria). Guida 24. Place 8 new microtubes each containing 2 ml elution buffer (AVE) into the reagent holder for microtubes and trough (position AVE) (Posizionare 8 microprovette nuove, ognuna contenente 2 ml di tampone di eluizione (AVE) nel portareagente per microprovette e recipiente (posizione AVE)). Remove the caps from the tubes (Rimuovere i tappi dalle provette). Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 Azioni/commenti 47 Tipo di messaggio Testo del messaggio Guida 25. Place 4 microtubes each containing 1.4 ml elution fluid (TOPE) into the reagent holder for microtubes and trough (position TOPE) (Posizionare 4 microprovette nuove, ognuna contenente 1,4 ml di fluido di eluizione (TOPE) nel portareagente per microprovette e recipiente (posizione TOPE)). Remove the caps from the tubes (Rimuovere i tappi dalle provette). Guida 26. Place an Elution Microtubes CL (EMT) onto the elution microtube adapter (Posizionare le microprovette di eluizione CL (EMT) sull’adattatore di microprovette di eluizione). Place the assembly onto the reagent holder for microtubes and trough (Posizionare l’insieme sul portareagente per microprovette e recipiente). Make sure the bar code faces toward the right (Assicurarsi che il codice a barre sia rivolto a destra). Guida 27. Attention (Attenzione): The robotic arm moves to the right if you click “Next”! (il braccio robotico si muove verso destra se si fa clic su “Next” [Successivo].) Guida 28. Remove the sample protection shield (Rimuovere lo schermo protettivo dei campioni). Place open tubes containing samples into the tube holders (Posizionare le provette aperte contenenti i campioni nei portaprovette). 48 Azioni/commenti Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Tipo di messaggio Testo del messaggio Azioni/commenti Guida 29. Load all 12 tube holders into the sample tracking system (Caricare tutti i 12 portaprovette nel sistema di monitoraggio dei campioni). Ensure the sample bar codes face towards the left (Assicurarsi che i codici a barre dei campioni siano rivolti verso sinistra). Replace the sample protection shield (Sostituire lo schermo protettivo dei campioni). Guida 30. Summary table for worktable setup (Tabella riassuntiva dell’impostazione del tavolo di lavoro). Use the slider to move the robotic arm for easy access to all positions (Utilizzare il cursore per spostare il braccio robotico per un facile accesso a tutte le posizioni). Guida 31. Close the worktable hood (Chiudere il coperchio del tavolo di lavoro). Click “Continue” to start the load check (Fare clic su “Continue” [Continua] per avviare il controllo di caricamento). Errore 32. The worktable hood is not closed Seguire le istruzioni sullo (Il coperchio del tavolo di lavoro schermo. non è chiuso). Slide the worktable hood down until it clicks (Far scorrere il coperchio del tavolo di lavoro fino a sentire uno scatto). Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 49 Tipo di messaggio Testo del messaggio Azioni/commenti Errore 33. The worktable hood is not closed or the worktable hood lock is defective (Il coperchio del tavolo di lavoro non è chiuso o la chiusura del coperchio è difettosa). The protocol can only be stopped (Il protocollo sarà interrotto). Errore 34. The reagent carousel door is not Seguire le istruzioni sullo closed (Lo sportello del carosello schermo. dei reagenti non è chiuso). Close the reagent carousel door (Chiudere lo sportello del carosello dei reagenti). Errore 35. The reagent carousel door is not closed or the reagent carousel door lock is defective (Lo sportello del carosello dei reagenti non è chiuso o la chiusura dello sportello è difettosa). The protocol can only be stopped (Il protocollo sarà interrotto). Riprovare con lo sportello del rotore chiuso o rivolgersi al servizio di assistenza QIAGEN. Errore 36. The chosen protocol does not match the QIAamp 96 plate used (Il protocollo scelto non corrisponde alla piastra QIAamp 96 utilizzata). The protocol can only be stopped (Il protocollo sarà interrotto). Assicurarsi di utilizzare il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx e di scegliere il protocollo corretto. Errore 37. Place the system liquid bottle Seguire le istruzioni sullo filled with a minimum of 700 ml schermo. deionized water into the reagent carousel (Posizionare il flacone di liquido di sistema riempito con almeno 700 ml di acqua deionizzata nel carosello dei reagenti). 50 Riprovare con il coperchio del tavolo di lavoro chiuso o rivolgersi al servizio di assistenza QIAGEN. Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Tipo di messaggio Testo del messaggio Azioni/commenti Errore 38. Fill the ethanol bottle (BOT) with 350 ml ethanol (96–100%), and add 350 μl reconstituted wash buffer 2 (AW2) (for a final 1/1000 dilution of AW2) (Riempire il flacone di etanolo (BOT) con 350 ml etanolo (96–100%) e aggiungere 350 μl di tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituito (per una diluizione finale 1/1000 di AW2)). Seguire le istruzioni sullo schermo. Errore 39. Place a tip tray containing 1100 μl disposable tips into tip-tray holder 1 (Posizionare un vassoio per puntali contenente 1100 μl di puntali monouso nel portavassoio 1). Seguire le istruzioni sullo schermo. Errore 40. Place a tip tray containing 1100 μl disposable tips into tip-tray holder 2 (Posizionare un vassoio per puntali contenente 1100 μl di puntali monouso nel portavassoio 2). Seguire le istruzioni sullo schermo. Errore 41. Place a tip tray containing 1100 μl disposable tips into tip-tray holder 4 (Posizionare un vassoio per puntali contenente 1100 μl di puntali monouso nel portavassoio 4). Seguire le istruzioni sullo schermo. Errore 42. Place a tip tray containing 1100 μl disposable tips into tip-tray holder 5 (Posizionare un vassoio per puntali contenente 1100 μl di puntali monouso nel portavassoio 5). Seguire le istruzioni sullo schermo. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 51 Tipo di messaggio Testo del messaggio Azioni/commenti Errore 43. Place a tip tray containing 1100 μl disposable tips into tip-tray holder 6 (Posizionare un vassoio per puntali contenente 1100 μl di puntali monouso nel portavassoio 6). Seguire le istruzioni sullo schermo. Errore 44. Place a tip tray containing 1100 μl disposable tips into tip-tray holder 7 (Posizionare un vassoio per puntali contenente 1100 μl di puntali monouso nel portavassoio 7). Seguire le istruzioni sullo schermo. Errore 45. Place a tip tray containing 1100 μl disposable tips into tip-tray holder 8 (Posizionare un vassoio per puntali contenente 1100 μl di puntali monouso nel portavassoio 8). Seguire le istruzioni sullo schermo. Errore 46. Place an Elution Microtubes CL (EMT) with lid onto the elution microtube adapter (Posizionare una microprovetta di eluizione CL (EMT) con coperchio sull’adattatore per microprovette di eluizione). Then place the assembly onto MP Slot 3 (Posizionare quindi l’insieme nella fessura 3 MP). Seguire le istruzioni sullo schermo. Errore 47. Make sure the bar code of the Elution Microtubes CL (EMT) faces toward the right (Assicurarsi che il codice a barre delle microprovette di eluizione CL (EMT) sia rivolto verso destra). Seguire le istruzioni sullo schermo. 52 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Tipo di messaggio Testo del messaggio Azioni/commenti Errore 48. Fill the wash buffer 1 (AW1) Seguire le istruzioni sullo bottle in the reagent carousel with schermo. 164 ml buffer AW1 (Riempire il flacone del tampone di lavaggio 1 (AW1) nel carosello dei reagenti con 164 ml di tampone AW1). Place the bottle back into the reagent carousel and ensure that the bar code faces outward (Riposizionare il flacone nel carosello dei reagenti con il codice a barre rivolto verso l’esterno). Close the reagent carousel door properly (Chiudere correttamente lo sportello del carosello dei reagenti). Errore 49. Fill the wash buffer 2 (AW2) Seguire le istruzioni sullo bottle in the reagent carousel with schermo. 191 ml buffer AW2 (Riempire il flacone del tampone di lavaggio 2 (AW2) nel carosello dei reagenti con 191 ml di tampone AW2). Place the bottle back into the reagent carousel and ensure that the bar code faces outward (Riposizionare il flacone nel carosello dei reagenti con il codice a barre rivolto verso l’esterno). Close the reagent carousel door properly (Chiudere correttamente lo sportello del carosello dei reagenti). Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 53 Tipo di messaggio Testo del messaggio Azioni/commenti Errore 50. Place an empty disposable trough (DT) into the reagent holder for 2 troughs (position EtOH) (Posizionare un recipiente monouso (DT) vuoto nel portareagente per 2 recipienti (posizione EtOH)). Fill the trough with 10 ml ethanol (Riempire il recipiente con 10 ml di etanolo). Seguire le istruzioni sullo schermo. Errore 51. The cooling and heating system failed to reach the required temperature (Il sistema di riscaldamento e raffredamento non è riuscito a raggiungere la temperatura necessaria). The protocol can only be stopped (Il protocollo sarà interrotto). Riprovare o rivolgersi al servizio di assistenza QIAGEN. Errore 52. The high-speed dispensing system or the liquid detection system is defective and/or not adjusted within specifications (Il sistema di erogazione ad alta velocità o il sistema di rilevamento del liquido è difettoso e/o non regolato secondo le specifiche). The protocol can only be stopped (Il protocollo sarà interrotto). Riprovare o rivolgersi al servizio di assistenza QIAGEN. Errore 53. The vacuum manifold failed to reach the required temperature (L’apparato da vuoto non è riuscito a raggiungere la temperatura necessaria). The protocol can only be stopped (Il protocollo sarà interrotto). Riprovare o rivolgersi al servizio di assistenza QIAGEN. 54 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Tipo di messaggio Testo del messaggio Errore 54. The vacuum manifold failed to reach the required pressure (L’apparato da vuoto non è riuscito a raggiungere la pressione necessaria). The protocol can only be stopped (Il protocollo sarà interrotto). Guida 55. Sample preparation ended at <Time (hh:mm)> (La preparazione dei campioni è terminata alle <ora (hh:mm)>). Remove the Elution Microtubes CL (EMT) containing eluates from the reagent holder for microtubes and trough (Rimuovere le microprovette di eluizione CL (EMT) contenenti eluati dal portareagente per microprovette e recipiente). Guida 56. Discard the AVE and TOPE microtubes (Smaltire le microprovette AVE e TOPE). Discard the QP bottle (Smaltire il flacone QP). Guida 57. Discard the EtOH and AL troughs (Smaltire i recipienti EtOH e AL). Discard the tip trays (Smaltire i vassoi dei puntali). Discard the S-Block (Smaltire l’S-Block). Discard the QIAamp 96 plate (Smaltire la piastra QIAamp 96). Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 Azioni/commenti Riprovare o rivolgersi al servizio di assistenza QIAGEN. 55 Tipo di messaggio Testo del messaggio Guida 58. Remove the channeling adapter, both multiwell-plate holders (black and silver), and the elution microtube adapter (blue) (Rimuovere l’adattatore di canalizzazione, entrambi i portapiastra a pozzetti multipli (nero e argentato) e l’adattatore per microprovette di eluizione (blu)). Submerge them all in disinfectant (Immergerli in disinfettante). Submerge the adapters/holders in deionized water (Immergere gli adattatori/recipienti in acqua deionizzata). Dry with a lint free paper towel (Asciugare con un panno di carta che non lasci pelucchi). Guida 59. Remove the system liquid bottle from the reagent carousel and pour system liquid over the heating plate in the vacuum manifold base (Rimuovere il flacone del liquido di sistema dal carosello dei reagenti e versare il liquido di sistema sulla piastra di riscaldamento nella base dell’apparato da vuoto). Ensure that the plate is completely covered with system liquid (Assicurarsi che la piastra sia coperta completamente con il liquido di sistema). 56 Azioni/commenti Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Tipo di messaggio Testo del messaggio Guida 60. Click “Continue” to remove system liquid from the vacuum manifold base (Fare clic su “Continue” [Continua] per rimuovere il liquido di sistema dalla base dell’apparato da vuoto). While liquid is leaving the vacuum manifold base, continue to empty the system liquid bottle over the heating plate (Mentre il liquido sta uscendo dalla base dell’apparato da vuoto, continuare a svuotare il flacone del liquido di sistema sulla piastra di riscaldamento). Guida 61. Replace the caps on the bottles in the reagent carousel if no subsequent protocol run will be performed (Riposizionare i tappi sui flaconi nel carosello dei reagenti se non sarà eseguito un altro protocollo). Guida 62. Attention (Attenzione): The robotic arm moves to the right if you click “Continue” (Il braccio robotico si muove verso destra se si fa clic su “Continue” [Continua]). Guida 63. Discard the sample tubes (Smaltire le provette dei campioni). Guida 64. Empty the tip-disposal bag (Svuotare la borsa di smaltimento dei puntali). Guida 65. Protocol finished! (Protocollo concluso.) The result files are saved in the folder <name of folder> (I file dei risultati sono salvati nella cartella <nome della cartella>). Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 Azioni/commenti 57 Tipo di messaggio Testo del messaggio Azioni/commenti Errore 66. Wash buffer 1 (AW1) has expired (Il tampone di lavaggio 1 (AW1) è scaduto). Remove the AW1 bottle from the reagent carousel and replace it with a new one (Rimuovere il flacone AW1 dal carosello dei reagenti e sostituirlo con un flacone nuovo). Ensure that the new bottle is open and the bar code faces outward (Assicurarsi che il nuovo flacone sia aperto e che il codice a barre sia rivolto verso l’esterno). Close the reagent carousel door (Chiudere lo sportello del carosello dei reagenti). Seguire le istruzioni sullo schermo. Errore 67. Wash buffer 2 (AW2) has expired (Il tampone di lavaggio 2 (AW2) è scaduto). Remove the AW2 bottle from the reagent carousel and replace it with a new one (Rimuovere il flacone AW2 dal carosello dei reagenti e sostituirlo con un flacone nuovo). Ensure that the new bottle is open and the bar code faces outward (Assicurarsi che il nuovo flacone sia aperto e che il codice a barre sia rivolto verso l’esterno). Close the reagent carousel door (Chiudere lo sportello del carosello dei reagenti). Seguire le istruzioni sullo schermo. 58 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Tipo di messaggio Testo del messaggio Guida 68. Reconstitute wash buffer 2 (AW2) according to the instruction on the bottle label (Ricostituire il tampone di lavaggio 2 (AW2) seguendo le istruzioni sull’etichetta del flacone). Fill the ethanol bottle (BOT) with a minimum of 350 ml ethanol (96–100%), and add 350 μl reconstituted wash buffer 2 (AW2) (for a final 1/1000 dilution of AW2) (Riempire il flacone di etanolo (BOT) con un minimo di 350 ml di etanolo (96–100%) e aggiungere 350 μl di tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituito (per una diluizione finale 1/1000 di AW2)). Guida 69. Place open bottles of wash buffer 2 (AW2), and ethanol into compatible slots in the reagent carousel (Posizionare i flaconi aperti di tampone di lavaggio 2 (AW2) ed etanolo in alloggiamenti compatibili nel carosello dei reagenti). Ensure that the bar codes face outward (Assicurarsi che i codici a barre siano rivolti verso l’esterno). Place the system liquid bottle filled with a minimum of 700 ml deionized water into the reagent carousel (Posizionare il flacone di liquido di sistema riempito con almeno 700 ml di acqua deionizzata nel carosello dei reagenti). Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 Azioni/commenti 59 Tipo di messaggio Errore 60 Testo del messaggio Azioni/commenti 70. There are not enough 1100 μl disposable tips for this protocol run (Non ci sono puntali monouso da 1100 μl sufficienti per l’esecuzione di questo protocollo). Place red tip trays containing 1100 μl tips into red tip-tray holders 1, 2, 4–8 (Posizionare i vassoi dei puntali rossi con puntali da 1100 μl nei supporti 1, 2, 4–8). Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Appendice B: file dei risultati* Operatore: Data: AAAA MM GG Ora d’inizio: HH:MM:SS Ora dell’esecuzione: Nome del kit: Numero di campioni elaborati: Codice a barre di microprovette di eluizione CL (EMT): ID esecuzione specificato dall’utente: Codice a barre Q-Card: Numero di catalogo del kit: Numero di lotto del kit: Data di scadenza del kit: AAAA MM GG ID BioRobot MDx: Versione QIAsoft MDx DSP: Versione protocollo: Codice a barre selezionato dal supervisore: Predefinito/Codice a barre univoco/ Codice a barre non univoco† Nome file registro messaggi: Nome file registro referti: Codici a barre inseriti manualmente: nessun codice a barre inserito manualmente† Controllo tecnico del processo: RIUSCITO/NON RIUSCITO† Manutenzione: gli interventi di manutenzione richiesti non sono stati eseguiti prima dell’esecuzione del protocollo/Manutenzione eseguita† Codice a barre e tabella dei risultati: Posizione Codice a barre Risultato (1 = valido, 0 = non valido) … … A1 B1 C1 D1 … E12 F12 G12 H12 * I campi in questo file di risultati sono vuoti. Il sistema operativo QIAsoft MDx DSP riempie questi campi alla fine dell’esecuzione del protocollo. † Il testo che appare in questo campo dipende da ciò che succede durante l’esecuzione del protocollo. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 61 Tabella 14. Spiegazione degli errori nel file dei risultati Errore Possibile causa Campione indicato come non valido (invalid) Durante l’aspirazione del campione dalla provetta, non è stato possibile leggere il codice a barre. Non è stato trasferito alcun campione all’S-Block. Durante l’aspirazione del campione dalla provetta, non è stato possibile rilevare alcun campione. Durante l’aspirazione del campione dalla provetta, è stato rilevato un grumo. I crioprecipitati hanno impedito il trasferimento del volume corretto di campione dalla provetta all’S-Block. Dopo il trasferimento del campione, non è stato rilevato campione sufficiente nell’S-Block. La riga nella colonna “Result” (Risultato) è vuota 62 Si è verificato un errore di elaborazione durante la preparazione del campioni. Il protocollo è stato interrotto. Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Appendice C: calcolo della quantità di controllo interno Per monitorare l’efficienza della preparazione dei campioni e del test downstream, al tampone di lisi (AL) viene aggiunto un controllo interno, fornito con il test diagnostico downstream. Per calcolare la quantità del controllo interno necessario nei protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx, deve essere considerata la quantità di tampone di lisi (AL) e di volume dell’eluato. Determinare quanto controllo interno ci sarà nelle reazioni downstream Per determinare il volume di controllo interno che sarà presente nel test successivo, utilizzare la formula: ICRXN = ICAL x ALSAM x ELRXN (ALTOT + ICAL) x ELSAM dove: ICRXN = Volume di controllo interno per reazione downstream ICAL = Volume di controllo interno aggiunto al tampone di lisi (AL) ALSAM = Volume di tampone di lisi (AL) per campione ELRXN = Volume di eluato per reazione downstream ALTOT = Volume totale di tampone di lisi (AL) utilizzato nel protocollo ELSAM = Volume di eluato per campione Come esempio, l’Utente 1 ha aggiunto 300 μl di soluzione di controllo interno (ICAL) a un tampone di lisi da 33 ml (ALTOT). Utilizzando la procedura standard, ci sono 275 μl di tampone di lisi per campione (ALSAM) e il volume di eluizione è di 83 μl (ELSAM). L’utente 1 utilizza 50 μl di eluato per reazione successiva (ELRXN). Il volume della soluzione di controllo interno in ogni reazione successiva (ICRXN) è: ICRXN = 300 μl x 275 μl x 50 μl (33.000 μl + 300 μl) x 83 μl = 1,49 μl Le reazioni downstream finali conterranno 1,49 μl di soluzione di controllo interno per reazione. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 63 Determinazione della quantità di soluzione di controllo interno da aggiungere prima di iniziare In alternativa, se si conosce la quantità di controllo interno che si desidera sia presente nel test downstream (ICRXN), occorre determinare la quantità da aggiungere al tampone di lisi prima di iniziare la purificazione (ICAL). Per calcolare tale valore, utilizzare la formula seguente: ICAL = ICRXN x ALTOT x ELSAM (ALSAM x ELRXN) – (ICRXN x ELSAM) Come esempio, si supponga che l’utente 2 stia lavorando con un test diagnostico che è convalidato per l’utilizzo con 2,0 μl di soluzione di controllo interno per reazione (ICRXN) e 40 μl di eluato per reazione (ELRXN). L’utente 2 segue un protocollo con 1000 μl di tampone di lisi per campione (ALSAM) e un volume di eluizione di 120 μl (ELSAM). La quantità di soluzione di controllo interno (ICAL) che l’utente 2 deve aggiungere al tampone di lisi di 33,0 ml (ALTOT) è: ICAL = 2,0 μl x 33.000 μl x 120 μl (1.000 μl x 40 μl) – (2,0 μl x 120 μl) = 199 μl L’utente 2 deve aggiungere 199 μl di soluzione di controllo interno a un tampone di lisi da 33 ml (AL) prima della purificazione. 64 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Pagina lasciata vuota intenzionalmente. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 65 Distributori QIAGEN Arabia Saudita Abdulla Fouad Co. Ltd. Tel: (03) 8324400 Fax: (03) 8346174 E-mail: [email protected] Danimarca VWR International A/S Tel: 43 86 87 88 Fax: 43 86 87 90 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.vwr.com Argentina Tecnolab S.A. Tel: (011) 4555 0010 Fax: (011) 4553 3331 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.tecnolab.com.ar Egitto Clinilab Tel: Fax: E-mail: Austria VWR International GmbH Tel: (01) 576 00 0 Fax: (01) 576 00 600 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.vwr.com Brasile Uniscience do Brasil Tel: 011 3622 2320 Fax: 011 3622 2323 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.uniscience.com Cile Biosonda SA Tel: 562 209 6770 Fax: 562 274 5462 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.biosonda.cl Cina Gene Company Limited Tel: (852)2896-6283 Fax: (852)2515-9371 E-mail: Hong Kong: [email protected] Pechino: [email protected] Shanghai: [email protected] Chengdu: [email protected] Guangzhou: [email protected] Cipro Scientronics Ltd Tel: 02-357 22 765416 Fax: 02-357 22 764614 E-mail: [email protected] Corea LRS Laboratories, Inc. Tel: (02) 924-86 97 Fax: (02) 924-86 96 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.lrslab.co.kr Croazia INEL Medicinska Tehnika d.o.o. Tel: (01) 2984-898 Fax: (01) 6520-966 E-mail: [email protected] 66 Nuova Zelanda Biolab Ltd Tel: (09) 980 6700 o 0800 933 966 Fax: (09) 980 6788 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.biolabgroup.com/nzl 52 57 212 52 57 210 [email protected] Polonia Syngen Biotech Sp.z.o.o. Tel: (071) 798 58 50 - 52 Fax: (071) 798 58 53 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.syngen.pl Estonia PEAI-Est OÜ Tel: (051) 65 830 Fax: (07) 383 360 E-mail: [email protected] Portogallo IZASA PORTUGAL, LDA Tel: (21) 424 7312 Fax: (21) 417 2674 E-mail: [email protected] Finlandia VWR International Oy Tel: (09) 804 551 Fax: (09) 8045 5200 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.vwr.com Repubblica Ceca BIO-CONSULT spol. s.r.o. Tel/Fax: (420) 2 417 29 792 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.bioconsult.cz Grecia BioAnalytica S.A. Tel: (210)-640 03 18 Fax: (210)-646 27 48 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.bioanalytica.gr India Genetix Tel: o Fax: E-mail: Tailandia Theera Trading Co. Ltd. Tel: (02) 412-5672 Fax: (02) 412-3244 E-mail: [email protected] Turchia Medek Medikal Ürünler ve Saglik Hizmetleri A. S. Tel: (216) 302 15 80 Fax: (216) 302 15 88 E-mail: [email protected] Ungheria Kasztel-Med Co. Ltd. Tel: (01) 385 3887 Fax: (01) 381 0695 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.kasztel.hu Tutti gli altri paesi QIAGEN GmbH, Germania Repubblica Slovacca BIO-CONSULT Slovakia spol. s.r.o. Tel/Fax: (02) 5022 1336 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.bioconsult.cz (011)-2542 1714 (011)-2515 9346 (011)-2546 7637 [email protected] Israele Westburg (Israel) Ltd. Tel: 08-6900655 o 1-800 20 22 20 (toll free) Fax: 08-6900650 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.westburg.co.il Singapore Research Biolabs Pte Ltd Tel: 6777 5366 Fax: 6778 5177 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.researchbiolabs.com Slovenia MEDILINE d.o.o. Tel: (01) 830-80-40 Fax: (01) 830-80-70 o (01) 830-80-63 E-mail: [email protected] Malesia RESEARCH BIOLABS SDN. BHD. Tel: (603)-8070 3101 Fax: (603)-8070 5101 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.researchbiolabs.com Spagna IZASA, S.A. Tel: (93) 902.20.30.90 Fax: (93) 902.22.33.66 E-mail: [email protected] Messico Quimica Valaner S.A. de C.V. Tel: (55) 55 25 57 25 Fax: (55) 55 25 56 25 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.valaner.com Sud Africa Southern Cross Biotechnology (Pty) Ltd Tel: (021) 671 5166 Fax: (021) 671 7734 E-mail: [email protected] Norvegia VWR International AS Tel: 02 29 0 Fax: 22 90 00 40 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.vwr.com Taiwan TAIGEN Bioscience Corporation Tel: (02) 2880 2913 Fax: (02) 2880 2916 E-mail: [email protected] Svezia VWR International AB Tel: (08) 621 34 00 Fax: (08) 760 45 20 E-mail: [email protected] Pagina Web: www.vwr.com Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004 Australia QIAGEN Pty Ltd PO Box 641 DONCASTER VIC 3108 Ordini 03-9840-9800 Fax 03-9840-9888 Ass. tecnica 1-800-243-066 Belgio QIAGEN Benelux B.V. Spoorstraat 50 5911 KJ Venlo The Netherlands Ordini 0800-79612 Fax 0800-79611 Ass. tecnica 0800-79556 Canada QIAGEN Inc. 2800 Argentia Road Unit 7 Mississauga Ontario L5N 8L2 Ordini 800-572-9613 Fax 800-713-5951 Ass. tecnica 800-DNA-PREP (800-362-7737) Francia QIAGEN S.A. 3 avenue du Canada LP 809 91974 COURTABOEUF CEDEX Ordini 01-60-920-920 Fax 01-60-920-925 Ass. tecnica 01-60-920-930 Germania QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse 1 40724 Hilden Ordini 02103-29-12000 Fax 02103-29-22000 Ass. tecnica 02103-29-12400 Giappone QIAGEN K.K. Forefront Tower II 13-1, Kachidoki 3 Chome Chuo-ku, Tokyo 104-0054 Telefono 03-5547-0811 Fax 03-5547-0818 Ass. tecnica 03-5547-0811 Italia QIAGEN S.p.A. Via Grosio, 10/10 20151 Milano Ordini 02-33430411 Fax 02-33430426 Ass. tecnica 02-33430414 Lussemburgo QIAGEN Benelux B.V. Spoorstraat 50 5911 KJ Venlo The Netherlands Ordini 8002-2076 Fax 8002-2073 Ass. tecnica 8002-2067 Olanda QIAGEN Benelux B.V. Spoorstraat 50 5911 KJ Venlo Ordini 0800-0229592 Fax 0800-0229593 Ass. tecnica 0800-0229602 Svizzera QIAGEN AG Garstligweg 8 8634 Hombrechtikon Ordini 055-254-22-11 Fax 055-254-22-13 Ass. tecnica 055-254-22-12 Regno Unito e Irlanda QIAGEN Ltd. QIAGEN House Fleming Way Crawley West Sussex, RH10 9NQ Ordini 01293-422-911 Fax 01293-422-922 Ass. tecnica 01293-422-999 USA QIAGEN Inc. 27220 Turnberry Lane Suite 200 Valencia CA 91355 Ordini 800-426-8157 Fax 800-718-2056 Ass. tecnica 800-DNA-PREP (800-362-7737) WWW.QIAGEN.COM 1027740IT 10/2004
