Ottobre 2004
Manuale per il kit QIAamp®
DSP 96 Virus MDx
1152
Il sistema BioRobot® MDx DSP è un sistema generico che si avvale
della tecnologia QIAamp per l’isolamento e la purificazione in
automatico degli acidi nucleici virali da campioni umani di
plasma o siero per analisi diagnostiche in vitro.
Per uso diagnostico in vitro
61762
1027740IT 10/2004
QIAGEN GmbH, D-40724 Hilden
Tel: +49-2103-29-0
WWW.QIAGEN.COM
Marchi: QIAGEN®, QIAamp®, BioRobot® (QIAGEN Group); AMPLICOR®, COBAS® (Roche Molecular Systems, Inc., concesso in licenza a Roche
Diagnostic Systems, Inc.); BD Falcon™, BD PPT™, BD Vacutainer®, (Becton, Dickinson and Company); CryoTube® (Nalge Nunc International); LCx®
(Abbott Laboratories); MONITOR®, TaqMan® (Roche Group); Monovette® (Sarstedt AG & Co.); Nalgene® (Nalge Corp.); Vacuette® (C.A. Greiner &
Söhne GmbH).
Il processo PCR è protetto dai brevetti USA 4,683,195 e 4,683,202 e dai rispettivi equivalenti degli altri Paesi, di proprietà di Hoffmann-La Roche AG.
© 2004 QIAGEN, tutti i diritti riservati.
Sommario
Contenuto del kit
4
Simboli
5
Conservazione
6
Controllo di qualità
6
Uso previsto
6
Limiti all’utilizzo del prodotto
7
Informazioni di sicurezza
7
Introduzione
9
Principio e procedura
10
Caratteristiche di prestazione del sistema BioRobot MDx DSP
14
Strumenti e reagenti forniti dall’operatore
24
Note importanti
25
Punti generali importanti
25
Preparazione dell’RNA
26
Conservazione dei campioni
26
Preparazione di reagenti e tamponi
26
Preparazione degli oggetti in plastica
30
Preparazione dei contenitori grandi di liquido
31
Eluizione di acidi nucleici virali
31
Resa e qualità degli acidi nucleici virali
32
Impostazione della stazione di lavoro BioRobot MDx
32
Pulizia della stazione di lavoro BioRobot MDx
32
Protocollo
Isolamento e purificazione in automatico degli acidi
nucleici virali da plasma e siero
36
Appendice A: messaggi visualizzati
41
Appendice B: file dei risultati
61
Appendice C: calcolo della quantità di controllo interno
63
Distributori QIAGEN
66
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
3
Contenuto del kit
Kit QIAamp DSP 96 Virus MDx
Numero di catalogo
61762
Numero preparazioni
1152
Kit principale QIAamp DSP 96 Virus MDx
1 scatola
QIAamp 96 Piastra QIAamp 96
12
CARRIER
RNA carrier (tappo rosso)
12 x 1350 μg
QP
Proteasi QIAGEN® *
12 fiale
PS
Solvente della proteasi
12 x 6 ml
AL
Tampone di lisi†
12 x 33 ml
AW1
Tampone di lavaggio 1†
(concentrato)
4 x 151 ml
AW2
Tampone di lavaggio 2‡
(concentrato)
4 x 127 ml
AVE
Tampone di eluizione‡
(tappo viola)
108 x 2 ml
TOPE
Fluido di eluizione
(tappo arancione)
48 x 1,4 ml
Q-Card§
1
Manuale
1
Materiali in plastica QIAamp DSP 96 Virus MDx
1 scatola
SB
S-Block
12
CAP
Tappi per strisce
3 x 55
EMT
Microprovette di
eluizione CL
12
DT
Recipiente monouso
3 x 10
BOT
Flacone di etanolo
1
* Volume di risospensione: 6 ml.
†
Contiene idrocloruro di guanidina. Vedere pagina 7 per le informazioni di sicurezza.
‡
Contiene sodio azide come conservante.
§
Non smaltire la Q-Card. Le informazioni contenute nel codice a barre sulla Q-Card sono
necessarie per avviare il sistema BioRobot MDx DSP.
4
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Simboli
Il contenuto è sufficiente per <N> test
<N>
Fare riferimento alle informazioni riportate nel manuale
Da utilizzarsi entro
Dispositivo medico per diagnostica in vitro
Numero di catalogo
Numero di lotto
Numero di materiale
Componenti
Numero
Volume
Limiti di temperatura
Produttore autorizzato
Nota importante
______
Trascrivere la data corrente dopo aver aggiunto etanolo
al flacone
Aggiunta
Contiene
Etanolo puro
Idrocloruro di guanidina
Liofilizzato
Ricostituire in
Subtilisina
Da utilizzarsi esclusivamente con
¨
Porta a
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
5
Conservazione
Il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx deve essere conservato alla temperatura
indicata sull’etichetta del kit stesso. La data di scadenza del kit è stampata sulla
Q-Card e sull’etichetta del kit ed è valida solo se il kit è conservato alla
temperatura indicata sull’etichetta.
L’RNA carrier può essere disciolto soltanto nel tampone di eluizione (AVE);
l’RNA carrier disciolto deve essere aggiunto immediatamente al tampone di lisi
(AL), come descritto a pagina 27. Questa soluzione deve essere preparata al
momento e rimane stabile per diverse ore se conservata a 2–8 °C.
La QIAGEN proteasi (QP) ricostituita è stabile fino a un anno se
conservata a 2–8 °C, ma comunque non oltre la data di scadenza del kit.
Il tampone di lavaggio 1 (AW1) e il tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituiti
sono stabili per un anno se conservati a temperatura ambiente (15–25 °C), ma
comunque non oltre la data di scadenza del kit.
Controllo di qualità
In conformità al sistema certificato di QIAGEN per la gestione della qualità
totale, ogni lotto del kit QIAamp DSP 96 Virus MDx viene testato in rapporto a
specifiche prestabilite, per garantire la costante qualità del prodotto.
Uso previsto
Il sistema BioRobot MDx DSP è un sistema generico che si avvale della
tecnologia QIAamp per l’isolamento e la purificazione in automatico degli
acidi nucleici virali da campioni umani di plasma o siero per analisi
diagnostiche in vitro. Il sistema BioRobot MDx DSP è progettato per essere usato
esclusivamente come un sistema chiuso. Il sistema è composto dalla stazione di
lavoro BioRobot MDx, dagli armadietti del laboratorio e degli accessori, da un
computer con il software QIAsoft MDx DSP e il protocollo QIAamp DSP 96 Virus
MDx e dal kit QIAamp DSP 96 Virus MDx.
Il sistema BioRobot MDx DSP è concepito per l’uso da parte di personale
professionista, come tecnici e medici esperti nelle tecniche di biologia
molecolare. Qualsiasi risultato diagnostico in vitro generato tramite la procedura
di preparazione del campione, in combinazione con un qualunque test
diagnostico in vitro di analisi degli acidi nucleici (NAT) downstream, deve essere
interpretato in un quadro più ampio che tenga conto di eventuali altri riscontri
clinici o di laboratorio.
6
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Per ridurre al minimo il rischio di un impatto negativo sui risultati diagnostici in
vitro, all’utente sono fornite informazioni per l’utilizzo di un controllo interno
durante i processi di preparazione, amplificazione e rilevamento del campione,
conformemente al test downstream in uso, al fine di controllare eventuali
irregolarità.
Limiti all’utilizzo del prodotto
Il sistema BioRobot MDx DSP non deve essere utilizzato per l’isolamento e la
purificazione dell’RNA e del DNA da campioni di sangue intero, tessuto,
midollo spinale e cellule in coltura umani. Inoltre, non deve essere impiegato
per isolare e purificare acidi nucleici di origine batterica, di funghi o parassiti.
Non sono state determinate le prestazioni del prodotto per campioni di liquido
cerebrospinale, urina e sospensioni fecali.
Informazioni di sicurezza
Quando si utilizzano sostanze chimiche, indossare sempre un adeguato camice
da laboratorio, guanti monouso e occhiali di protezione. Per ulteriori
informazioni, consultare le appropriate schede di sicurezza (MSDS). Le schede
MSDS, nel pratico e compatto formato PDF, sono disponibili online all’indirizzo
www.qiagen.com/ts/msds.asp. Qui è possibile trovare, visualizzare e stampare
la scheda MSDS per ciascun kit QIAGEN e i relativi componenti.
ATTENZIONE: NON aggiungere candeggina o soluzioni acide
direttamente alle preparazioni di campione da eliminare.
Il tampone di lisi (AL) e il tampone di lavaggio 1 (AW1) contengono idrocloruro
di guanidina, che può formare composti altamente reattivi in combinazione con la
candeggina. Nel caso in cui si rovesciassero dei liquidi contenenti questi
tamponi, pulire con acqua e detergente idoneo per l’uso in laboratorio. Se il
liquido rovesciato contiene agenti potenzialmente infetti, pulire l’area interessata
con acqua e detergente da laboratorio, quindi con una soluzione di ipoclorito
di sodio all’1% (v/v).
Se i flaconi di tampone sono danneggiati o si riscontrano perdite, indossare guanti
e occhiali di protezione per l’operazione di smaltimento, onde evitare lesioni
personali a sé o ad altri.
QIAGEN non ha testato i liquidi di scarico generati dalla procedura QIAamp
DSP 96 Virus MDx per la presenza di materiali infetti residui. La contaminazione
dei liquidi di scarico da parte di materiali infetti residui è altamente improbabile,
ma non può essere esclusa completamente. Pertanto i liquidi di scarico devono
essere considerati infetti e vanno smaltiti in conformità alle normative di
sicurezza locali vigenti in materia.
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
7
Ai componenti del kit QIAamp DSP 96 Virus MDx sono associate le seguenti
frasi di rischio e consigli di prudenza.
Tampone di lisi (AL) e tampone di lavaggio 1 (AW1)
Xn
Contengono idrocloruro di guanidina: pericoloso, irritante. Frasi di rischio e
consigli di prudenza:* R22-36/38, S13-26-36-46
Proteasi QIAGEN (QP)
Xn
Contiene subtilisina (proveniente da Bacillus subtilis): sensibilizzante, irritante.
Frasi di rischio e consigli di prudenza:* R37/38-41-42, S22-24-26-36/37/39-46
Informazioni di emergenza 24 ore su 24
È possibile ottenere informazioni mediche di emergenza in inglese, francese e
tedesco, 24 ore su 24, presso:
Centro di informazioni antiveleni, Mainz, Germania.
Tel: +49-6131-19240
* R22: nocivo per ingestione; R36/38: irritante per gli occhi e la pelle; R37/38: irritante per le
vie respiratorie e la pelle; R41: rischio di gravi lesioni oculari; R42: può provocare
sensibilizzazione per inalazione; S13: conservare lontano da cibi, bevande e alimenti per
animali; S22: non respirare le polveri; S24: evitare il contatto con la pelle; S26: in caso di
contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare
un medico; S36: usare indumenti protettivi adeguati; S36/37/39: usare indumenti protettivi,
guanti e dispositivi di protezione per gli occhi e il viso adeguati; S46: in caso di ingestione
consultare immediatamente un medico e mostrargli il contenitore o l’etichetta.
8
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Introduzione
Il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx si avvale di una tecnologia consolidata per
isolare e purificare simultaneamente il DNA e l’RNA virale da un’ampia gamma
di virus. Il kit combina le proprietà di legame selettivo di una membrana alla
silice con un formato a 96 pozzetti ad alta velocità di elaborazione ed è
progettato per l’elaborazione simultanea e completamente computerizzata di
96 campioni sul sistema BioRobot MDx DSP. Il processo completamente
computerizzato, che comprende la lettura del codice a barre, il controllo del
caricamento, il monitoraggio dei campioni e la documentazione completa del
processo, richiede un massimo di 2,5 ore per elaborare 96 campioni, senza
alcun intervento da parte dell’utente. La manipolazione manuale di campioni
potenzialmente infetti è ridotta, assicurando la sicurezza per l’utente nonché
un’elaborazione affidabile dei campioni. Il tempo di elaborazione tra analisi
consecutive è di circa 25 minuti per la preparazione dei reagenti e per l’avvio
della stazione di lavoro BioRobot MDx DSP, più 15 minuti per la pulizia degli
strumenti.
La procedura è idonea per campioni di plasma e siero, contenenti citrato o
EDTA. I campioni di plasma che contengono eparina non devono essere
utilizzati, poiché questo anticoagulante può interferire con i test diagnostici
downstream eseguiti in un secondo tempo, come la reazione di
polimerizzazione a catena. I campioni possono essere prelevati di recente,
liofilizzati o congelati, purché non siano stati congelati e scongelati più volte. Gli
acidi nucleici virali vengono eluiti nel tampone di eluizione (AVE) e sono pronti
per essere utilizzati in reazioni di amplificazione.
Il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx consente di scegliere tra due
procedure di lavaggio diverse. Il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx
standard utilizza procedure di lavaggio con tampone di lavaggio 2 (AW2) ed
etanolo (EtOH). Il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) fornisce una
procedura di lavaggio più rigida, eseguita con entrambi i tamponi di lavaggio
(AW1 e AW2) ed etanolo (EtOH). In questo modo, si gode della flessibilità di
scegliere la purezza desiderata per le analisi downstream da eseguire in un
secondo tempo. L’utente deve convalidare il protocollo che meglio si adatta a
un test specifico, seguendo le linee guida della International Conference on
Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for
Human Use (ICH) in ICH Q2A: Validation of analytical methods: Definitions and
terminology e ICH Q2B: Validation of analytical methods: Methodology.
Entrambi i protocolli possono essere eseguiti sullo stesso sistema BioRobot
MDx DSP, secondo le necessità.
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
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Principio e procedura
La procedura QIAamp DSP 96 Virus MDx prevede 6 fasi:
installazione guidata da un software del sistema BioRobot MDx, compresa
la lettura dei codici a barre dei campioni;
la lisi delle particelle del virus nel campione;
il legame degli acidi nucleici virali presenti nei lisati alle membrane di
una piastra QIAamp 96;
il lavaggio degli acidi nucleici virali legati alle membrane;
l’eluizione degli acidi nucleici virali dalle membrane;
la creazione di un file di risultati.
Volume del campione
Il sistema BioRobot MDx DSP è in grado di rimuovere un volume di campione di
265 μl da provette primarie e secondarie di diverse grandezze, come le
provette CryoTube® o BD Vacutainer®, che contengono un volume di campione
minimo di 500 μl. Le tabelle 1–3 (pagine 10–11) elencano le provette
compatibili con i diversi portaprovette del BioRobot MDx DSP. L’uso del
BioRobot MDx DSP non è limitato a queste provette. Se l’utente preferisce
utilizzare altre provette, il tecnico specializzato per lo strumento QIAGEN le
testerà durante l’installazione del BioRobot MDx DSP.
Nota: le provette con dimensioni identiche possono essere disponibili con
diversi numeri di catalogo, ma con anticoagulanti diversi.
Tabella 1. Provette compatibili per portaprovette, STS MDx, 15 mm
(contiene provette con diametro interno di 14–16 mm)
Produttore/
marchio
Altezza
Forma
provetta
Volume
Distributore N. cat.*
BD Falcon™
14 ml
96 mm
Rotonda
BD
352051
BD Vacutainer
10 ml
100 mm
Rotonda
BD
368430/
366457
VENOJECT II
10 ml
100 mm
Rotonda
Terumo
VP-100
SHL
* I numeri di catalogo sono soggetti a modifica; verificare con il produttore o con il fornitore.
10
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Tabella 2. Provette compatibili per portaprovette, STS MDx, 12 mm
(contiene provette con diametro interno di 11–13 mm)
Produttore/
marchio
†
Volume
Altezza
Forma
provetta
Sarstedt
7 ml
81 mm
Rotonda
Sarstedt
60550109
VENOJECT II
5 ml
78 mm
Rotonda
Terumo
VP-050 SDK
Distributore N. cat.†
I numeri di catalogo sono soggetti a cambiamento; verificare con il produttore o con il
fornitore.
Tabella 3. Provette compatibili per portaprovette, STS MDx, 9 mm
(contiene provette con diametro interno di 8–10 mm)
Produttore/
marchio
Volume
Altezza
Forma
provetta
BD Falcon
5 ml
75 mm
Rotonda
BD
352063
KABE EDTA
5 ml
75 mm
Rotonda
KABE
53101
NALGENE®
2 ml
45 mm
Fiala
criogenica
Nalge
5000-0120
NUNC
1,8 ml
40 mm
Rotonda
Nunc
363401
NUNC
3,6 ml
60 mm
Rotonda
Nunc
366524
NUNC
4,5 ml
80 mm
Rotonda
Nunc
363452
Sarstedt
2 ml
45 mm
Conica
Sarstedt
72693005
Sarstedt
5 ml
75 mm
Rotonda
Sarstedt
62526028
BD Vacutainer
6 ml
75 mm
Rotonda
BD
367815
Distributore N. cat.*
* I numeri di catalogo sono soggetti a modifica; verificare con il produttore o con il fornitore.
Lisi delle particelle virali
I campioni vengono lisati in condizioni denaturanti a temperature elevate. La lisi
viene eseguita in presenza di proteasi QIAGEN (QP) e di tampone di lisi (AL), che
insieme assicurano l’inattivazione delle RNasi.
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
11
Legame degli acidi nucleici alle membrane della piastra QIAamp 96
Per ottimizzare il legame di DNA e RNA virale con le membrane della piastra
QIAamp 96, si aggiunge etanolo ai lisati. Successivamente si applica il lisato a
un pozzetto della piastra QIAamp 96 e gli acidi nucleici virali, al passaggio dei
lisati, vengono assorbiti sulla membrana in gel di silice per effetto della pressione
indotta dal vuoto.
Rimozione dei residui contaminanti
Mentre gli acidi nucleici virali rimangono legati alle membrane della piastra
QIAamp 96, nel protocollo standard QIAamp DSP 96 Virus MDx i contaminanti
vengono rimossi efficacemente dal lavaggio eseguito mediante tampone di
lavaggio 2 (AW2) e infine etanolo (EtOH).
In alternativa, il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) fornisce una
procedura di lavaggio più rigida. Questo protocollo differisce dal protocollo
standard per l’aggiunta di un passaggio di lavaggio con il tampone di
lavaggio 1 (AW1) prima del lavaggio con il tampone di lavaggio 2 (AW2) e
infine con etanolo (EtOH).
Eluizione di acidi nucleici puri
Gli acidi nucleici virali vengono eluiti dalle membrane della piastra QIAamp
96 aggiungendo il tampone di eluizione (AVE). L’eluato dell’acido nucleico può
corrispondere anche al 50% del volume di reazione, a seconda del test
downstream da eseguire successivamente, senza causare alcun effetto inibitore.
12
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx
QIAsoft
MDx DSP
Protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1)
Setup guidato del tavolo di
lavoro
QIAsoft
MDx DSP
Setup guidato del tavolo
di lavoro
Controllo caricamento
Esegui scansione
codici a barre dei
campioni
Controllo caricamento
Esegui scansione
codici a barre dei
campioni
Aliquotare i campioni di
trasferimento QP e
aggiungere RNA carrier
contenente AL e controllo
interno
Aliquotare i campioni
di trasferimento QP e
aggiungere RNA
carrier contenente AL
e controllo interno
Lisi del campione
Lisi del campione
Aggiungere etanolo
Aggiungere etanolo
Trasferire lisati
Trasferire lisati
Legare acidi nucleici
Vuoto
Vuoto
Legare acidi nucleici
Lavare con AW1
Vuoto
Lavare con AW2
Lavare con AW2
Vuoto
Vuoto
Lavare con etanolo
Lavare con etanolo
Vuoto
Vuoto
Piastra QIAamp 96
asciutta
Vuoto
Piastra QIAamp 96
asciutta
Vuoto
Riscaldamento
Aggiungere AVE e TOPE
Vuoto
Aggiungere AVE e TOPE
Vuoto
Eluire acidi nucleici
Acidi nucleici virali purificati in EMT
Riscaldamento
Eluire acidi nucleici
Acidi nucleici virali purificati in EMT
Creare file di risultati
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
Creare file di risultati
13
Caratteristiche di prestazione del sistema BioRobot MDx DSP
Range lineare
Il range lineare di entrambi i protocolli QIAamp DSP 96 Virus è stato valutato
per i virus HIV, HCV RNA e HBV DNA. I test stati eseguiti con diluizioni di
pannelli di virus calibrati realizzati in plasma umano negativo a HIV, HBV
e HCV. La quantificazione dei pannelli dei virus HIV e HBV è stata eseguita
utilizzando gli standard internazionali dell’Organizzazione Mondiale della
Sanità 97/656 e 97/746, rispettivamente, come materiale di riferimento.
Un pannello di virus calibrato disponibile in commercio di AcroMetrix è stato
utilizzato per la serie di diluizione dell’HCV. Le serie di diluizione con 7 titoli
di virus diversi sono state testate con 24 replicati per ogni serie.
Il range lineare della procedura QIAamp DSP 96 Virus MDx è stato determinato
per i virus HIV, HCV RNA e HBV DNA in diversi test diagnostici successivi
(Tabella 4, Figure 1–3). Il calcolo dei titoli (conversione da cp a valori in UI)
è stato eseguito seguendo le specifiche del produttore corrispondente del test
downstream corrispondente (Tabella 4).
Tabella 4. Test diagnostici downstream utilizzati per la determinazione
del range lineare delle rese con i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx
Manuale test
utilizzato
Fattore di
conversione
Virus
Test downstream
HIV
Analisi quantitativa LCx®
HIV RNA (ABBOTT
Laboratories)
12/2003
1 UI = 0,1412 cp
HBV
Test COBAS AMPLICOR®
HBV MONITOR® (Roche
Diagnostics GmbH)
7/2003,
Revisione 1.0
1 UI = 5,26 cp
HCV
Test COBAS TaqMan HCV 9/2003
(Roche Diagnostics GmbH)
14
1 UI = 1 cp
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Range lineare di rese utilizzando i protocolli
QIAamp DSP 96 Virus MDx — HIV
8
Risultato (in UI/ml)
A
7
6
5
4
y = 0,8867x + 0,3878
3
R = 0,9972
2
2
2
3
4
5
6
7
8
Input (in UI/ml)
8
Risultato (in UI/ml)
B
7
6
5
4
y = 0,8838x + 0,3818
2
R = 0,9976
3
2
2
3
4
5
6
7
8
Input (in UI/ml)
Figura 1. Il range lineare dei protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx è stato determinato
utilizzando: A) l’analisi quantitativa LCx HIV RNA con il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx
(AW1) e B) il protocollo standard QIAamp DSP 96 Virus MDx. I valori UI sono stati calcolati
utilizzando le specifiche presenti nel manuale per il test downstream (1 UI = 0,1412 cp).
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
15
Range lineare di rese utilizzando il protocollo
QIAamp DSP 96 Virus MDx — HCV
Risultato (in UI/ml)
7
6
5
4
3
y = 0,9054x + 0,3011
2
R2 = 0,9982
1
1
2
3
4
5
6
7
Input (in UI/ml)
Figura 2. Il range lineare del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx è stato determinato
utilizzando il test COBAS TaqMan HCV. I valori UI sono stati calcolati utilizzando le specifiche
presenti nel manuale per il test downstream (1 UI = 1 cp).
Range lineare di rese utilizzando il protocollo
QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) — HBV
Risultato (in UI/ml)
5
4
3
2
y = 1,0577x – 0,5599
2
R = 0,9987
1
0
0
1
2
3
Input (in UI/ml)
4
5
Figura 3. Il range lineare del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) è stato determinato
utilizzando il test COBAS AMPLICOR HBV MONITOR. I valori UI sono stati calcolati utilizzando le
specifiche presenti nel manuale per il test downstream (1 UI = 5,26 cp).
16
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Precisione
I coefficienti di variazione (CV) sono stati determinati per le serie di diluizione
dell’HIV, dell’HCV e dell’HBV nel range lineare del test successivo appropriato.
Per l’analisi di precisione, sono stati utilizzati gli stessi test downstream, le stesse
serie di diluizione e gli stessi insiemi di dati utilizzati per la determinazione del
range lineare. Il calcolo dei titoli (conversione da cp a valori in UI) è stato
eseguito seguendo le specifiche del produttore corrispondente del test
downstream (vedere Tabella 4, pagina 14). I dati intra-esecuzione, interesecuzione e di precisione totali sono mostrati nel coefficiente di variazione
percentuale (%CV) nelle Tabelle 5–8.
Tabella 5. Precisione del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1)
nell’analisi quantitativa LCx HIV RNA
Media titolo
(UI/ml)
Precisione intraesecuzione (%CV)
Precisione interesecuzione (%CV)
Precisione
totale (%CV)
8,01 x 106
9,38
5,03
10,64
2,86 x 106
13,62
0,00
13,62
2,63 x 105
25,09
10,28
27,11
5,09 x 104
11,38
5,50
12,63
7,00 x 103
19,93
15,77
25,41
3,71 x 103
32,41
0,00
32,41
1,44 x 103
78,10
0,00
78,10
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
17
Tabella 6. Precisione del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx
nell’analisi quantitativa LCx HIV RNA
Media titolo
(UI/ml)
Precisione intraesecuzione (%CV)
Precisione interesecuzione (%CV)
Precisione
totale (%CV)
7,49 x 106
14,37
3,89
14,89
2,74 x 106
11,06
5,47
12,34
2,61 x 105
12,45
0,00
12,45
4,71 x 104
12,92
0,00
12,92
5,64 x 103
26,98
0,00
26,98
3,69 x 103
45,35
0,00
45,35
1,56 x 103
74,41
11,40
75,28
Tabella 7. Precisione del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx nel test
COBAS TaqMan HCV
Media titolo
(UI/ml)
Precisione intraesecuzione (%CV)
Precisione interesecuzione (%CV)
Precisione
totale (%CV)
5,92 x 105
10,31
11,05
15,12
6,01 x 104
16,24
4,09
16,75
7,47 x 103
16,46
8,62
18,58
1,16 x 103
17,73
0,00
17,73
6,13 x 102
25,15
0,00
25,15
2,74 x 102
35,74
28,56
45,75
1,07 x 102
39,97
0,00
39,97
18
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Tabella 8. Precisione del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1)
nel test COBAS AMPLICOR HBV MONITOR
Media titolo
(UI/ml)
Precisione intraesecuzione (%CV)
Precisione interesecuzione (%CV)
Precisione
totale (%CV)
8,30 x 103
11,24
23,79
26,31
2,85 x 103
24,52
24,91
34,95
8,04 x 102
19,08
25,84
32,12
2,39 x 102
20,51
24,98
32,32
7,77 x 101
15,02
25,28
29,40
1,71 x 101
53,02
0,00
53,02
6,34 x 100
47,56
48,59
67,99
Limite di rilevamento
Il limite di rilevamento è stato determinato dal valore di probit al 95% per
entrambi i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx utilizzando rispettivamente gli
standard internazionali sui virus HIV e HBV dell’OMS 97/656 e 97/746. Il
limite di rilevamento è stato determinato elaborando le serie di diluizione dei
virus appropriati (standard internazionali OMS sui virus in plasma umano
negativo a HIV e HBV con citrato). Ogni passaggio di diluizione è stato testato
in 3 esecuzioni sul sistema BioRobot MDx DSP, con 36 replicati per diluizione.
Per il rilevamento di RNA HIV è stato utilizzando un test RT-PCR real-time
interno. Il DNA dell’HBV è stato analizzando utilizzando un metodo PCR interno
endpoint seguito da elettroforesi del gel dell’agarosi. Gli ampliconi della
dimensione attesa sono stati contati come risultati. I dati combinati per tutti i
campioni sono stati valutati utilizzando analisi di probit (Logistic regression,
Arcus Quickstat, Biomedical Version 1.1). I dati sono presentati nelle
Tabelle 9 e 10.
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
19
Tabella 9. Limite di rilevamento di RNA HIV usando i protocolli QIAamp
DSP 96 Virus MDx e un test RT-PCR in tempo reale interno
Protocollo QIAamp
DSP 96 Virus MDx
Protocollo QIAamp
(AW1)
DSP 96 Virus MDx
Titolo di input
(UI/ml)
Replicati Risultati
Risultati
(%)
Risultati
Risultati
(%)
800
36
36
100,00
36
100,00
600
36
36
100,00
36
100,00
400
36
36
100,00
36
100,00
200
36
36
100,00
35
97,22
100
36
35
97,22
33
91,67
50
36
23
63,89
27
75,00
10
36
6
16,67
7
19,44
0
18
0
0,00
0
0,00
Valore di probit
al 95%
Intervallo di
confidenza
20
–
123,08
–
133,92
–
–
87,84–
205,19
–
92,38–
234,94
–
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Tabella 10. Limite di rilevamento di RNA HBV usando i protocolli
QIAamp DSP 96 Virus MDx e un test PCR interno
Protocollo QIAamp
DSP 96 Virus MDx
Protocollo QIAamp
(AW1)
DSP 96 Virus MDx
Titolo di input
(UI/ml)
Replicati Risultati
Risultati
(%)
Risultati
Risultati
(%)
50
36
36
100,00
36
100,00
35
36
33
91,67
36
100,00
20
36
31
86,11
33
91,67
10
36
27
75,00
23
63,89
5
36
11
30,56
19
52,78
2
36
9
25,00
11
30,56
0,5
36
4
11,11
4
11,11
0
18
0
0,00
0
0,00
Valore di probit
al 95%
Intervallo di
confidenza
–
–
51,73
–
37,51
–
33,08–
100,01
–
24,27–
72,53
–
Robustezza del sistema
È stato eseguito un confronto dei risultati relativi ai campioni di plasma e
siero da donatori singoli raccolti utilizzando provette di prelievo di sangue diverse
(Tabella 11) a cui sono stati aggiunti standard dei virus HIV e HCV. I campioni
sono stati elaborati utilizzando i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx
(Figure 4 e 5).
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
21
Tabella 11. Combinazioni di provette e virus aggiunti a campioni di
plasma per la determinazione della variazione del sistema
Virus Provetta
Abbreviazione Fornitore
N. cat.*
HIV
Vacutainer PPT™
PPT
BD
362788
HIV
Vacuette® EDTA
Vacuette
Greiner bio-one
454036
HIV
Primavette S EDTA Primavette
HCV Vacutainer PPT
PPT
Kabe Labortechnik
BD
HCV Monovette®
S 9NC
Coagulation 9 NC
Sarstedt
HCV Monovette Serum
Gel S 9
Sarstedt
S Gel
0959 0540
362788
02.1067.001
02.1388.001
* I numeri di catalogo sono soggetti a modifica; verificare con il produttore o con il fornitore.
Robustezza del sistema utilizzando provette diverse — HIV
Risultato (in UI/ml)
6
5
4
3
2
1
0
PPT
Vacuette
Primavette
Provette
Figura 4. Per aggiungere ai campioni di plasma HIV a un titolo di 1,4 x 105 UI/ml è stato
utilizzato uno standard funzionante interno di virus HIV calibrato allo standard internazionale
dell’OMS L’RNA HIV è stato purificato utilizzando il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx e
rilevato utilizzando il test COBAS TaqMan HIV-1 (Roche Diagnostics GmbH). Le provette
utilizzate sono elencate nella Tabella 11. I valori UI sono stati calcolati utilizzando le specifiche
presenti nel manuale per il test downstream (1 UI = 0,61 cp).
22
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Risultato (in UI/ml)
Robustezza del sistema utilizzando provette diverse — HCV
4
3
2
1
0
PPT
S 9NC
S Gel
Provette
Figura 5. Ai campioni dei donatori è stato aggiunto uno standard di virus HCV calibrato
disponibile in commercio di AcroMetrix a un titolo di 500 UI/ml. Per il rilevamento, è stato
utilizzato il test COBAS TaqMan HCV (Roche Diagnostics GmbH) come test diagnostico
downstream. La preparazione del campione è stata eseguita utilizzando il protocollo QIAamp
DSP 96 Virus MDx (AW1). Le provette utilizzate sono elencate nella Tabella 11, pagina 22.
I valori UI sono stati calcolati utilizzando le specifiche presenti nel manuale per il test
downstream (1 UI = 1 cp).
Esclusione del carryover dei campioni
Sul sistema BioRobot MDx DSP sono state effettuate sei esecuzioni, per valutare
il rischio di eventi di contaminazione crociata durante e tra i protocolli QIAamp
DSP 96 Virus MDx. Il test è stato eseguito utilizzando uno standard virus HBV
quantificato HBV messo in commercio da AcroMetrix. Il carico virale dei
campioni positivi utilizzati per i test del carryover era di 2,0 x 105 UI/ml. Per la
diluizione di campioni positivi e come campioni di controllo negativi, è stato
utilizzato plasma umano negativo all’HBV con citrato.
Per rilevare il carryover da campione a campione, sono state effettuate
3 esecuzioni con una disposizione a scacchiera di campioni negativi e
fortemente positivi. Dopo ogni esecuzione a scacchiera, per monitorare il
possibile carryover da una esecuzione all’altra, è stata effettuata un’esecuzione
con campioni tutti negativi. Il DNA HBV è stato rilevato utilizzando un test
PCR interno endpoint seguito da elettroforesi del gel dell’agarosi. È stato
convalidato che il test è in grado di rilevare il DNA HBV con una probabilità
del 95% a un titolo del virus pari a 16,76 UI/ml (probit al 95%).
Tramite l’utilizzo del test PCR HBV interno, tutti i campioni altamente positivi
sono stati rilevati come positivi. Tutti i campioni negativi, nelle esecuzioni a
scacchiera e nelle esecuzioni in cui erano presenti solo campioni negativi, non
hanno fornito risposta.
Questi esperimenti dimostrano che i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx, in
queste condizioni, non presentano carryover di campioni.
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
23
Strumenti e reagenti forniti dall’operatore
Quando si utilizzano sostanze chimiche, indossare sempre un adeguato camice
da laboratorio, guanti monouso e occhiali di protezione. Per ulteriori
informazioni, consultare le appropriate schede di sicurezza (MSDS), disponibili
presso il fornitore dei prodotti.
Il sistema BioRobot MDx DSP, compresi la stazione di lavoro BioRobot
MDx, il software QIAsoft MDx DSP e il protocollo QIAamp DSP 96
Virus MDx
Puntali dei filtri monouso, 1100 μl (960) (n. di catalogo 9012598)
Etanolo (96–100%, grado di purezza p.a.)
Acqua distillata deionizzata
Guanti monouso
Cilindri di misurazione (200, 500 e 1000 ml)
Centrifuga con rotore compatibile per la centrifugazione delle provette del
campione
Pipette e relativi puntali (per evitare la contaminazione crociata, si
raccomanda di utilizzare puntali con filtro)
24
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Note importanti
Punti generali importanti
Dopo aver ricevuto il kit, verificare che i singoli componenti non siano
danneggiati. Se le confezioni blister o i flaconi appaiono danneggiati,
rivolgersi al servizio di assistenza QIAGEN o al distributore locale. In caso di
rovesciamento dei liquidi, consultare le “Informazioni di sicurezza”
(pagina 7). Non utilizzare componenti del kit danneggiati, poiché
potrebbero inficiare le prestazioni del kit.
Utilizzare sempre attrezzature prive di RNasi.
Sostituire sempre i puntali delle pipette quando si eseguono trasferimenti
manuali di liquidi (per es., al momento della preparazione, dell’unione o
della divisione di campioni virali da posizionare sul tavolo di lavoro
BioRobot MDx).
Utilizzare sempre puntali dei filtri monouso di QIAGEN (vedere pagina 24)
per evitare la contaminazione crociata.
Utilizzare sempre guanti monouso e controllare regolarmente che non siano
contaminati da materiale campione.
Se i guanti risultano contaminati, gettarli.
Per escludere i rischi associati all’uso di materiale potenzialmente infetto,
si raccomanda di operare in condizioni di flusso d’aria laminare, finché
non ha avuto luogo il posizionamento dei campioni sul tavolo di lavoro
BioRobot MDx.
Non utilizzare componenti appartenenti a un altro kit QIAamp DSP 96 Virus
MDx, a meno che i numeri del materiale e di lotto dei due kit non siano
identici.
Non unire reagenti da flaconi o provette diversi, anche se provengono
dallo stesso lotto o dallo stesso kit.
Dopo l’utilizzo, chiudere tutti i flaconi per evitare perdite.
Non utilizzare un kit o un suo componente dopo la data di scadenza.
Evitare la contaminazione microbica dei reagenti del kit.
Il sistema deve essere utilizzato esclusivamente da personale esperto nelle
pratiche di laboratorio per la diagnostica in vitro e nel funzionamento del
sistema BioRobot MDx DSP. Il personale deve inoltre far riferimento al
Manuale utente BioRobot MDx DSP.
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
25
Preparazione dell’RNA
Il tampone di eluizione (AVE) è testato per l’assenza di livelli rilevabili di RNasi e
contiene sodio azide, un agente antimicrobico in grado di impedire la crescita di
organismi che producono RNasi. Tuttavia, poiché questo tampone non contiene
agenti chimici di degradazione delle RNasi, non può inibire le RNasi introdotte
da una manipolazione scorretta. Manipolare con cura il tampone di eluizione
(AVE), onde evitare la contaminazione con le RNasi.
Conservazione dei campioni
Dopo il prelievo e la preparazione, è possibile conservare plasma e
siero a 2–8 °C per un massimo di 6 ore. Per una conservazione a lungo
termine, è consigliato il congelamento a -20 °C o -80 °C in aliquote. I campioni
di siero e plasma non devono essere scongelati più volte. Congelamento e
scongelamento, se ripetuti, possono provocare la denaturazione e la
precipitazione delle proteine, riducendo i titoli virali e limitando di
conseguenza la resa di acidi nucleici virali. Inoltre, i crioprecipitati che si
formano durante il congelamento e lo scongelamento ripetuti possono ostruire le
membrane della piastra QIAamp 96. Se sono visibili crioprecipitati, farli
sedimentare per centrifugazione a circa 6800 x g per 3 minuti. Aspirare e
processare immediatamente il sovranatante limpido, senza toccare il pellet.
Prima di iniziare la procedura di purificazione dell’acido nucleico virale, i
campioni scongelati devono essere equilibrati a temperatura ambiente
(15–25 °C).
Preparazione di reagenti e tamponi
Preparazione della proteasi QIAGEN
Aggiungere l’intero contenuto di un flacone di solvente della proteasi (PS)
contenente 6 ml a un tubo contenente la proteasi QIAGEN (QP) liofilizzata e
miscelare con cura. Per evitare la formazione di schiuma, miscelare più volte la
fiala capovolgendola. Assicurarsi che la proteasi QIAGEN (QP) sia
completamente disciolta. Aprire la fiala e posizionarla nel portareagenti per 1
flacone (QP) sul tavolo di lavoro BioRobot MDx.
26
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Aggiunta dell’RNA carrier al tampone di lisi
L’RNA carrier svolge una duplice funzione. In primo luogo potenzia il legame
degli acidi nucleici virali alla membrana della piastra QIAamp 96, soprattutto se i
campioni contengono un numero molto limitato di molecole target.
Secondariamente, aggiungendo grandi quantità di RNA carrier si riduce la
possibilità di degradazione dell’RNA virale, nel raro caso che le molecole
dell’RNasi non vengano denaturate dai sali caotropici e dal detergente nel
tampone di lisi (AL). Se non si aggiunge RNA carrier al tampone di lisi (AL), si può
osservare una diminuzione della quantità di DNA o RNA virale ottenuto.
Inoltre l’RNA carrier può rientrare nella composizione di alcuni reagenti per
controllo interno dei test commerciali downstream. In tali casi, consultare le istruzioni
per l’uso fornite dal produttore del test downstream.
Per preparare la soluzione di RNA carrier, aggiungere 450 μl di tampone di
eluizione (AVE) a una fiala contenente 1.350 μg di RNA carrier liofilizzato. È
fornita una provetta di tampone di eluizione (AVE) per ogni fiala di RNA carrier.
L’RNA carrier non si dissolve nel tampone di lisi (AL). È prima necessario
discioglierlo nel tampone di eluizione (AVE) e successivamente aggiungerlo al
tampone di lisi (AL). Assicurarsi che l’RNA carrier sia completamente disciolto nel
volume appropriato di tampone di eluizione (AVE), prima di miscelarlo con il
tampone di lisi (AL).
Trasferire 230 μl di RNA carrier ricostituito nel tampone di eluizione (AVE)
a un flacone contenente 33 ml di tampone di lisi (AL) per ottenere una
concentrazione finale di 5,6 μg di RNA carrier per la preparazione del
campione. Miscelare delicatamente il flacone capovolgendolo 10 volte.
Per evitare la formazione di schiuma, non utilizzare il vortex. Versare la miscela
di tampone di lisi (AL) e RNA carrier in un recipiente monouso (DT) nel
portareagente per 2 recipienti (posizione AL) e rimuovere tutte
le bolle d’aria più grandi toccandole con il puntale di una pipetta.
Versare con attenzione il tampone di lisi (AL) contenente l’RNA carrier nel
recipiente monouso (DT) al fine di evitare la creazione di bolle grandi che
potrebbero interferire con il sistema di rilevamento del liquido.
Aggiunta di un controllo interno al tampone di lisi
Si raccomanda fortemente l’impiego di un controllo interno quando si utilizza il
kit QIAamp DSP 96 Virus MDx in combinazione con sistemi di amplificazione
diagnostici e di rilevamento. In questo caso occorre aggiungere al tampone di lisi
(AL) l’RNA o il DNA di controllo interno e l’RNA carrier ricostituito, quindi
miscelarli con cura, invertendo il flacone 10 volte. Per evitare la formazione di
schiuma, non utilizzare il vortex.
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
27
Consultare le istruzioni del produttore per stabilire la concentrazione ottimale del
controllo interno. L’uso di una concentrazione diversa da quella consigliata può
generare risultati scorretti. Quando si calcola la quantità appropriata di controllo
interno da utilizzare, tenere in considerazione il volume iniziale del campione e
quello dell’eluato. Per i calcoli, utilizzare un volume di campione di partenza di
265 μl e un volume di eluato di 83 μl (vedere “Eluizione di acidi nucleici virali”,
pagina 31). Consultare l’Appendice C per un esempio di come calcolare la
quantità di controllo interno da utilizzare con il sistema BioRobot MDx DSP e
con i test diagnostici downstream.
Utilizzare sempre il controllo interno corretto per il test downstream. Per
ulteriori informazioni, vedere le istruzioni fornite dal produttore. Consultare
l’Appendice C per un esempio di come calcolare la quantità di controllo interno
da utilizzare con il sistema BioRobot MDx DSP.
Se si aggiunge un controllo interno al tampone di lisi (AL) e all’RNA carrier,
assicurarsi di trasferire non più di 33 ml della miscela nel recipiente monouso
(DT). Smaltire il rimanente. L’utilizzo di volumi maggiori potrebbe comportare
una misurazione di liquido non corretta da parte del sistema di rilevamento del
livello del liquido, causando il fallimento della procedura di controllo
caricamento.
Preparazione del tampone di lavaggio 1 (esclusivamente per il
protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx AW1)
Utilizzando un cilindro graduato, aggiungere 200 ml di etanolo (96–100%) a
un flacone contenente 151 ml di tampone di lavaggio 1 (AW1) concentrato. Un
flacone di tampone di lavaggio 1 (AW1) ricostituito contiene tampone
sufficiente per 3 esecuzioni di 96 campioni ciascuna. Conservare il tampone di
lavaggio 1 (AW1) ricostituito a temperatura ambiente (15–25 °C). Per
consentire l’identificazione da parte del sistema BioRobot MDx DSP, ogni
flacone di tampone di lavaggio 1 (AW1) riporta un codice a barre sull’etichetta.
Il flacone aperto deve essere posizionato nel carosello dei reagenti con il codice
a barre rivolto verso l’esterno. Il reagente è necessario esclusivamente per il
protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1). Per il protocollo QIAamp DSP 96
Virus MDx standard, il flacone del tampone di lavaggio 1 (AW1) può essere
rimosso dal rotore dei reagenti o lasciato in posizione.
Miscelare sempre il tampone di lavaggio 1 (AW1) ricostituito, invertendo il
flacone più volte prima di posizionarlo nel carosello dei reagenti.
Dopo un’esecuzione, se non si procede immediatamente a un’altra
esecuzione, chiudere il flacone. Togliere il tappo quando si inizia un’altra
esecuzione.
28
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Preparazione del tampone di lavaggio 2
Utilizzando un cilindro graduato, aggiungere 300 ml di etanolo (96–100%) a
un flacone contenente 127 ml di tampone di lavaggio 2 (AW2) concentrato. Un
flacone di tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituito contiene tampone
sufficiente per 3 esecuzioni di 96 campioni ciascuna. Conservare il tampone di
lavaggio 2 (AW2) ricostituito a temperatura ambiente (15–25 °C). Per
consentire l’identificazione da parte del sistema BioRobot MDx DSP, ogni
flacone di tampone di lavaggio 2 (AW2) riporta un codice a barre sull’etichetta.
Il flacone aperto deve essere posizionato nel carosello dei reagenti con il codice
a barre rivolto verso l’esterno.
Miscelare sempre il tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituito, invertendo il
flacone più volte prima di posizionarlo nel carosello dei reagenti.
Dopo un’esecuzione, se non si procede immediatamente a un’altra
esecuzione, chiudere il flacone. Togliere il tappo quando si inizia un’altra
esecuzione.
Preparazione dell’etanolo
Riempire il flacone vuoto di etanolo (BOT) con 350 ml di etanolo (96–100%).
Aggiungere 350 μl di tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituito a tale flacone
(per una diluizione finale 1/1000 di AW2); ciò consente al sistema BioRobot
MDx DSP di rilevare il livello di riempimento nel flacone attraverso misurazioni
della conducibilità. Il flacone riempito contiene etanolo sufficiente per
2 esecuzioni di 96 campioni ciascuna. Conservare il flacone a temperatura
ambiente (15–25 °C). Per consentire l’identificazione da parte del sistema
BioRobot MDx DSP, il flacone di etanolo (BOT) riporta un codice a barre
sull’etichetta. Il flacone aperto deve essere posizionato nel carosello dei
reagenti con il codice a barre rivolto verso l’esterno.
Miscelare sempre l’etanolo invertendo il flacone più volte prima di
posizionarlo nel carosello dei reagenti.
Dopo un’esecuzione, se non si procede immediatamente a un’altra
esecuzione, chiudere il flacone. Togliere il tappo quando si inizia un’altra
esecuzione.
Assicurarsi che siano aggiunti a 350 ml di etanolo (EtOH) 350 μl di
tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituito, come descritto precedentemente, al
fine di consentire la misurazione della conducibilità da parte del sistema
BioRobot MDx DSP.
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
29
Preparazione del liquido di sistema
Riempire il flacone del liquido di sistema vuoto nel rotore dei reagenti con
almeno 700 ml di acqua deionizzata. Il flacone riempito contiene liquido di
sistema sufficiente per 1 esecuzione di 96 campioni e per la procedura di
pulizia successiva all’esecuzione. Il flacone aperto deve essere posizionato
nell’alloggiamento corrispondente nel carosello dei reagenti.
Preparazione del tampone di eluizione
Per 1 esecuzione di 96 campioni, sono necessarie 8 provette di tampone di
eluizione (AVE). Aprire tali provette e posizionarle nel portareagente per
microprovette e nel recipiente (posizione AVE). Fare attenzione a non
contaminare i tamponi con RNasi. Smaltire il tampone di eluizione (AVE) in
eccesso dopo ogni esecuzione.
Preparazione del fluido di eluizione
Per 1 esecuzione di 96 campioni, sono necessarie 4 provette di fluido di
eluizione (TOPE). Aprire tali provette e posizionarle nel portareagente per
microprovette e nel recipiente (posizione TOPE). Smaltire il fluido di eluizione
(TOPE) in eccesso dopo ogni esecuzione.
Preparazione degli oggetti in plastica
S-Block
Per ogni esecuzione, deve essere posizionato 1 S-Block (SB) nell’adattatore
di trasferimento del calore argentato del sistema di riscaldamento e
raffreddamento. Assicurarsi che la posizione A1 si trovi nell’angolo in alto
a sinistra. Smaltire l’S-Block dopo ogni esecuzione.
Recipienti monouso
Per ogni esecuzione, devono essere posizionati 2 recipienti monouso (DT) nel
portareagente per 2 recipienti (posizioni AL e EtOH) nella fessura 2 dell’MP.
Smaltire i recipienti monouso (DT) dopo l’esecuzione.
Microprovette di eluizione CL
Per ogni esecuzione, 1 provetta di eluizione CL (EMT) deve essere posizionata
nell’adattatore blu per microprovette di eluizione. L’insieme delle provette di
eluizione CL (EMT) e dell’adattatore deve essere posizionato sulla parte
superiore del portareagente per microprovette e del recipiente. Assicurarsi che il
codice a barre delle microprovette di eluizione CL (EMT) sia rivolto verso destra.
30
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Piastra QIAamp 96
Per ogni esecuzione, una piastra QIAamp 96 deve essere posizionata
nell’apposito portapiastra a pozzetti multipli argentato. Assicurarsi che la
posizione A1 si trovi nell’angolo in altro a sinistra e che il codice a barre della
piastra QIAamp 96 sia rivolto verso destra. Smaltire la piastra QIAamp 96 dopo
l’esecuzione.
Preparazione dei contenitori grandi di liquido
All’avvio del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx sul sistema BioRobot MDx
DSP, appariranno sul display dei messaggi relativi alla preparazione del
contenitore del liquido di sistema, del contenitore dei rifiuti e della trappola
del vuoto.
Contenitore del liquido di sistema
Svuotare il contenitore del liquido di sistema (sotto la stazione di lavoro).
Per aprire il contenitore del liquido di sistema, scollegare prima i tubi e poi
rimuovere il coperchio. Sciacquare il contenitore accuratamente con acqua
fresca deionizzata e riempirlo nuovamente con acqua fresca deionizzata.
Dopo aver riempito il contenitore del liquido di sistema con acqua deionizzata,
chiudere il coperchio e collegare i tubi. Irrorare il sistema del diluitore con
30 ml di acqua deionizzata selezionando “Tools/Flush System” (Strumenti/
Lava sistema).
Contenitore di scarico e trappola del vuoto
Svuotare la trappola del vuoto e il contenitore di scarico (sotto la stazione di
lavoro). Quando si apre la trappola del vuoto, scollegare prima i tubi e poi
rimuovere il coperchio. Dopo aver svuotato la trappola del vuoto, chiudere il
coperchio e collegare i tubi. La trappola e il contenitore, e i rispettivi coperchi e
tubi, possono essere puliti con detergente e sciacquati con acqua.
I liquidi di scarico generati dalla procedura QIAamp DSP 96 Virus MDx
non sono stati testati per la presenza di materiali infetti residui. La
contaminazione dei liquidi di scarico da parte di materiali infetti residui è
altamente improbabile, ma non può essere esclusa completamente. Pertanto i
liquidi di scarico devono essere considerati infetti e smaltiti in conformità alle
normative di sicurezza locali vigenti in materia.
Eluizione di acidi nucleici virali
Gli acidi nucleici virali sono raccolti in microprovette di eluizione CL (EMT). Il
volume medio di tampone di eluizione (AVE) aggiunto dal sistema BioRobot
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
31
MDx DSP per ciascun pozzetto della piastra QIAamp 96 è 91 μl. Il volume
medio di ogni eluato raccolto nelle microprovette di eluizione CL (EMT) è 83 μl.
Resa e qualità degli acidi nucleici virali
La resa e la qualità degli acidi nucleici virali isolati sono idonee per tutti i tipi di
applicazioni di diagnostica molecolare downstream. La resa e la purezza degli
acidi nucleici virali possono variare, a seconda che il protocollo venga utilizzato
con o senza tampone di lavaggio 1 (AW1). L’utente deve convalidare il
protocollo che meglio si adatta allo specifico test downstream, sulla base delle
linee guida ICH in ICH Q2A: Validation of analytical methods: Definitions and
terminology e ICH Q2B: Validation of analytical methods: Methodology.
Eseguire i test diagnostici attenendosi alle istruzioni dei produttori.
Impostazione della stazione di lavoro BioRobot MDx
Dopo aver aperto il software QIAsoft MDx DSP e avviato uno dei protocolli di
preparazione dei campioni (vedere protocollo, pagina 37), appare una serie di
messaggi che guidano l’utente attraverso l’impostazione della stazione di
lavoro BioRobot MDx per la procedura di purificazione computerizzata degli
acidi nucleici virali. È importante seguire ogni messaggio visualizzato prima di
passare al successivo. La Figura 6 (pagina 33) e le Tabelle 12 e 13 (pagine 34
e 35) riassumono il layout del tavolo di lavoro BioRobot MDx e le posizioni nelle
quali devono essere collocati gli elementi.
Pulizia della stazione di lavoro BioRobot MDx
Alla fine dell’esecuzione di un protocollo, il software QIAsoft MDx DSP
visualizza una serie di messaggi che guidano l’utente attraverso i passaggi
della procedura di pulizia. Dopo ogni esecuzione, smaltire sempre gli oggetti in
plastica e i reagenti rimanenti sul tavolo di lavoro (AL, AVE, TOPE ed etanolo),
al fine di evitare il carryover di acidi nucleici virali all’esecuzione successiva del
protocollo. I reagenti rimasti nel carosello dei reagenti (AW1 e AW2) possono
essere utilizzati in diverse esecuzioni di protocollo fino alla data di scadenza
specificata sulle etichette dei flaconi.
Non unire reagenti da flaconi o provette diversi, anche se provengono
dallo stesso lotto o dallo stesso kit.
I liquidi di scarico generati dalla procedura QIAamp DSP 96 Virus MDx
non sono stati testati per la presenza di materiali infetti residui. La
contaminazione dei liquidi di scarico da parte di materiali infetti residui è
altamente improbabile, ma non può essere esclusa completamente. Pertanto i
liquidi di scarico devono essere considerati infetti e smaltiti in conformità alle
normative di sicurezza locali vigenti in materia.
32
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Tavolo da lavoro BioRobot MDx
Vassoio per
puntali
Portapiastra a
pozzetti multipli
nero (contiene
l’adattatore di
canalizzazione)
Portapiastra a
pozzetti multipli
argentato
(contiene una
piastra
QIAamp 96)
Base apparato da vuoto
Coperchio apparato da vuoto
Parte superiore dell’apparato da vuoto
Sistema di riscaldamento e raffreddamento
Portareagente per 1 flacone QP
Portareagente per microprovette e recipiente
Posizione TOPE
Posizione AVE
Sistema di
monitoraggio
campioni
Microprovette di eluizione CL
(sull’adattatore di microprovette di eluizione)
Portareagente per 2 recipienti
(posizione EtOH)
Portareagente per 2 recipienti
(posizione AL)
Figura 6. Panoramica del tavolo di lavoro BioRobot MDx e dei suoi componenti principali.
Fare riferimento alle Tabelle 12 e 14 per maggiori dettagli.
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
33
Tabella 12. Caricamento degli oggetti in plastica e degli accessori
Articolo
Posizione
Microprovette di
eluizione CL (EMT)
Portareagente per
Adattatore microprovette
microprovette e recipiente di eluizione blu
Recipiente monouso (DT) Fessura 2 MP
Contenitore/adattatore
Portareagente per 2
recipienti (EtOH e AL)
Piastra QIAamp 96
Portapiastra a pozzetti
multipli argentato
Adattatore di
canalizzazione
Portapiastra a pozzetti
multipli nero
S-Block (SB)
Sistema di riscaldamento Adattatore di trasferimento
e raffreddamento
di calore argentato
Puntali monouso
(1100 μl)
Porta puntale rosso
Coperchio apparato
da vuoto
A destra della base
dell’apparato da vuoto
Parte superiore
dell’apparato da vuoto
A destra della base
dell’apparato da vuoto e
sopra il coperchio
dell’apparato da vuoto
34
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Tabella 13. Caricamento dei tamponi e dei reagenti
Articolo
Posizione
Volume
Tampone di lisi (AL)*
Recipiente monouso (DT) 33 ml
nel portareagente per
2 recipienti (posizione AL)
Proteasi QIAGEN (QP)†
Portareagente per
1 flacone (QP)
Tampone di eluizione
(AVE)
Portareagente per
Otto provette da 2 ml
microprovette e recipiente (tappo viola)
(posizione AVE)
Fluido di eluizione
(TOPE)‡
Portareagente
per microprovette
e recipiente
(posizione TOPE)
Quattro provette da
1,5 ml (tappo arancione)
Tampone di lavaggio 1
(AW1)§
Carosello dei reagenti
Minimo di 164 ml
(ricostituito)
Tampone di lavaggio 2
(AW2)
Carosello dei reagenti
Minimo di 191 ml
(ricostituito)
Etanolo
Carosello dei reagenti
Minimo di 350 ml
Liquido di sistema
Carosello dei reagenti
Minimo di 700 ml di
acqua deionizzata
Campioni
Sistema di monitoraggio Minimo di 500 μl di
campioni
campione in ogni
provetta
6 ml
* Contenente RNA carrier e controllo interno.
†
Ricostituito in 6 ml di solvente della proteasi (PS).
‡
La presenza di fluido di eluizione (TOPE) non è monitorata nel controllo di caricamento.
§
Necessario esclusivamente per il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1).
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
35
Protocollo: isolamento e purificazione in automatico
degli acidi nucleici virali da plasma e siero
Per isolare e purificare acidi nucleici virali da 265 μl di plasma o siero trattati
con EDTA o citrato utilizzando il sistema BioRobot MDx DSP.
Punti importanti prima di iniziare
Ogni campione deve essere etichettato con un codice a barre; in caso
contrario, non sarà elaborato. La persona con accesso da supervisore al
software QIAsoft MDx DSP può selezionare se usare codici a barre univoci
(l’impostazione predefinita) o codici a barre non univoci. Per dettagli, fare
riferimento al Manuale utente BioRobot MDx DSP.
Utilizzando l’opzione con codici a barre non univoci, lo stesso codice
a barre può essere utilizzato per etichettare campioni diversi. In tal caso,
prestare attenzione a non confondere i campioni aventi lo stesso codice
a barre.
Orientare i campioni etichettati con codice a barre nei portaprovette del
sistema di monitoraggio dei campioni in modo tale che i codici a barre
siano rivolti verso la telecamera del lettore di codici a barre sul lato sinistro
della stazione di lavoro BioRobot MDx. Le etichette dei codici a barre
devono essere attaccate alle provette dei campioni in modo tale che le
linee dei codici a barre siano orizzontali. Le etichette dei codici a barre
devono essere compatibili con la stazione di lavoro BioRobot MDx (per
dettagli, vedere il Manuale utente BioRobot MDx DSP). Ogni provetta deve
contenere almeno 500 μl di campione.
Il contenitore di smaltimento dei puntali deve contenere una borsa di
smaltimento dei puntali completamente aperta e vuota. Il cassetto con il
contenitore di smaltimento dei puntali deve essere completamente inserito.
Il contenitore del liquido di sistema, il contenitore dei rifiuti e la trappola
del vuoto devono essere posizionati correttamente nei rispettivi contenitori
e la loro parte esterna deve essere asciutta. Il sensore del contenitore del
liquido di sistema deve essere asciutto.
Se il sistema BioRobot MDx DSP visualizza un errore (per es., pressione
indotta dal vuoto insufficiente) durante la preparazione computerizzata dei
campioni, seguire le istruzioni visualizzate nei messaggi sullo schermo o fare
riferimento al Manuale utente BioRobot MDx DSP. I messaggi visualizzati (che
appaiono in inglese) o le loro traduzioni sono elencati nell’Appendice A,
pagina 41.
36
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Operazioni da eseguire prima di iniziare
Aggiungere l’RNA carrier ricostituito in tampone di eluizione (AVE) e il
controllo interno al tampone di lisi (AL), secondo le istruzioni a pagina 27.
Assicurarsi che il tampone di lavaggio 1 (AW1), il tampone di lavaggio 2
(AW2), la proteasi QIAGEN (QP) e l’etanolo siano stati preparati secondo le
istruzioni della sezione “Preparazione di reagenti e tamponi” a pagina 26.
Procedura
1. Lasciar equilibrare i campioni a temperatura ambiente (15–25 °C) e
miscelare bene diverse volte per inversione.
I crioprecipitati che si formano durante il congelamento e lo
scongelamento ripetuti possono ostruire le membrane della piastra
QIAamp 96. Se sono visibili crioprecipitati, farli sedimentare per
centrifugazione a circa 6800 x g per 3 minuti. Aspirare e processare
immediatamente il sovranatante limpido, senza toccare il pellet.
Evitare la creazione di bolle grandi, poiché potrebbero interferire con il
sistema di rilevamento del liquido.
2. Assicurarsi che la stazione di lavoro BioRobot MDx sia accesa.
L’interruttore è posizionato in basso a destra sul pannello frontale della
stazione di lavoro BioRobot MDx DSP.
3. Accendere il computer e il monitor.
4. Avviare il software QIAsoft MDx DSP.
Il software può essere avviato dal desktop.
5. Effettuare il login con il nome utente e la password.
Il nome utente e la password di ogni operatore possono essere definiti dal
supervisore. Per informazioni dettagliate su come assegnare un nome
utente e una password a ogni operatore, fare riferimento al Manuale utente
BioRobot MDx DSP.
6. Fare clic su
per attivare la finestra di dialogo adiacente.
Utilizzare il lettore di codice a barre manuale per effettuare la
scansione del codice a barre della Q-Card in tale campo.
Per ogni protocollo, sull’etichetta della Q-Card è stampato un codice a
barre. Dopo aver eseguito la scansione del codice a barre appropriato, il
protocollo è selezionato automaticamente.
Assicurarsi di scegliere il protocollo appropriato. Scegliere il codice a
barre superiore per il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1), con
lavaggio AW1. Scegliere il codice a barre inferiore per il protocollo
QIAamp DSP 96 Virus MDx, senza lavaggio AW1.
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
37
Il codice a barre della Q-Card contiene informazioni sul numero di
materiale, sul numero di lotto e sulla data di scadenza dei reagenti. Queste
informazioni e il protocollo scelto saranno registrati in un file di risultati
generato per ogni esecuzione.
per avviare il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx.
7. Fare clic su
8. Scegliere se inserire un ID specifico dell’utente per l’esecuzione del
protocollo.
Se si sceglie questa opzione, appare una finestra di dialogo per
l’immissione di un ID specifico utilizzando esclusivamente lettere e numeri
(l’ID deve essere univoco e non può essere utilizzato nuovamente). Alla fine
dell’esecuzione del protocollo, il software crea dei file di risultati il cui nome
sarà lo specifico ID inserito. I contenuti di tali file saranno gli stessi di quelli
dei file di risultati predefiniti.
9. Attenersi alle istruzioni sullo schermo per impostare il tavolo di lavoro.
Per i passaggi rimanenti necessari per impostare la stazione di lavoro
BioRobot MDx (vedere pagina 41), è possibile scegliere di essere guidati da
una serie di messaggi visualizzati o da una tabella di riferimento. L’ultima
opzione dovrebbe essere scelta solo da utenti esperti.
Versare con attenzione il tampone di lisi (AL) contenente l’RNA carrier
(e il controllo interno opzionale) nel recipiente monouso (DT) al fine di
evitare la creazione di bolle grandi che potrebbero interferire con il sistema
di rilevamento del liquido.
Quando il coperchio del tavolo di lavoro è bloccato, il sistema BioRobot
MDx DSP controlla che ogni componente necessario per il protocollo sia in
posizione e che sia possibile leggere i codici a barre. Se viene rilevato un
errore (per es., manca un componente o il volume di un reagente è troppo
basso), la stazione di lavoro si arresta e un messaggio suggerisce di
ricontrollare attentamente la causa dell’errore. Seguire i passaggi
dettagliati in ogni messaggio prima di continuare.
38
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Se non è stato possibile leggere alcuni codici a barre, appare la finestra di
dialogo seguente:
I campioni non identificati sono evidenziati in rosso. Dopo aver corretto la
causa dell’errore di lettura dei codici a barre, fare clic su Scan Again
(Nuova scansione) per eseguire nuovamente la scansione di tutti i codici a
barre oppure su Scan Failed Positions Manually (Scansione manuale
posizioni non riuscite) per eseguire solo la scansione dei codici a barre dei
campioni non identificati. Se si seleziona Scan Failed Positions Manually,
appare la finestra di dialogo seguente:
Eseguire la scansione di ogni codice a barre utilizzando il lettore di codici a
barre manuale oppure digitare il numero di ogni codice a barre. Quando si
digitano i numeri dei codici a barre, ogni codice a barre deve essere inserito
due volte.
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
39
Quando il protocollo ha superato il controllo di caricamento, completerà il
processo di purificazione senza interruzioni.
10. Il sistema BioRobot MDx DSP genera file di risultati.
Una volta completata l’esecuzione, sono generati due file di risultati che
riassumono tutti i dati rilevanti per l’esecuzione. I file sono salvati
automaticamente in formato .rtf e .csv nella directory predefinita
C:\Programmi\QIAsoft MDx DSP\UserData\ReportData. Il nome del
file è il codice a barre di identificazione delle microprovette di eluizione CL
(EMT) elaborate. Inoltre, i codici a barre sono salvati con un nome file
specifico dell’utente se è stata scelta l’opzione all’inizio del protocollo: tali
file sono salvati nella stessa directory predefinita. Il contenuto dei 4 file è lo
stesso (vedere l’esempio a pagina 61 e la Tabella 14 a pagina 62).
11. Pulire la stazione di lavoro BioRobot MDx.
Il software mostra una serie di messaggi che guidano l’utente attraverso i
passaggi della procedura di pulizia (vedere pagina 41).
40
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Appendice A: messaggi visualizzati
Di seguito sono elencati i messaggi visualizzati dal protocollo del software
durante l’impostazione e la pulizia del tavolo di lavoro (passaggi 9 e 11).
I numeri dei messaggi elencati di seguito corrispondono ai numeri dei
messaggi visualizzati dal software.
Nota: alcuni dei messaggi elencati di seguito potrebbero non apparire durante
l’esecuzione del protocollo (per es., messaggi di errore).
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Azioni/commenti
Errore
1. You scanned or entered the
Assicurarsi di utilizzare il kit
wrong Q-Card bar code (È stata QIAamp DSP 96 Virus MDx.
eseguita la scansione o è stato
inserito il codice a barre Q-Card
non corretto). The protocol can
only be stopped (Il protocollo
sarà interrotto).
Errore
2. The QIAGEN kit has exceeded
È stato utilizzato un kit
the expiration date (Il kit
QIAamp DSP 96 Virus
QIAGEN ha superato la data di MDx scaduto.
scadenza). The protocol can only
be stopped (Il protocollo sarà
interrotto).
Guida
3. Do you want to enter a specific
run ID? (Si desidera inserire un
ID esecuzione specifico?) A result
file will be generated with the
name of the entered run ID (Sarà
generato un file di risultati con il
nome dell’ID esecuzione
inserito).
Guida
4. Please enter a specific run ID
(Inserire un ID esecuzione
specifico).
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
41
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Errore
5. You did not enter a specific
run ID (Non è stato inserito un
ID esecuzione specifico). No
separate result files with your run
ID will be generated (Non
saranno generati file di risultati
separati con l’ID esecuzione).
Guida
6. Disconnect the tubing of the
system liquid container and
remove the lid (Scollegare i tubi
del contenitore del liquido di
sistema e rimuovere il coperchio).
Refill the container with deionized
water (Riempire il contenitore con
acqua deionizzata). Close the lid
and reconnect the tubing
(Chiudere il coperchio e
ricollegare i tubi).
Errore
7. The system liquid container
sensor is defective or incorrectly
adjusted (Il sensore del
contenitore del liquido di sistema
è difettoso o non regolato
correttamente). The protocol can
only be stopped (Il protocollo
sarà interrotto).
Guida
8. Disconnect the tubing of the
waste container and remove
the lid (Scollegare i tubi del
contenitore dei rifiuti e
rimuovere il coperchio).
Empty the container (Svuotare il
contenitore). Close the lid and
reconnect the tubing (Chiudere il
coperchio e ricollegare i tubi).
42
Azioni/commenti
Se si desiderava inserire
un ID esecuzione specifico,
interrompere il protocollo
e riavviarlo.
Riprovare con un
contenitore di liquido di
sistema pieno o rivolgersi
al servizio di assistenza
QIAGEN.
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Errore
9. The waste container sensor is
defective or incorrectly adjusted
(Il sensore del contenitore dei
rifiuti è difettoso o non regolato
correttamente). The protocol can
only be stopped (Il protocollo
sarà interrotto).
Guida
10. Disconnect the tubing of the
vacuum trap and the condensate
trap (Scollegare i tubi della
trappola del vuoto e della
trappola di condensa). Remove
the lid of the vacuum trap
(Rimuovere il coperchio della
trappola del vuoto). Empty both
traps (Svuotare entrambe le
trappole). Close the vacuum trap
lid and reconnect the tubing
(Chiudere il coperchio
della trappola del vuoto e
ricollegare i tubi).
Errore
11. The vacuum trap sensor is
defective or incorrectly adjusted
(Il sensore della trappola del
vuoto è difettoso o non regolato
correttamente). The protocol can
only be stopped (Il protocollo
sarà interrotto).
Guida
12. Attach a new tip-disposal bag
(Inserire una nuova borsa di
smaltimento dei puntali).
Guida
13. Do you want to be guided by the
wizard to set up the worktable?
(Usare la procedura guidata per
impostare il tavolo di lavoro?)
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
Azioni/commenti
Riprovare con un
contenitore di rifiuti vuoto
o rivolgersi al servizio di
assistenza QIAGEN.
Riprovare con una
trappola del vuoto vuota o
rivolgersi al servizio di
assistenza QIAGEN.
43
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Guida
14. Reconstitute wash buffer 1 (AW1)
and wash buffer 2 (AW2)
according to the instruction on
the bottle label (Ricostituire il
tampone di lavaggio 1 (AW1) e
il tampone di lavaggio 2 (AW2)
seguendo le istruzioni
sull’etichetta del flacone). Fill the
ethanol bottle (BOT) with 350 ml
100% ethanol, and add 350 μl
reconstituted wash buffer 2 (AW2)
(for a final 1/1000 dilution of
AW2) (Riempire il flacone di
etanolo (BOT) con 350 ml
etanolo al 100% e aggiungere
350 μl di tampone di lavaggio 2
(AW2) ricostituito (per una
diluizione finale 1/1000 di
AW2)).
Guida
15. Place open bottles of wash
buffer 1 (AW1), wash buffer 2
(AW2), and ethanol into
compatible slots in the reagent
carousel (Posizionare i flaconi
aperti di tampone di lavaggio 1
(AW1), tampone di lavaggio 2
(AW2) ed etanolo in
alloggiamenti compatibili nel
carosello dei reagenti). Ensure
that the bar codes face outward
(Assicurarsi che i codici a barre
siano rivolti verso l’esterno).
Place the system liquid bottle
filled with a minimum of 700 ml
deionized water into the reagent
carousel (Posizionare il flacone
di liquido di sistema riempito con
almeno 700 ml di acqua
deionizzata nel carosello dei
reagenti).
44
Azioni/commenti
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Guida
16. Place the black multiwell-plate
holder onto the worktable
(Posizionare il portapiastra a
pozzetti multipli nero sul tavolo
di lavoro).
Place the black channeling
adapter into this holder
(Posizionare l’adattare di
canalizzazione nero in questo
contenitore).
Guida
17. Place a silver multiwell-plate
holder onto the worktable
(Posizionare un portapiastra a
pozzetti multipli argentato sul
tavolo di lavoro).
Place a QIAamp 96 plate into this
holder (Posizionare la piastra
QIAamp 96 in questo
contenitore).
Make sure well A1 is orientated to
the left and the bar code faces
toward the right (Assicurarsi che il
pozzetto A1 sia orientato verso
sinistra e che il codice a barre sia
rivolto a destra).
Guida
18. Place a new S-Block onto the heat
transfer adapter in the cooling
and heating system (Posizionare
un S-Block nuovo sull’adattatore
di trasferimento del calore nel
sistema di riscaldamento e
raffreddamento). Make sure well
A1 is orientated to the left
(Assicurarsi che il pozzetto A1 sia
orientato verso sinistra).
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
Azioni/commenti
45
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Guida
19. Place the vacuum manifold lid
onto the slot that is to the right of
the vacuum manifold base
(Posizionare il coperchio
dell’apparato da vuoto
sull’alloggiamento a destra della
base dell’apparato stesso). Place
the vacuum manifold top above
the vacuum manifold lid
(Posizionare il tappo
dell’apparato da vuoto sopra il
coperchio dell’apparato stesso).
Guida
20. Pull the tip-tray drawer outwards
(Aprire il cassetto del vassoio dei
puntali tirando verso l’esterno).
Place red tip trays with 1100 μl
disposable tips into the red tiptray holders 1, 2, 4–8
(Posizionare i vassoi dei puntali
rossi con 1100 μl di puntali
monouso negli appositi supporti
per puntali rossi 1, 2, 4–8).
Guida
21. Reconstitute QIAGEN Protease
(QP) as described in the
QIAGEN kit handbook
(Ricostituire la proteasi QIAGEN
(QP) come descritto nel manuale
del kit QIAGEN). Mix carefully
(Miscelare con cura). Place the
open bottle containing a
minimum of 6 ml reconstituted
QIAGEN Protease (QP) into the
reagent holder for 1 bottle (QP)
(Posizionare il flacone aperto
contenente un minimo di 6 ml di
proteasi QIAGEN (QP)
ricostituita nel portareagente
per 1 flacone (QP)).
46
Azioni/commenti
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Guida
22. Into the reagent holder for
2 troughs, load 2 disposable
troughs (DT) (Nel portareagente
per 2 recipienti, caricare 2
recipienti monouso (DT)). Place
the reagent holder into MP Slot 2
(Posizionare il portareagente
nella fessura 2 MP). Ensure AL is
on the left and EtOH is on the
right (Assicurarsi che l’AL sia a
sinistra e che l’EtOH sia a destra).
Guida
23. Prepare a bottle of lysis buffer
(AL) with carrier RNA and internal
control (refer to the QIAGEN kit
handbook) (Preparare un flacone
di tampone di lisi (AL) con RNA
carrier e controllo interno (fare
riferimento al manuale del kit
QIAGEN)). Carefully transfer the
contents of the bottle into the
trough at position AL in order
to avoid creating large air
bubbles (Trasferire con attenzione
i contenuti del flacone nel
recipiente nella posizione AL al
fine di evitare la creazione di
grandi bolle d’aria).
Guida
24. Place 8 new microtubes each
containing 2 ml elution buffer
(AVE) into the reagent holder for
microtubes and trough (position
AVE) (Posizionare 8 microprovette
nuove, ognuna contenente 2 ml
di tampone di eluizione (AVE) nel
portareagente per microprovette
e recipiente (posizione AVE)).
Remove the caps from the tubes
(Rimuovere i tappi dalle provette).
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
Azioni/commenti
47
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Guida
25. Place 4 microtubes each
containing 1.4 ml elution fluid
(TOPE) into the reagent holder
for microtubes and trough
(position TOPE) (Posizionare
4 microprovette nuove, ognuna
contenente 1,4 ml di fluido
di eluizione (TOPE) nel
portareagente per microprovette
e recipiente (posizione TOPE)).
Remove the caps from the tubes
(Rimuovere i tappi dalle provette).
Guida
26. Place an Elution Microtubes CL
(EMT) onto the elution microtube
adapter (Posizionare le
microprovette di eluizione CL
(EMT) sull’adattatore di
microprovette di eluizione).
Place the assembly onto the
reagent holder for microtubes
and trough (Posizionare
l’insieme sul portareagente
per microprovette e recipiente).
Make sure the bar code faces
toward the right (Assicurarsi
che il codice a barre sia rivolto
a destra).
Guida
27. Attention (Attenzione): The robotic
arm moves to the right if you click
“Next”! (il braccio robotico si
muove verso destra se si fa clic
su “Next” [Successivo].)
Guida
28. Remove the sample protection
shield (Rimuovere lo schermo
protettivo dei campioni). Place
open tubes containing samples
into the tube holders (Posizionare
le provette aperte contenenti i
campioni nei portaprovette).
48
Azioni/commenti
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Azioni/commenti
Guida
29. Load all 12 tube holders into the
sample tracking system (Caricare
tutti i 12 portaprovette nel
sistema di monitoraggio dei
campioni).
Ensure the sample bar codes face
towards the left (Assicurarsi che i
codici a barre dei campioni
siano rivolti verso sinistra).
Replace the sample protection
shield (Sostituire lo schermo
protettivo dei campioni).
Guida
30. Summary table for worktable
setup (Tabella riassuntiva
dell’impostazione del tavolo di
lavoro). Use the slider to move
the robotic arm for easy access to
all positions (Utilizzare il cursore
per spostare il braccio robotico
per un facile accesso a tutte le
posizioni).
Guida
31. Close the worktable hood
(Chiudere il coperchio del
tavolo di lavoro).
Click “Continue” to start the load
check (Fare clic su “Continue”
[Continua] per avviare il controllo
di caricamento).
Errore
32. The worktable hood is not closed Seguire le istruzioni sullo
(Il coperchio del tavolo di lavoro schermo.
non è chiuso). Slide the worktable
hood down until it clicks (Far
scorrere il coperchio del tavolo di
lavoro fino a sentire uno scatto).
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
49
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Azioni/commenti
Errore
33. The worktable hood is not closed
or the worktable hood lock is
defective (Il coperchio del tavolo
di lavoro non è chiuso o la
chiusura del coperchio è
difettosa). The protocol can only
be stopped (Il protocollo sarà
interrotto).
Errore
34. The reagent carousel door is not Seguire le istruzioni sullo
closed (Lo sportello del carosello schermo.
dei reagenti non è chiuso). Close
the reagent carousel door
(Chiudere lo sportello del
carosello dei reagenti).
Errore
35. The reagent carousel door is not
closed or the reagent carousel
door lock is defective (Lo sportello
del carosello dei reagenti non è
chiuso o la chiusura dello
sportello è difettosa). The
protocol can only be stopped
(Il protocollo sarà interrotto).
Riprovare con lo sportello
del rotore chiuso o
rivolgersi al servizio di
assistenza QIAGEN.
Errore
36. The chosen protocol does not
match the QIAamp 96 plate
used (Il protocollo scelto non
corrisponde alla piastra
QIAamp 96 utilizzata).
The protocol can only be stopped
(Il protocollo sarà interrotto).
Assicurarsi di utilizzare il
kit QIAamp DSP 96 Virus
MDx e di scegliere il
protocollo corretto.
Errore
37. Place the system liquid bottle
Seguire le istruzioni sullo
filled with a minimum of 700 ml schermo.
deionized water into the reagent
carousel (Posizionare il flacone di
liquido di sistema riempito con
almeno 700 ml di acqua
deionizzata nel carosello
dei reagenti).
50
Riprovare con il coperchio
del tavolo di lavoro chiuso
o rivolgersi al servizio di
assistenza QIAGEN.
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Azioni/commenti
Errore
38. Fill the ethanol bottle (BOT) with
350 ml ethanol (96–100%), and
add 350 μl reconstituted wash
buffer 2 (AW2) (for a final
1/1000 dilution of AW2)
(Riempire il flacone di etanolo
(BOT) con 350 ml etanolo
(96–100%) e aggiungere 350 μl
di tampone di lavaggio 2 (AW2)
ricostituito (per una diluizione
finale 1/1000 di AW2)).
Seguire le istruzioni sullo
schermo.
Errore
39. Place a tip tray containing
1100 μl disposable tips into
tip-tray holder 1 (Posizionare un
vassoio per puntali contenente
1100 μl di puntali monouso nel
portavassoio 1).
Seguire le istruzioni sullo
schermo.
Errore
40. Place a tip tray containing
1100 μl disposable tips into
tip-tray holder 2 (Posizionare un
vassoio per puntali contenente
1100 μl di puntali monouso nel
portavassoio 2).
Seguire le istruzioni sullo
schermo.
Errore
41. Place a tip tray containing
1100 μl disposable tips into
tip-tray holder 4 (Posizionare un
vassoio per puntali contenente
1100 μl di puntali monouso nel
portavassoio 4).
Seguire le istruzioni sullo
schermo.
Errore
42. Place a tip tray containing
1100 μl disposable tips into
tip-tray holder 5 (Posizionare un
vassoio per puntali contenente
1100 μl di puntali monouso nel
portavassoio 5).
Seguire le istruzioni sullo
schermo.
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
51
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Azioni/commenti
Errore
43. Place a tip tray containing
1100 μl disposable tips into
tip-tray holder 6 (Posizionare un
vassoio per puntali contenente
1100 μl di puntali monouso nel
portavassoio 6).
Seguire le istruzioni sullo
schermo.
Errore
44. Place a tip tray containing
1100 μl disposable tips into
tip-tray holder 7 (Posizionare un
vassoio per puntali contenente
1100 μl di puntali monouso nel
portavassoio 7).
Seguire le istruzioni sullo
schermo.
Errore
45. Place a tip tray containing
1100 μl disposable tips into
tip-tray holder 8 (Posizionare un
vassoio per puntali contenente
1100 μl di puntali monouso nel
portavassoio 8).
Seguire le istruzioni sullo
schermo.
Errore
46. Place an Elution Microtubes CL
(EMT) with lid onto the elution
microtube adapter (Posizionare
una microprovetta di eluizione
CL (EMT) con coperchio
sull’adattatore per microprovette
di eluizione). Then place the
assembly onto MP Slot 3
(Posizionare quindi l’insieme
nella fessura 3 MP).
Seguire le istruzioni sullo
schermo.
Errore
47. Make sure the bar code of the
Elution Microtubes CL (EMT)
faces toward the right
(Assicurarsi che il codice a barre
delle microprovette di eluizione
CL (EMT) sia rivolto verso
destra).
Seguire le istruzioni sullo
schermo.
52
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Azioni/commenti
Errore
48. Fill the wash buffer 1 (AW1)
Seguire le istruzioni sullo
bottle in the reagent carousel with schermo.
164 ml buffer AW1 (Riempire il
flacone del tampone di
lavaggio 1 (AW1) nel carosello
dei reagenti con 164 ml di
tampone AW1). Place the bottle
back into the reagent carousel
and ensure that the bar code
faces outward (Riposizionare il
flacone nel carosello dei reagenti
con il codice a barre rivolto verso
l’esterno). Close the reagent
carousel door properly (Chiudere
correttamente lo sportello del
carosello dei reagenti).
Errore
49. Fill the wash buffer 2 (AW2)
Seguire le istruzioni sullo
bottle in the reagent carousel with schermo.
191 ml buffer AW2 (Riempire il
flacone del tampone di
lavaggio 2 (AW2) nel carosello
dei reagenti con 191 ml di
tampone AW2). Place the bottle
back into the reagent carousel
and ensure that the bar code
faces outward (Riposizionare il
flacone nel carosello dei reagenti
con il codice a barre rivolto verso
l’esterno). Close the reagent
carousel door properly (Chiudere
correttamente lo sportello del
carosello dei reagenti).
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
53
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Azioni/commenti
Errore
50. Place an empty disposable
trough (DT) into the reagent
holder for 2 troughs (position
EtOH) (Posizionare un recipiente
monouso (DT) vuoto nel
portareagente per 2 recipienti
(posizione EtOH)). Fill the trough
with 10 ml ethanol (Riempire il
recipiente con 10 ml di etanolo).
Seguire le istruzioni sullo
schermo.
Errore
51. The cooling and heating system
failed to reach the required
temperature (Il sistema di
riscaldamento e raffredamento
non è riuscito a raggiungere la
temperatura necessaria). The
protocol can only be stopped
(Il protocollo sarà interrotto).
Riprovare o rivolgersi al
servizio di assistenza
QIAGEN.
Errore
52. The high-speed dispensing
system or the liquid detection
system is defective and/or not
adjusted within specifications
(Il sistema di erogazione ad alta
velocità o il sistema di
rilevamento del liquido è
difettoso e/o non regolato
secondo le specifiche). The
protocol can only be stopped
(Il protocollo sarà interrotto).
Riprovare o rivolgersi al
servizio di assistenza
QIAGEN.
Errore
53. The vacuum manifold failed to
reach the required temperature
(L’apparato da vuoto non è
riuscito a raggiungere la
temperatura necessaria). The
protocol can only be stopped
(Il protocollo sarà interrotto).
Riprovare o rivolgersi al
servizio di assistenza
QIAGEN.
54
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Errore
54. The vacuum manifold failed to
reach the required pressure
(L’apparato da vuoto non è
riuscito a raggiungere la
pressione necessaria). The
protocol can only be stopped
(Il protocollo sarà interrotto).
Guida
55. Sample preparation ended
at <Time (hh:mm)> (La
preparazione dei campioni è
terminata alle <ora (hh:mm)>).
Remove the Elution Microtubes
CL (EMT) containing eluates
from the reagent holder
for microtubes and trough
(Rimuovere le microprovette di
eluizione CL (EMT) contenenti
eluati dal portareagente per
microprovette e recipiente).
Guida
56. Discard the AVE and TOPE
microtubes (Smaltire le
microprovette AVE e TOPE).
Discard the QP bottle (Smaltire
il flacone QP).
Guida
57. Discard the EtOH and AL
troughs (Smaltire i recipienti
EtOH e AL).
Discard the tip trays (Smaltire i
vassoi dei puntali).
Discard the S-Block (Smaltire
l’S-Block).
Discard the QIAamp 96 plate
(Smaltire la piastra QIAamp 96).
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
Azioni/commenti
Riprovare o rivolgersi al
servizio di assistenza
QIAGEN.
55
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Guida
58. Remove the channeling adapter,
both multiwell-plate holders
(black and silver), and the elution
microtube adapter (blue)
(Rimuovere l’adattatore di
canalizzazione, entrambi i
portapiastra a pozzetti multipli
(nero e argentato) e l’adattatore
per microprovette di eluizione
(blu)). Submerge them all in
disinfectant (Immergerli in
disinfettante).
Submerge the adapters/holders
in deionized water (Immergere gli
adattatori/recipienti in acqua
deionizzata). Dry with a lint free
paper towel (Asciugare con un
panno di carta che non lasci
pelucchi).
Guida
59. Remove the system liquid bottle
from the reagent carousel and
pour system liquid over the
heating plate in the vacuum
manifold base (Rimuovere il
flacone del liquido di sistema dal
carosello dei reagenti e versare il
liquido di sistema sulla piastra di
riscaldamento nella base
dell’apparato da vuoto).
Ensure that the plate is completely
covered with system liquid
(Assicurarsi che la piastra sia
coperta completamente con il
liquido di sistema).
56
Azioni/commenti
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Guida
60. Click “Continue” to remove
system liquid from the vacuum
manifold base (Fare clic su
“Continue” [Continua] per
rimuovere il liquido di sistema
dalla base dell’apparato da
vuoto).
While liquid is leaving the vacuum
manifold base, continue to empty
the system liquid bottle over the
heating plate (Mentre il liquido sta
uscendo dalla base dell’apparato
da vuoto, continuare a svuotare il
flacone del liquido di sistema
sulla piastra di riscaldamento).
Guida
61. Replace the caps on the bottles
in the reagent carousel if no
subsequent protocol run will be
performed (Riposizionare i tappi
sui flaconi nel carosello dei
reagenti se non sarà eseguito un
altro protocollo).
Guida
62. Attention (Attenzione): The robotic
arm moves to the right if you click
“Continue” (Il braccio robotico si
muove verso destra se si fa clic su
“Continue” [Continua]).
Guida
63. Discard the sample tubes (Smaltire
le provette dei campioni).
Guida
64. Empty the tip-disposal bag
(Svuotare la borsa di smaltimento
dei puntali).
Guida
65. Protocol finished! (Protocollo
concluso.)
The result files are saved in the
folder <name of folder> (I file
dei risultati sono salvati nella
cartella <nome della cartella>).
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
Azioni/commenti
57
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Azioni/commenti
Errore
66. Wash buffer 1 (AW1) has
expired (Il tampone di
lavaggio 1 (AW1) è scaduto).
Remove the AW1 bottle from the
reagent carousel and replace it
with a new one (Rimuovere il
flacone AW1 dal carosello dei
reagenti e sostituirlo con un
flacone nuovo). Ensure that the
new bottle is open and the bar
code faces outward (Assicurarsi
che il nuovo flacone sia aperto e
che il codice a barre sia rivolto
verso l’esterno). Close the
reagent carousel door (Chiudere
lo sportello del carosello dei
reagenti).
Seguire le istruzioni sullo
schermo.
Errore
67. Wash buffer 2 (AW2) has
expired (Il tampone di
lavaggio 2 (AW2) è scaduto).
Remove the AW2 bottle from the
reagent carousel and replace it
with a new one (Rimuovere il
flacone AW2 dal carosello dei
reagenti e sostituirlo con un
flacone nuovo). Ensure that the
new bottle is open and the bar
code faces outward (Assicurarsi
che il nuovo flacone sia aperto e
che il codice a barre sia rivolto
verso l’esterno). Close the
reagent carousel door (Chiudere
lo sportello del carosello dei
reagenti).
Seguire le istruzioni sullo
schermo.
58
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Tipo di
messaggio
Testo del messaggio
Guida
68. Reconstitute wash buffer 2 (AW2)
according to the instruction on
the bottle label (Ricostituire il
tampone di lavaggio 2 (AW2)
seguendo le istruzioni
sull’etichetta del flacone). Fill the
ethanol bottle (BOT) with a
minimum of 350 ml ethanol
(96–100%), and add 350 μl
reconstituted wash buffer 2 (AW2)
(for a final 1/1000 dilution of
AW2) (Riempire il flacone di
etanolo (BOT) con un minimo di
350 ml di etanolo (96–100%) e
aggiungere 350 μl di tampone
di lavaggio 2 (AW2) ricostituito
(per una diluizione finale
1/1000 di AW2)).
Guida
69. Place open bottles of wash
buffer 2 (AW2), and ethanol into
compatible slots in the reagent
carousel (Posizionare i flaconi
aperti di tampone di lavaggio 2
(AW2) ed etanolo in
alloggiamenti compatibili nel
carosello dei reagenti). Ensure
that the bar codes face outward
(Assicurarsi che i codici a barre
siano rivolti verso l’esterno).
Place the system liquid bottle filled
with a minimum of 700 ml
deionized water into the reagent
carousel (Posizionare il flacone di
liquido di sistema riempito con
almeno 700 ml di acqua
deionizzata nel carosello
dei reagenti).
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
Azioni/commenti
59
Tipo di
messaggio
Errore
60
Testo del messaggio
Azioni/commenti
70. There are not enough 1100 μl
disposable tips for this protocol
run (Non ci sono puntali
monouso da 1100 μl sufficienti
per l’esecuzione di questo
protocollo). Place red tip trays
containing 1100 μl tips into red
tip-tray holders 1, 2, 4–8
(Posizionare i vassoi dei puntali
rossi con puntali da 1100 μl nei
supporti 1, 2, 4–8).
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Appendice B: file dei risultati*
Operatore:
Data: AAAA MM GG
Ora d’inizio: HH:MM:SS
Ora dell’esecuzione:
Nome del kit:
Numero di campioni elaborati:
Codice a barre di microprovette di eluizione CL (EMT):
ID esecuzione specificato dall’utente:
Codice a barre Q-Card:
Numero di catalogo del kit:
Numero di lotto del kit:
Data di scadenza del kit: AAAA MM GG
ID BioRobot MDx:
Versione QIAsoft MDx DSP:
Versione protocollo:
Codice a barre selezionato dal supervisore: Predefinito/Codice a barre univoco/
Codice a barre non univoco†
Nome file registro messaggi:
Nome file registro referti:
Codici a barre inseriti manualmente: nessun codice a barre inserito manualmente†
Controllo tecnico del processo: RIUSCITO/NON RIUSCITO†
Manutenzione: gli interventi di manutenzione richiesti non sono stati eseguiti prima
dell’esecuzione del protocollo/Manutenzione eseguita†
Codice a barre e tabella dei risultati:
Posizione
Codice a barre
Risultato (1 = valido, 0 = non valido)
…
…
A1
B1
C1
D1
…
E12
F12
G12
H12
* I campi in questo file di risultati sono vuoti. Il sistema operativo QIAsoft MDx DSP riempie
questi campi alla fine dell’esecuzione del protocollo.
†
Il testo che appare in questo campo dipende da ciò che succede durante l’esecuzione del
protocollo.
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
61
Tabella 14. Spiegazione degli errori nel file dei risultati
Errore
Possibile causa
Campione indicato
come non valido
(invalid)
Durante l’aspirazione del campione dalla
provetta, non è stato possibile leggere il
codice a barre. Non è stato trasferito alcun
campione all’S-Block.
Durante l’aspirazione del campione dalla
provetta, non è stato possibile rilevare alcun
campione.
Durante l’aspirazione del campione dalla
provetta, è stato rilevato un grumo.
I crioprecipitati hanno impedito il trasferimento
del volume corretto di campione dalla provetta
all’S-Block.
Dopo il trasferimento del campione, non è
stato rilevato campione sufficiente nell’S-Block.
La riga nella colonna
“Result” (Risultato)
è vuota
62
Si è verificato un errore di elaborazione durante la
preparazione del campioni. Il protocollo è stato
interrotto.
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Appendice C: calcolo della quantità di controllo interno
Per monitorare l’efficienza della preparazione dei campioni e del test
downstream, al tampone di lisi (AL) viene aggiunto un controllo interno, fornito
con il test diagnostico downstream. Per calcolare la quantità del controllo
interno necessario nei protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx, deve essere
considerata la quantità di tampone di lisi (AL) e di volume dell’eluato.
Determinare quanto controllo interno ci sarà nelle reazioni downstream
Per determinare il volume di controllo interno che sarà presente nel test
successivo, utilizzare la formula:
ICRXN =
ICAL x ALSAM x ELRXN
(ALTOT + ICAL) x ELSAM
dove:
ICRXN
= Volume di controllo interno per reazione downstream
ICAL
= Volume di controllo interno aggiunto al tampone di lisi (AL)
ALSAM
= Volume di tampone di lisi (AL) per campione
ELRXN
= Volume di eluato per reazione downstream
ALTOT
= Volume totale di tampone di lisi (AL) utilizzato nel protocollo
ELSAM
= Volume di eluato per campione
Come esempio, l’Utente 1 ha aggiunto 300 μl di soluzione di controllo interno
(ICAL) a un tampone di lisi da 33 ml (ALTOT). Utilizzando la procedura standard, ci
sono 275 μl di tampone di lisi per campione (ALSAM) e il volume di eluizione è di
83 μl (ELSAM). L’utente 1 utilizza 50 μl di eluato per reazione successiva (ELRXN). Il
volume della soluzione di controllo interno in ogni reazione successiva (ICRXN) è:
ICRXN =
300 μl x 275 μl x 50 μl
(33.000 μl + 300 μl) x 83 μl
= 1,49 μl
Le reazioni downstream finali conterranno 1,49 μl di soluzione di controllo
interno per reazione.
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
63
Determinazione della quantità di soluzione di controllo interno da
aggiungere prima di iniziare
In alternativa, se si conosce la quantità di controllo interno che si desidera sia
presente nel test downstream (ICRXN), occorre determinare la quantità da
aggiungere al tampone di lisi prima di iniziare la purificazione (ICAL). Per
calcolare tale valore, utilizzare la formula seguente:
ICAL =
ICRXN x ALTOT x ELSAM
(ALSAM x ELRXN) – (ICRXN x ELSAM)
Come esempio, si supponga che l’utente 2 stia lavorando con un test
diagnostico che è convalidato per l’utilizzo con 2,0 μl di soluzione di controllo
interno per reazione (ICRXN) e 40 μl di eluato per reazione (ELRXN). L’utente 2
segue un protocollo con 1000 μl di tampone di lisi per campione (ALSAM) e un
volume di eluizione di 120 μl (ELSAM). La quantità di soluzione di controllo
interno (ICAL) che l’utente 2 deve aggiungere al tampone di lisi di 33,0 ml
(ALTOT) è:
ICAL =
2,0 μl x 33.000 μl x 120 μl
(1.000 μl x 40 μl) – (2,0 μl x 120 μl)
= 199 μl
L’utente 2 deve aggiungere 199 μl di soluzione di controllo interno a un
tampone di lisi da 33 ml (AL) prima della purificazione.
64
Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004
Pagina lasciata vuota intenzionalmente.
Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004
65
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Abdulla Fouad Co. Ltd.
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(03) 8324400
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(03) 8346174
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Danimarca
VWR International A/S
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Argentina
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(011) 4555 0010
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(011) 4553 3331
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Egitto
Clinilab
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Austria
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(01) 576 00 600
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Brasile
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Cile
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562 274 5462
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Cina
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(852)2515-9371
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Shanghai:
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Chengdu:
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Cipro
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(02) 924-86 96
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Croazia
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(01) 2984-898
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(01) 6520-966
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66
Nuova Zelanda
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52 57 210
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Messico
Quimica Valaner S.A. de C.V.
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Sud Africa
Southern Cross Biotechnology
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Norvegia
VWR International AS
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Taiwan
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Svezia
VWR International AB
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Australia QIAGEN Pty Ltd PO Box 641 DONCASTER VIC 3108
Ordini 03-9840-9800 Fax 03-9840-9888 Ass. tecnica 1-800-243-066
Belgio QIAGEN Benelux B.V. Spoorstraat 50 5911 KJ Venlo The Netherlands
Ordini 0800-79612 Fax 0800-79611 Ass. tecnica 0800-79556
Canada QIAGEN Inc. 2800 Argentia Road Unit 7 Mississauga Ontario L5N 8L2
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Francia QIAGEN S.A. 3 avenue du Canada LP 809 91974 COURTABOEUF CEDEX
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Germania QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse 1 40724 Hilden
Ordini 02103-29-12000 Fax 02103-29-22000 Ass. tecnica 02103-29-12400
Giappone QIAGEN K.K. Forefront Tower II 13-1, Kachidoki 3 Chome Chuo-ku, Tokyo 104-0054
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Italia QIAGEN S.p.A. Via Grosio, 10/10 20151 Milano
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