esercitazione microscopia
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Esercitazione di Microbiologia generale Microscopia I microrganismi Le cellule più primitive viventi attualmente sono i batteri questi appartengono a un gruppo di organismi chiamati procarioti (letteralmente "prima del nucleo"). Tuttavia, la maggioranza delle forme di vita (compresi alghe, funghi, piante e animali) è caratterizzata dalla presenza del nucleo e si definisce eucariota (letteralmente "con un vero nucleo"). Il microrganismi Le manifestazioni della crescita su substrato solido possono consentire di distinguerli in grandi gruppi. Il microrganismi Le cellule dei microrganismi sono troppo piccole per essere distinte ad occhio nudo. Ciò dipende sia dalle dimensioni delle cellule che dal potere di risoluzione dell’occhio umano, che nelle migliori condizioni è di 0,2 mm. Un altro aspetto importante è il contrasto dell’oggetto da visualizzare: la maggior parte delle cellule sono troppo trasparenti per essere distinte dallo sfondo. Il microscopio fotocamera o telecamera tubo oculari stativo fonte di illuminazione vite macrometrica e micrometrica revolver con obiettivi tavolino traslatore condensatore diaframma di campo Il microscopio ingrandimento Valore oculare ( generalmente 10 x) x valore obiettivo (10x;40x;100;) x fattore di tubo (generalmente 1) Il microscopio Incisioni sull’ obiettivo 40x = ingrandimento 0,6 = apertura numerica 160 = lunghezza del tubo 0,17 = spessore vetrini Il limite di risoluzione dei microscopi Il limite di risoluzione di un microscopio, cioè la minima distanza alla quale due punti possono essere visti come separati può essere calcolato con la formula: 0,5λ d= Nsenα Dove λ è la lunghezza d’onda della sorgente di luce utilizzata, N è l’indice di rifrazione del mezzo interposto fra lente e preparato e α è il semiangolo della lente dell’obiettivo Il limite di risoluzione dei microscopi Il limite di risoluzione può essere aumentato interponendo tra l’obiettivo e il preparato una sostanza che abbia un indice di rifrazione maggiore dell’ aria Obiettivo 100 X 100 X 100 X Olio di legno di cedro copriogetto portaogetto Il Preparato Il Preparato Preparato schiacciato Preparato a goccia pendente Osservazione in campo chiaro C. versatilis in campo chiaro, 1000x Osservazione in campo scuro Un particolare tipo di condensatore nell’osservazione in campo scuro consente di deviare i fasci di luce in modo che le lenti frontali dell’obiettivo siano attraversati soltanto dai raggi di luce diffratti o diffusi dal preparato. Gli oggetti appariranno chiari su uno sfondo scuro. In questo modo è possibile osservare oggetti anche al di sotto del potere di risoluzione del microscopio ottico, come fasci di flagelli Osservazione in campo scuro Microscopio elettronico a trasmissione Batteri al microscopio elettronico a trasmissione la risoluzione di un microscopio è legata principalmente alla lunghezza d’onda della radiazione utilizzata per l’osservazione. Ciò limita la risoluzione dei microscopi ottici, anche nelle condizioni migliori, a 0,2 micron. micron Utilizzando un fascio di elettroni in un sistema ad alto vuoto, focalizzato e controllato mediante lenti elettromagnetiche è possibile portare la risoluzione a dimensioni molecolari perché gli elettroni hanno una lunghezza d’onda di 0,4 nm. nm La risoluzione quindi può essere dell’ordine di 0,2 nm. nm Gli ingrandimenti possibili superano di molto 10000x Microscopio elettronico a trasmissione Batteri al microscopio elettronico a trasmissione Il limite principale è legato alla necessità di ottenere sezioni sottili (<100 nm) dei preparati fissati (disidratati, fissati con glutaraldeide o tetrossido di osmio ed immersi in una resina) a causa dello scarso potere di penetrazione degli elettroni. Microscopio elettronico a scansione SEM Nel microscopio elettronico a scansione si ottengono immagini tridimensionali; il preparato viene rivestito di un sottile film metallico (oro) e un fascio di elettroni compie una scansione del preparato; gli elettroni secondari che partono dall’oggetto vengono raccolti da uno schermo che fornisce un’immagine tridimensionale. Gli ingrandimenti vanno da 20x a 100000x. Microscopio elettronico a scansione Penicillium roquefortii Streptococcus thermophilus Il microscopio laser a scansione confocale Il microscopio laser a scansione confocale (CLSM) è un normale microscopio ottico in cui la fonte di illuminazione è un fascio laser che viene messo a fuoco con estrema precisione in un piano dell’oggetto: la luce proveniente dagli strati circostanti è minimizzata e siccome il fascio esegue scansioni verticali ed orizzontali il risultato sono immagini tridimensionali del preparato. Immagini al microscopio laser a scansione confocale Immagine di un biofilm Immagine di una comunità colorata con sonde fluorescenti specifiche per diversi gruppi di microrganismi La possibilità di applicare sonde fluorescenti specifiche per microrganismi vivi o morti, per diversi taxa, per diverse strutture cellulari e la possibilità di ottenere immagini con un minimo di preparazione rende questa tecnica estremamente potente per visualizzare i microrganismi in situ. La micrometria a Serve per la misurazione dei MO. Si hanno l’oculare micrometrico che ha una scala graduata (100 tacche) ed un vetrino micrometrico della lunghezza di un mm e ogni divisione è di 10 µm. b c 1. Osservando mediante il microscopio (a) con l’oculare micrometrico (b), si allineano gli zeri con il vetrino micrometrico (c). In questo modo si potrà stabilire quanti µm misurerà misurerà la scala ignota dell’ dell’oculare*. oculare*. 2. Una volta tarato l’ l’oculare, si toglie il vetrino micrometrico e e si posiziona il vetrino con il preparato cellulare. In questo modo è possibile determinare la dimensione dei MO (d). *la taratura cambia dell’ dell’ingrandimanto d a seconda La conta cellulare Il numero di cellule presenti in una sospensione può essere calcolato calcolato contando le cellule contenute in un volume accuratamente determinato e molto piccolo. Questa conta prevede l’utilizzo di speciali vetrini portaoggetti noti col nome di camere contacellule o camera di Thoma che presentano una zona centrale più bassa di 0,1 mm Ogni quadratino del reticolo misura 1/400 di mm2 per cui il volume sovrastante è 1/4.000.000 di cm2
