Esercitazione di Microbiologia generale
Microscopia
I microrganismi
Le cellule più primitive viventi
attualmente sono i batteri questi
appartengono a un gruppo di organismi
chiamati
procarioti
(letteralmente
"prima del nucleo").
Tuttavia, la maggioranza delle forme di
vita (compresi alghe, funghi, piante e
animali) è caratterizzata dalla presenza
del nucleo e si definisce eucariota
(letteralmente "con un vero nucleo").
Il microrganismi
Le manifestazioni della
crescita su substrato
solido possono consentire
di distinguerli in grandi
gruppi.
Il microrganismi
Le cellule dei microrganismi sono troppo piccole per
essere distinte ad occhio nudo. Ciò dipende sia dalle
dimensioni delle cellule che dal potere di risoluzione
dell’occhio umano, che nelle migliori condizioni è di
0,2 mm. Un altro aspetto importante è il contrasto
dell’oggetto da visualizzare: la maggior parte delle
cellule sono troppo trasparenti per essere distinte
dallo sfondo.
Il microscopio
fotocamera o
telecamera
tubo
oculari
stativo
fonte di
illuminazione
vite macrometrica
e micrometrica
revolver con
obiettivi
tavolino
traslatore
condensatore
diaframma
di campo
Il microscopio
ingrandimento
Valore oculare ( generalmente 10 x)
x
valore obiettivo (10x;40x;100;)
x
fattore di tubo (generalmente 1)
Il microscopio
Incisioni sull’ obiettivo
40x = ingrandimento
0,6 = apertura numerica
160 = lunghezza del tubo
0,17 = spessore vetrini
Il limite di risoluzione dei microscopi
Il limite di risoluzione di un microscopio, cioè la
minima distanza alla quale due punti possono essere
visti come separati può essere calcolato con la
formula:
0,5λ
d=
Nsenα
Dove λ è la lunghezza d’onda della sorgente di luce
utilizzata, N è l’indice di rifrazione del mezzo
interposto fra lente e preparato e α è il semiangolo
della lente dell’obiettivo
Il limite di risoluzione dei microscopi
Il limite di risoluzione può essere aumentato
interponendo tra l’obiettivo e il preparato una sostanza
che abbia un indice di rifrazione maggiore dell’ aria
Obiettivo 100 X
100 X
100 X
Olio di legno
di cedro
copriogetto
portaogetto
Il Preparato
Il Preparato
Preparato
schiacciato
Preparato a goccia
pendente
Osservazione in campo chiaro
C. versatilis in campo chiaro,
1000x
Osservazione in campo scuro
Un particolare tipo di condensatore
nell’osservazione in campo scuro
consente di deviare i fasci di luce in
modo che le lenti frontali dell’obiettivo
siano attraversati soltanto dai raggi di
luce diffratti o diffusi dal preparato.
Gli oggetti appariranno chiari su uno
sfondo scuro. In questo modo è
possibile osservare oggetti anche al di
sotto del potere di risoluzione del
microscopio ottico, come fasci di
flagelli
Osservazione in campo scuro
Microscopio elettronico a trasmissione
Batteri al microscopio elettronico a trasmissione
la risoluzione di un microscopio è legata principalmente alla lunghezza
d’onda della radiazione utilizzata per l’osservazione. Ciò limita la
risoluzione dei microscopi ottici, anche nelle condizioni migliori, a 0,2
micron.
micron Utilizzando un fascio di elettroni in un sistema ad alto vuoto,
focalizzato e controllato mediante lenti elettromagnetiche è possibile
portare la risoluzione a dimensioni molecolari perché gli elettroni hanno
una lunghezza d’onda di 0,4 nm.
nm La risoluzione quindi può essere
dell’ordine di 0,2 nm.
nm Gli ingrandimenti possibili superano di molto 10000x
Microscopio elettronico a trasmissione
Batteri al microscopio elettronico a trasmissione
Il limite principale è legato alla necessità di ottenere sezioni sottili
(<100 nm) dei preparati fissati (disidratati, fissati con glutaraldeide
o tetrossido di osmio ed immersi in una resina) a causa dello
scarso potere di penetrazione degli elettroni.
Microscopio elettronico a scansione
SEM
Nel microscopio elettronico
a scansione si ottengono
immagini tridimensionali; il
preparato viene rivestito di
un sottile film metallico
(oro) e un fascio di elettroni
compie una scansione del
preparato; gli elettroni
secondari che partono
dall’oggetto vengono
raccolti da uno schermo
che fornisce un’immagine
tridimensionale. Gli
ingrandimenti vanno da
20x a 100000x.
Microscopio elettronico a scansione
Penicillium roquefortii
Streptococcus thermophilus
Il microscopio laser a scansione confocale
Il microscopio laser a scansione confocale (CLSM) è un normale microscopio
ottico in cui la fonte di illuminazione è un fascio laser che viene messo a
fuoco con estrema precisione in un piano dell’oggetto: la luce proveniente
dagli strati circostanti è minimizzata e siccome il fascio esegue scansioni
verticali ed orizzontali il risultato sono immagini tridimensionali del
preparato.
Immagini al microscopio laser a scansione
confocale
Immagine di un biofilm
Immagine di una comunità colorata con sonde
fluorescenti specifiche per diversi gruppi di
microrganismi
La possibilità di applicare sonde fluorescenti specifiche per microrganismi
vivi o morti, per diversi taxa, per diverse strutture cellulari e la possibilità
di ottenere immagini con un minimo di preparazione rende questa tecnica
estremamente potente per visualizzare i microrganismi in situ.
La micrometria
a
Serve per la misurazione dei MO. Si
hanno l’oculare micrometrico
che ha una scala graduata (100
tacche)
ed
un
vetrino
micrometrico della lunghezza di
un mm e ogni divisione è di 10
µm.
b
c
1.
Osservando
mediante
il
microscopio (a) con l’oculare
micrometrico (b), si allineano gli
zeri con il vetrino micrometrico
(c). In questo modo si potrà
stabilire quanti µm misurerà
misurerà la
scala ignota dell’
dell’oculare*.
oculare*.
2.
Una volta tarato l’
l’oculare, si
toglie il vetrino micrometrico e e
si posiziona il vetrino con il
preparato cellulare. In questo
modo è possibile determinare la
dimensione dei MO (d).
*la
taratura
cambia
dell’
dell’ingrandimanto
d
a
seconda
La conta cellulare
Il numero di cellule presenti in una sospensione può essere calcolato
calcolato
contando le cellule contenute in un volume accuratamente
determinato e molto piccolo.
Questa conta prevede l’utilizzo
di speciali vetrini portaoggetti
noti col nome di camere
contacellule o camera di Thoma
che
presentano
una
zona
centrale più bassa di 0,1 mm
Ogni quadratino del reticolo misura 1/400 di mm2 per cui il volume
sovrastante è 1/4.000.000 di cm2
