Lezione 5

O
O
C
HO
C
Fattori biologici che influenzano
la velocità di acidificazione in matrici alimentari
H
CH3
Nei processi lattiero-caseari, la velocità di acidificazione in latte delle biomasse microbiche,
rappresenta un parametro molto importante sia per quanto riguarda il processo tecnologico, sia
per quanto riguarda l’aspetto economico. Dal punto di vista tecnologico, l’acidità gioca un ruolo
fondamentale durante la fase di coagulazione nel processo di caseificazione. L’acidificazione
operata dai batteri lattici coadiuva l’azione degli enzimi del caglio nel favorire la formazione di un
coagulo caseinico. Nello specifico, l’abbassamento di pH provoca una destabilizzazione della
carica superficiale delle micelle caseiniche e, a valori inferiori a quelli naturali del latte ( ≤ 6.6), si
ha coagulazione anche quando la lisi enzimatica della caseina non ha raggiunto i livelli massimi.
Inoltre, livelli bassi di pH migliorano l’azione degli enzimi del caglio che hanno un optimum di
attività a pH 5.5. Di contro, un eccessivo abbassamento del pH provoca una eccessiva
demineralizzazione e la formazione di un coagulo poco compatto.
Per quanto riguarda la preparazione di latti fermentati (yogurt e similari), l’acidificazione del latte
è il fattore più importante per la corretta riuscita del prodotto. In questo caso, poiché le specie di
batteri lattici coinvolte (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e Streptococcus thermophilus)
sono termofile, il processo di fermentazione è condotto a temperature di 37-42 °C. Il processo di
fermentazione a queste temperature comporta costi non trascurabili (riscaldamento di centinaia
di litri di latte) e di conseguenza la velocità di acidificazione è un importante parametro
tecnologico per la selezione e dei ceppi batterici. Oltre al settore lattiero-caseario, i batteri lattici
intervengono attivamente in altri processi produttivi come la panificazione e la preparazione di
prodotti da forno (impasti acidi). Spesso, in questi casi l’eccessiva acidificazione è, al contrario
di quanto prima descritto, un carattere negativo sia perché altera le caratteristiche sensoriali del
prodotto finito, sia perché influisce negativamente sulla vitalità di popolazioni di batteri lattici che
sono importanti per la produzione di aromi che caratterizzano il prodotto finale.
Per le ragioni suddette, tutti quei fattori che influenzano la velocità di acidificazione sono
estremamente importanti ai fini tecnologici. Tra di essi i più importanti sono la capacità di
fermentare il lattosio, l’attività ureasica, l’attività proteasica e l’attività dell’arginina deaminasi.
1
Attivazione di geni gal silenti in Streptococcus thermophilus
Organizzazione dei geni gal e lac in S. thermophilus
galR
galK
galT
galE
galM
lacS
Operone lattosio
Leloir pathway enzymes
Galattosio
Lattosio
EIIgal
EIIC
?
EIIB
Lattosio (H+)
Galattosio (H+)
lacP
galattosio (H+)
Lattosio (H+)
lacP
galP
H+
Lattosio
lat -6P
Galattosio (H+)
Lattosio
β-gal
P- β - galattosidasi
β - galattosidasi (β-gal)
Glucosio
Galattosio
ATP
ADP
D-gal -6P
G -6P
G -P
ATP
uridil transferasi
UDPgal
UDPglu
ADP
D-Tag -6P
UDP glucosio 4 - epimerasi
F -6P
ATP
ATP
ADP
ADP
TDP
lacZ
Via di LELOIR
Gal -P
galR = regolatore, (attivatore
trascrizionale dei geni
gal e lac)
galK = galattosio kinasi
galT = galattosio1 - P
uridiltransferasi
galE = UDPglucosio 4 epimerasi
galM = mutarotase,
aldoso 1 epimerasi
lacS = lattosio permeasi
lacZ = β-galattosidasi
F 1-6P
tdp aldolase
fdp aldolase
DHAP
GA -3P
trioso-P isomerase
Via del
D-TAGATOSIO -6P
Lattato
Nonostante la presenza dei geni codificanti gli enzimi del pathway di Leloir,
S. thermophilus non è in grado di utilizzare il galattosio. Solo (?) in alcune
condizioni colturali, cioè in presenza di elevate concentrazioni di galattosio e
basse concentrazioni di lattosio, è possibile selezionare ceppi Gal+. Le
analisi trascrizionali condotte sui ceppi Gal+ e sui ceppi Gal- hanno messo in
luce come in questi ultimi i livelli di trascrizione dei geni gal fossero
estremamente bassi e tali da giustificare l’assenza della via di Leloir.
2
galR
galK
galT
galE
galM
lacS
lacZ
L’analisi della sequenza della regione del promotore di galK in diversi ceppi Gal + e Gal ha messo in luce la presenza di mutazioni puntiformi in prossimità delle regioni -10 e - 35.
Queste mutazioni, che conferiscono il fenotipo Gal+ attivando la trascrizione dei geni gal,
sono di tre distinte tipologie I, II e III. La misurazione dell’attività di GalK ha evidenziato
che le mutazioni della tipologia II erano quelle che conferivano il miglior grado di
attivazione trascrizionale dei geni gal.
I ceppi Gal+sono potenzialmente più veloci nel processo di acidificazione.
3
Impiego di ceppi di Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus β-gal nella preparazione dello yogurt
Nella preparazione dello yogurt S. thermophilus e L. delbrueckii subsp. bulgaricus
crescono come una popolazione mista utilizzando il lattosio del latte e abbassando il pH
fino a valori di 4.5 - 4.2. Durante la commercializzazione e la conservazione, che
avvengono a temperature comprese fra 4 e 12 °C, il pH dello yogurt può subire un ulteriore
decremento raggiungendo valori di circa 4.0. Questo fenomeno di post-acidificazione
provoca un aumento del sapore acido spesso associato a un sapore amaro del prodotto
che ne altera le caratteristiche organolettiche.
Sia lo sviluppo della componente aromatica amara (proteolisi) che il
fenomeno di post-acidificazione sono causati da L. delbrueckii .
Questa problematica è stata superata attraverso all’utilizzo di mutanti spontanei β-gal -.
In questo contesto, la crescita di L. delbrueckii β-gal - in latte può essere possibile solo in
associazione con S. thermophilus. Per ridurre anche il fenomeno dell’amaro, determinato
da peptidi contenenti amminoacidi idrofobici (Leu, Phe, Pro), sono stati impiegati mutanti
spontanei proteasi -.
L’utilizzo di questi mutanti nei processi industriali di produzione di yogurt è protetto da
brevetto dal 1996.
Delezione spontanea all’interno del gene codificante la β-galattosidasi di L.
delbrueckii subsp. bulgaricus. (Mollet et. al., 1990, Journal of Bacteriology 172: 5670-5676)
La stabilità del locus genico della operone lattosio di L. delbrueckii è stata analizzata in
un elevato numero di mutanti spontanei β-gal - . Questi mutanti sono stati selezionati a
partire da colture cresciute a 43 °C in terreno MRS opportunamente piastrate in MRS/XGal (MRS + 5-bromo-4-cloro-3-indolilbetagalattopiranoside) per lo screening bianco/blu)
(β-gal - colonie bianche β-gal + colonie blu).
I mutanti spontanei β-gal - sono stati analizzati per RFLP cromosomale e
Southern utilizzando come sonda il gene β-gal. Sono stati individuate 10 differenti
mutazioni originate da piccole delezioni nella regione terminale della β-gal.
4
Le delezioni
variavano da meno
di 200 bp a 933 bp,
in un caso la
delezione si
estendeva per 4.5
kb a valle del gene.
Modello teorico del meccanismo molecolare che porta alle delezioni descritte sopra
5
Influenza dell’attività ureasica sulla velocità di acidificazione in latte
Ureasi batteriche (urea amide-idrolasi; E.C. 3.5.1.5.) Famiglia di metallo-enzimi,
in cui lo ione Ni2+ è presente nel sit, che catalizzano l’idrolisi dell’urea con produzione di 2
molecole di ammoniaca e ad una di acido carbonico.
O
H2 N
C
NH 2 +
H2 O
Ure a s i
O
NH 3 + H2 N
C
OH
O
H2 N
C
OH +
NH 3 + H2 CO 3
H2 O
H2 CO 3
2NH 3 + 2H 2 O
H+ +
HCO 3 2NH 4 + + OH-
L’ureasi è un metallo-enzima che contiene Nichel nel sito attivo
Oltre all’ureasi gli altri metallo-enzimi noti per contenere Ni sono: Methyl-CoM
reduttasi (metanogenesi), hydrogenase (idrogeno come substarto o come prodotto),
superossido dismutase (2O2-+2H+Æ H2O2 + O2), monossido di carbonio deidrogenasi
(CO + H2O Æ CO2 + 2 H) e acetil coenzima A sintetasi,
6
7
Geni coinvolti nella biosintesi delle ureasi batteriche e loro organizzazione
Proteus mirabilis
Klebsiella aerogenes
Yersinia enterocolitica
Helicobacter pylori
Bacillus sp
regolatore
accessori
accessori
strutturali
Organizzazione genica dell’operone ureasi di Streptococcus
thermophilus e di S. salivarius
mRNA
ureI
ureA
ureB
ureC
ureE
ureF
ureG
ureD
(18.9)
(11.3) (11.5)
(61.8)
(16.9)
(26.9)
(22.9)
(32.3)
accessori
strutturali
accessori
8
U re A
U re B
U re A
Ur e C
U re C
U re A
Me m b ra n a
c it o p la s m a t ic a
( U r e AB C ) 3
U re B
U re C
Ap o U re AB C
U re B
U re D
U re B
U re A
U re B
U re A
U re A
U re C
U re C
U re D
U re C
Ap o U re AB C- D
U re G
U re B
U re F
U re A
U re B
U re F
Ap o U re AB C- D - F- G
U re B
U re A
U re E
N i2 +
N ixA , U re H ,
a ltri?
N i2 +
Tra s p o rt a t o ri d i
m e m b ra n a d e l
n ic h e l
U re A
U re C
U re C
U re D
U re C
U re G
U re D
U re B
U re E
U re F U re G
U re E
U re A
N i2 +
CO
2
U re B
(N i2 + )2
U re B
(N i2 + )2
U re A
U re A
U re C
U re C
(N i2 + )2
U re C
U re B
Ap o U re AB C
Rappresentazione grafica di un modello descrittivo del processo di attivazione
dell’apoenzima ureasi (Apo-URE) da parte delle proteine accessorie. Apo-URE
viene assemblato a partire da tre copie di ciascuna delle seguenti subunità
funzionali (UreA, UreB, e UreC) secondo la seguente stechiometria: (UreA-B-C)3.
L’attivazione in vivo dell’apoproteina richiede la presenza di 6 ioni Ni2+, anidride
carbonica, e la presenza dei geni accessori dell’ureasi. Nella figura è mostrato il
possibile ruolo delle proteine accessorie. UreD potrebbe funzionare come una
proteina chaperon legandosi ad Apo-URE a formare il complesso Apo-URE-D che
interagirà successivamente con UreF ed UreG costituendo il nuovo aggregato ApoURE-D-F-G che presumibilmente grazie all’intervento di UreE permetterebbe un
ottimale assemblaggio degli ioni Ni2+ all’interno del sito attivo dell’apoenzima. UreE
potrebbe quindi essere coinvolto nel trasporto citoplasmatico di Ni2+. Dopo
l’attivazione di Apo-URE, le proteine accessorie si separano dall’enzima attivo per
essere riciclate e poter interagire con la successiva molecola di apoenzima o con
un’altra unità “UreABC” sulla stessa molecola (Mobley et al., 1995).
9
Ð Ruolo fisiologico delle ureasi batteriche
Il ruolo fisiologico delle ureasi in molti batteri può essere duplice. In alcuni
casi la degradazione dell’urea ha un ruolo “nutrizionale” poiché libera ioni
ammonio che rappresentano una fonte di azoto assimilabile. In altri casi può
anche essere un sistema efficace per il controllo del pH dell’ambiente
(ecosistema) in cui vive il microrganismo. L’attività ureasica è sicuramente un
ottimo sistema di controllo del pH a livello gastrico per Helicobacter pylori che
grazie all’attività di una ureasi periplasmatica riesce a creare un microambiente
neutro all’interno di un sistema estremamente acido.
Analogamente anche S. salivarius, riesce a mantenere un pH vicino alla
neutralità nelle regioni della cavità orale dei mammiferi che rappresentano il
suo naturale habitat. Durante l’ingestione di cibo nel cavo orale si ha una forte
diminuzione del pH che S. salivarius controlla idrolizzando l’urea a ammoniaca
e CO2. Contemporaneamente, può utilizzare parte dell’ammoniaca generata
dall’attività ureasica come fonte di azoto.
Influenza dell’attività ureasica di S. salivarius sul livello di sopravviivenza
a pH neutri o acidi .
10
Influenza dell’attività ureasica di S. salivarius sulla crescita in terreno
colturale a basso contenuto di fonte di azoto .
Ð Ruolo tecnologico dell’attività ureasica
Influenza dell’attività ureasica di Streptococcus thermophilus sulla velocità di
acidificazione in latte.
Streptococcus thermophilus è un batterio lattico termofilo ampiamente
utilizzato nel settore lattiero-caseario sia per la preparazione di latti fermentati che di
formaggi. Il ruolo principale di S. thermophilus nel processo di fermentazione del latte è
quello di determinarne una rapida acidificazione in seguito alla produzione di acido Llattico. La velocità di acidificazione è una importante caratteristica tecnologica dei ceppi
batterici di impiego lattiero-caseario, poiché ritardi nell’abbassamento del pH possono
avere effetti negativi sulla qualità del prodotto finito. Nello specifico, ritardi di
acidificazione possono modificare sia le caratteristiche di consistenza (texture) che i
livelli di umidità del prodotto fermentato. Inoltre, quando la fermentazione è condotta su
latte crudo, ritardi di acidificazione della cagliata possono favorire lo sviluppo di
popolazioni batteriche non desiderate (alterative o patogene). Infine, poiché i processi
di fermentazione lattica operati da S. thermophilus sono condotti a temperature che
oscillano dai 32 ai 42 °C, ritardi di acidificazione possono determinare aumenti dei costi
di produzione (riscaldamento della cagliata).
In S. thermophilus la velocità del processo di acidificazione può essere modulata da
diversi attività metaboliche che riguardano il metabolismo del lattosio, il sistema
proteolitico, e l’attività ureasica. Spesso è proprio quest’ultima attività metabolica ad
interferire in maniera preponderante sul processo di acidificazione a causa della
liberazione di ammoniaca dovuta all’azione idrolitica sulla molecola di urea (presente nel
latte in concentrazioni variabili tra 0.2 e 0.4 g/l). In questo caso, il rallentamento della
diminuzione di pH sarà più o meno intenso a seconda del contenuto di urea del latte.
11
6,5
Curva di acidificazione in latte
magro ricostituito
in presenza e in assenza di urea
6
pH
attività ureasica
5,5
ritardo di acidificazione
5
4,5
0
5
10
15
20
Tempo (h)
= Streptococcus thermophilus DSM 20617T (ureasi-positivo)
in latte magro ricostituito addizionato di 0.5 g/l di urea
= Streptococcus thermophilus DSM 20617T (ureasi-positivo)
in latte magro ricostituito.
= Streptococcus thermophilus A16 (ureasi-negativo)
in latte magro ricostituito.
Valutazione dell’attività ureasica
con il metodo conduttimetrico
600
S. thermophilus
Aureasi-positivo
Conductance
(µS)
Conduttanza (µS)
500
= latte
400
= latte + 0.1 g/l di urea
300
= latte + 0.5 g/l di urea
200
= latte + 1 g/l di urea
100
0
0
5
10
15
20
Time (h)
Tempo
(h)
12
La determinazione della variazione conduttimetrica consente di
valutare le cinetiche delle molecole cariche presenti in un mezzo durante la
fermentazione. Mentre in un latte non fermentato la conducibilità è dovuta
principalmente alla frazione di sali solubili naturalmente presenti, durante la
fermentazione i cambiamenti di conducibilità sono legati alla produzione di
acido lattico, alla solubilizzazione del calcio legato alla caseina e ad altre
attività metaboliche coinvolte nella produzione di molecole cariche. In
particolare l’idrolisi dell’urea e la conseguente produzione di ioni ammonio
esercita una grande influenza sulla conducibilità del mezzo.
Valutazione rapida dell’attività ureasica in ceppi batterici
Una rapida valutazione dell’attività ureasica di un ceppo batterico può essere
effettuata come di seguito descritto.
- una sospensione di cellule opportunamente “lavate” in soluzione fisiologica
viene addizionata a una soluzione contenente urea e rosso fenolo (indicatore di
pH con un intervallo di viraggio tra pH 6.8 e 8.2 , da giallo a fucsia).
- segue incubazione a 37 °C per 2 h.
Ceppo A ureasi-negativo
Ceppo B ureasi-positivo
+ NiCl2
?
Ceppo A ureasi-positivo
Ni dipendente
13
Organizzazione genica dell’operone ureasi di Streptococcus thermophilus
mRNA
ureI
ureA
ureB
ureC
ureE
ureF
ureG
ureD
(18.9)
(11.3) (11.5)
(61.8)
(16.9)
(26.9)
(22.9)
(32.3)
accessori
strutturali
1
61
121
accessori
MSFKMDREEYAQHYGPTVGDSVRLGDTNLFAAIEKDFTVYGQESKFGGGKVLRDGM
GVSATETRDNPSVVDTIITGATIIDYTGIIKADIGIRDGKIVAIGRGGNPDTMDNV
DFVVGASTEAIAAEGLIVTAGGIDLHVHYISADLPEFGLDNGITTLFGGGTGPADG
60
120
180
181
SNATTCTPGKFHITRMLQAVDDMPANFGFLAKGVGSETEVVEEQIKAGAAGIKTHE
240
241
DWGATYAGIDNSLKVADKYDVSFAVHTDSLNEGGFMENTLESFQGRTVHTFHTEGS
300
301
GGGHAPDIMVFAGKENILPSSTNPTNPYTTNAIGELLDMVMVCHHLDPKIPEDVSF
360
361
AESRVRKQTVAAEDVLHDMGALSIMTSDAMAMGRVGEVAMRCWQLADKMKAQRGPL
420
421
EGDSEFNDNNRIKRYVAKYTINPAITNGIADYIGSVEVGKFADLVIWEPAQFGAKP
480
481
KLVLKGGMLTYGVMGDAGSSLPTPQPRIMRKLYGAYGQAVHKTNLTFVSQYAYDHG
540
541
IKEEIGLNKIVLPVKNTRNLTKRDMKLNDYAPKTIRIDPQTFDVFIDDELVTCEPI
600
601
HTTSLSQRYFLF
612
Sequenza amminoacidica della subunità α dell’ureasi di S. thermophilus.
Sono indicati in colore rosso i residui amminoacidici conservati e in blu i residui
di istidina coinvolti nel legame con il Nichel. Gli amminoacidi del sito catalitico
sono evidenziati in grigio.
14
Costruzione di un mutante di S. thermophilus ureasi negativo mediante
knock-out del gene ureC
regione polylinker
ureCf
ureCf
eryR
pGh9
repA(Ts)
3752 bp
pMI42
repA(Ts)
erm
(4403 bp)
Trasformazione in
S. thermophilus
per elettroporazione
ricombinazione omologa su ureC
ureB
ureC
*
Ts repA
erm
**
pMI42 (4403 bp)
ureCf
**
ureC1
ureE
*
Ts repA
erm
ureC::pMI42
ureC2
ureE
15
Il nuovo clone di S. thermophilus, denominato Cl19 (ureC::pMI42), è ureasi-negativo.
Curva di acidificazione in latte magro ricostituito in presenza di 0.5 g/l di urea
6,5
6,3
6,1
= Streptococcus
thermophilus
wild-type
(ureasi-positivo)
5,9
pH
5,7
ritardo di acidificazione
5,5
5,3
= Streptococcus
thermophilus
Cl19 (ureC::pMI42)
(ureasi-negativo)
5,1
4,9
4,7
4,5
0
5
10
15
20
Tempo (h)
Curva di acidificazione in latte magro ricostituito in presenza di 0.1 g/l di urea e
di diverse concentrazioni di NiCl2
6,5
6,5
wild-type
Cl19(ureC::pMI42)
6
6
50 µM (NiCl2)
pH
pH
50 µM (NiCl2)
5,5
5,5
0 µM (NiCl2)
0 µM (NiCl2)
5
5
4,5
0
2
4
Tempo (h)
6
8
10
4,5
0
2
4
6
8
10
Tempo (h)
La velocità di acidificazione in latte del ceppo ricombinante non è influenzata
né dalla presenza di urea né dalla presenza di ioni Ni.
16
Il pathway dell’Arginina deaminasi
NH3
H2O
Arginina
Arginina
Citrullina
ADI
OTC
A/O AP
Pi
Ornitina
Carbamoil-P
Ornitina
ADP
CK
ATP
OUT
IN
CO2
NH3
Gli enzimi coinvolti nel pathway dell’arginina deaminasi sono i seguenti:
- ADI
arginina deaminase
- OTC
ornitina transcarbossilasi
- CK
carbamato kinase
Questa via metabolica è presente in molte specie di batteri lattici e in particolare in quelle
che crescono e si sviluppano nel vino o in altre bevande alcoliche. Il pathway dell’arginina
deaminasi è inoltre presente in molte specie di Streptococchi orali che sfruttano la
produzione di ammoniaca per controllare il pH del loro habitat. Per quanto riguarda i
batteri di interesse alimentare, la via di degradazione dell’arginina è presente in
Lactococcus lactis, Lactobacillus sakei, Oenococcus oeni, Enterococcus faecalis,
Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici e L. sanfrancisciensis.
Nonostante che la degradazione dell’arginina rappresenti una fonte di energia per alcuni
batteri, questo amminoacido non può supportare la crescita batterica in un terreno di
coltura privo di fonti di carbonio. Sembrerebbe che gli enzimi del pathway dell’arginina
deaminasi siano inducibili e inibiti dalla presenza di fruttosio (solo alcuni ceppi).
17
Implicazioni enologiche della degradazione batterica dell’arginina
Oenococcus oeni, la specie batterica responsabile della fermentazione
malolattica, possiede anche la capacità di degradare l’arginina.
Questo
amminoacido è presente nel mosto d’uva da poche centinaia di mg a 2,4 g/l,
quantità che si riducono dopo la fermentazione operata dai lieviti vinari.
Il
consumo di arginina può avere effetti positivi sulla qualità finale del vino, sia a
causa della riduzione di acidità dovuta allo sviluppo di ammoniaca, sia per la
formazione di ornitina escreta nel mezzo che ha effetti di inibizione sulla crescita
dei lieviti “ selvaggi ” indesiderati (Hansenula minuta). Di conseguenze elevate
concentrazioni di ornitina conferiscono una potenziale stabilità biologica al vino.
Deve inoltre essere considerato che l’arginina, in concentrazioni elevate, può
conferire un sapore amaro al vino, per cui la sua degradazione migliora le
caratteristiche organolettiche complessive del prodotto.
nel mosto e nel vino
100 mg - 1-2 g/l
N
N
N
Sapore amaro
N
O
ADI patway
-
Arginina
Ornitina
?
Etil-carbammato
R - NH- COO-CH2CH3
+
(cancerogeno)
Innalzamento del pH
del vino
NH3
Hansenula minuta
La formazione di etil-carbammato, un prodotto secondario dell’ADI pathway, è
un aspetto decisamente negativo di questo processo metabolico, poiché si tratta
di una sostanza cancerogena la cui concentrazione limite nel vino non dovrebbe
eccedere i 15 ng/g. Questa sostanza si può formare spontaneamente in
presenza di etanolo e molecole quali l’urea, la citrullina, il carbamoilfosfato e
diversi amminoacidi sia ad alte che a basse temperature.
18
Impasti acidi e degradazione batterica dell’arginina
Vengono definiti impasti acidi gli le miscele di farina, acqua sale e/o zucchero
burro etc. in cui la fermentazione non è esclusivamente dovuta al comune lievito
da pane (Saccharomices cerevisiae) ma anche ad una consistente popolazione
di batteri lattici. Gli impasti fermentati che si ottengono vengono infatti definiti
acidi a causa della presenza di acido lattico di origine batterica. Lactobacillus
sanfrancisciensis è una delle specie di batteri lattici maggiormente coinvolte in
questi processi fermentativi. Quando l’attività ADI di questa specie microbica si
manifesta durante il processo fermentattivo si ha un influenza positiva sulla
crescità della coltura, una maggiore tolleranza nei confronti dell’ambiente acido e
una significativa produzione di ornitina che migliora le caratteristiche
organolettiche del prodotto da forno (l’ornitina è il precursore del 2-acetil 1pirroline, molecola che conferisce il classico aroma di “cotto” ai prodotti da forno,
popcorn-like smell).
N
N
nell’impasto
0.5 mM
N
N
O
ADI patway
Arginina
NH3
+
2-acetil 1-pirroline
(popcorn-like smell)
Ornitina
+
Innalzamento del pH
dell’impasto
19
Il metabolismo dell’acido Citrico
(Journal of Bacteriology –1999- 181:1451-1457; -2004- 186: 5649-5660)
COOCH2
HO
IN
OUT
COO-
COO-
CH2
COO-
CH2
1
2
HO
COOCH2
COO-
COO-
CH3
COOacetato
in E.coli
CH2
O
COOossalacetato
3
malato
fumarato
succinato
CH3
O
COOpiruvato
1 Citrato permeasi
2 Citrato liasi
3 Ossalacetato decarbossilasi
Molti batteri utilizzano il citrato utilizzando
la via metabolica di cui sopra, in particolare
enterobatteri, alcuni patogeni (Klebsiella
pneumonie, Vibrio, Salmonella) e diversi
batteri lattici tra cui quelli appartenenti al
genere Leuconostoc e Lactococcus.
20
In molti ceppi di Leuconostoc e Lactococcus lactis i geni che codificano per le proteine
necessarie al trasporto dell’acido citrico (citQRP) sono localizzati plasmidi
rispettivamente di 8 e 23 kb. In Lactococcus lactis, sia i geni citQRP plasmidici che
quelli cromosomali citM-citDEFXG sono soggetti ad aumenti dei livelli di espressione in
risposta a stress acidi.
Il ruolo fisiologico del pathway dell’acido citrico in L. lactis è quello di facilitare il cometabolismo del glucosio e dell’acido citrico riducendo attenuando la tossicità dell’acido
lattico che si accumula alla fine della fase esponenziale di crescita.
+ glucosio
+ glucosio
21
--
Citrato
Lattato
--
Citrato
Lattato
-
-
H+
Glucosio
Lattato H
ATP
Lattato H
+
ADP
CitDEF
Lattato
Ossalacetato
H+
-
H+
CitM
+
CO2
Piruvato
citI
citC
DE
F
citX
citG
citM
diacetile
acetoino
butandiolo
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