Determinazione di HAV e Norovirus in molluschi bivalvi

Determinazione di HAV e
Norovirus in molluschi bivalvi
mediante Real time PCR
Metodi:
CEN/TC275/WG6/TAG4
2004: istituzione del gruppo CEN/TC275/WG6/TAG4
“Horizontal method for detection of Norovirus
and Hepatitis A virus in food by RT-PCR”
coordinatore dr. David Lee (CEFAS)
Elisabetta Suffredini
Istituto Superiore di Sanità
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Ancona – 09.02.2010
Istituto- Superiore
di Sanità
- Roma
Roma
La Sapienza
17-01-2008
Metodi:
DSPVSA
CEN/TC275/WG6/TAG4
Stato dei lavori:
- definizione metodo (PCR Real-Time)
- modalità di estrazione dell’acido nucleico
- definizione protocollo (primers & sonde, reagenti,
condizioni di retrotrascrizione e amplificazione)
- definizione dei controlli (controllo di processo,
controlli interni per l’amplificazione)
Istituto Superiore di Sanità - Roma
Definizione metodi di riferimento per NV (GGI e GGII) e HAV:
• Superfici
• Frutta e vegetali
• Acqua
• Molluschi bivalvi
DSPVSA
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
PCR convenzionale vs. real-time PCR
• analisi end-point
• qualitiativa
• sensibilità: doppia PCR
• specificità: sequenziamento,
ibridazione
• difficile standardizzazione
• analisi durante la
reazione
• quali/quantitativa
• sensibilità: one-step
• specificità: probe
• standardizzabile
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DSPVSA
Concentrazione del virus
virus controllo di processo
Real-time PCR
Estrazione e purificazione RNA
threshold
Retrotrascrizione e PCR
recupero (virus CP)
inibitori (RNA)
curve stnd
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DSPVSA
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DSPVSA
1
1. Preparazione del campione
2. Estrazione acidi nucleici
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Pulizia esterna dei molluschi
Apertura (min 10 individui)
Prelievo dell’epatopancreas
Pulizia epatopancreas
Sminuzzare finemente
Prelievo di 2 g
Aggiunta di 10 µl di controllo di processo (Mengovirus, FCV, etc.)
Aggiunta di 2 ml di soluzione di proteinasi K (0.1 mg/ml)
37°C per 60 min con agitazione
60°C per 15 min
Centrifugazione 3000 g per 5 min
Recupero sovranatante e normalizzazione volume (3 ml)
500 µl di campione (1/6 dell’estratto)
Lisi con buffer a base di guanidina
Cattura AN su silice
Lavaggi con tamponi contenenti etanolo
Eluizione
Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der NJ. Rapid and
simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology
1990;28:495-503.
NucliSens MiniMag Extraction System
Comelli et al. 2008
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
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DSPVSA
• Resa
• Contaminazione
• Volume di
campione estratto
3. Real time RT-PCR
Primers/probes (Appendice C):
- HAV: Costafreda et al. 2006
sonda FAM-MGB
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DSPVSA
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DSPVSA
2
3. Real time RT-PCR
3. Real time RT-PCR
Primers/probes (Appendice C):
- HAV: Costafreda et al. 2006
- NoV GI: da Silva et al. 2007 + Svraka et al. 2007
- NoV GII: Loisy et al. 2005 + Kageyama et al. 2003
Primers/probes (Appendice C):
- HAV: Costafreda et al. 2006
- NoV GI: da Silva et al. 2007 + Svraka et al. 2007
- NoV GII: Loisy et al. 2005 + Kageyama et al. 2003
5’VPG
ORF 1
NV Proteine non strutturali
(hel-prot-polimerasi)
ORF 2
Proteina capsidica
ORF 3
AAA3’
- Mengo: Costafreda et al. 2006
- FCV: Di Pasquale et al. 2009
Proteina strutturale
sonda FAM-TAMRA
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DSPVSA
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
3. Real time RT-PCR
3. Real time RT-PCR
Condizioni di PCR (Appendice D):
- One-step
- Profilo termico
- 5 µl di AN
- Ottimizzazione concentrazioni (RNA
Ultrasense Invitrogen)
Campione
Controlli:
- Controllo negativo
- Controllo di inibizione (RNA) > efficienza di
PCR
[campione+RNA vs. RNA]
(curva stnd RNA)
Controllo di processo > recupero virus dalla
matrice
[campione vs. virus CP]
(curva stnd virus CP)
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DSPVSA
DSPVSA
Esempio di piastra 1
3. Real time RT-PCR
Controllo di processo
Aliquota dello stock virale utilizzato come CP
per i campioni viene diluita 1:10 e sottoposta a
trattamento termico per il rilascio dell'RNA
Istituto Superiore di Sanità - Roma
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
Mix target
5 µl
camp.A
5 µl
camp.B
5 µl
camp.C
5 µl
camp.D
5 µl
camp.A
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.B
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.C
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.D
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl H2O
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
10-1
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
10-2
5 µl
camp.A
5 µl
camp.B
5 µl
camp.C
5 µl
camp.D
5 µl H2O
5 µl
virusCP
10-1
5 µl
virusCP
10-2
5 µl
virusCP
10-3
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DSPVSA
3
Esempio di piastra 1
Esempio di piastra 1
5 µl
camp.A
5 µl
camp.B
5 µl
camp.C
5 µl
camp.D
5 µl
camp.A
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.B
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.C
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.D
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl H2O
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.A
5 µl
camp.B
5 µl
camp.C
5 µl
camp.D
5 µl H2O
5 µl
virusCP
10-1
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
10-1
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
10-2
Mix target
5 µl
camp.A
5 µl
camp.B
5 µl
camp.C
5 µl
camp.D
5 µl
camp.A
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.B
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.C
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.D
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl H2O
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
10-1
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
10-2
5 µl
camp.A
5 µl
camp.B
5 µl
camp.C
5 µl
camp.D
5 µl H2O
5 µl
virusCP
10-1
5 µl
virusCP
10-2
5 µl
virusCP
10-3
Mix virusCP
5 µl
virusCP
10-2
5 µl
virusCP
10-3
DSPVSA
Istituto Superiore di Sanità - Roma
Esempio di piastra 1
5 µl
camp.A
5 µl
camp.A
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.A
5 µl
camp.B
5 µl
camp.C
Esempio di piastra 1
Mix target
5 µl
camp.D
∆Ct
> efficienza
PCR
/ inibitori
5 µl
5 µl
5 µl
5 µl H2O
camp.B
+ 1 µl
RNA-EC
camp.C
+ 1 µl
RNA-EC
camp.D
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.B
5 µl
camp.C
5 µl
camp.D
5 µl H2O
5 µl
camp.B
5 µl
camp.C
5 µl
camp.D
5 µl
camp.B
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.C
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.D
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
10-1
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
10-2
5 µl
camp.A
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
virusCP
10-1
5 µl
virusCP
10-2
5 µl
virusCP
10-3
5 µl
camp.A
DSPVSA
3.1 Controllo di inibizione / efficienza di PCR
vs.
5 µl
camp.A
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
Istituto Superiore di Sanità - Roma
5 µl campione
+
1 µl RNA-EC
DSPVSA
Istituto Superiore di Sanità - Roma
5 µl H2O
+
1 µl RNA-EC
5 µl H2O
∆Ct
5 µl > efficienza
5 µl
5estrazione
µl
5 µl H2O
camp.B
camp.C
camp.D
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
10-1
Mix virusCP
5 µl
virusCP
10-1
5 µl
virusCP
10-2
3.2 Controllo di processo / recupero
5 µl campione
vs.
5 µl virus CP
∆Ct = Ct camp – Ct virus CP
E = 2-∆Ct
R = 2-∆Ct x d
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
5 µl
virusCP
10-3
DSPVSA
Istituto Superiore di Sanità - Roma
∆Ct = Ct camp – Ct stand
Limite accettabilità:
E ≥ 50%
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
10-2
Istituto Superiore di Sanità - Roma
Limite accettabilità:
R ≥ 1%
DSPVSA
4
10µl virusCP
10µl virusCP
10µl virusCP 105/µl = 106
10µl virusCP 105/µl = 106
2g epatopancreas
2g epatopancreas
3ml sospensione
3ml sospensione 3.3x102/µl = 106
(1:300)
500µl 3.3x102/µl = 1.6x105
500µl
(1/6)
100µl
100µl
5µl
5µl
100µl 1.6x103/µl = 1.6x105
100µl 104/µl = 106
5µl 1.6x103/µl = 8.3x103
5µl 104/µl = 5x104
1:6 d=6
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
Esempio di piastra 1
5 µl
camp.A
5 µl
camp.B
5 µl
camp.C
5 µl
camp.D
5 µl
camp.A
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.B
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.C
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.D
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.B
5 µl
camp.C
5 µl
camp.D
DSPVSA
Istituto Superiore di Sanità - Roma
Esempio di piastra 2
Mix target
5 µl H2O
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl H2O
5 µl
virusCP
10-1
Calcolo R2
5 µl
camp.A
10-1= 5x103 d=0.6
10-2= 5x102 d=0.06
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
10-1
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
10-2
5 µl
camp.A
5 µl
camp.A
+ 1 µl
RNA-EC
Mix virusCP
Istituto Superiore di Sanità - Roma
5 µl
virusCP
10-2
5 µl
virusCP
10-3
DSPVSA
5 µl
camp.A
5 µl
camp.B
5 µl
camp.C
∆Ct
PCR
5 µl > efficienza
5 µl
5 µl / inibitori
5 µl H2O
camp.B
+ 1 µl
RNA-EC
camp.C
+ 1 µl
RNA-EC
camp.D
+ 1 µl
RNA-EC
∆Ct > efficienza
estrazione
5 µl
5 µl
5 µl H2O
5 µl
camp.B
camp.C
Mix target
5 µl
camp.D
camp.D
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
Ct di
riferimento
Mix virusCP
5 µl
virusCP
10-1
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
Esempio di piastra 3
5 µl
camp.A
5 µl
camp.B
5 µl
camp.C
5 µl
camp.D
5 µl
camp.A
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.B
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.C
+ 1 µl
RNA-EC
5 µl
camp.D
+ 1 µl
RNA-EC
Mix target
5 µl H2O
SAGGI PRELIMINARI
5 µl H2O
+ 1 µl
RNA-EC
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
5
Controllo di processo
Controllo di processo
Caratteristiche:
- Virus coltivabile
- Caratteristiche strutturali simili al target
- Non presente naturalmente nella matrice
- Assenza di interferenza nelle PCR
Definizione della concentrazione d'uso
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 ...
n
n
n
n
n
...
Controllo di processo
45,0
Riproducibilità
40,0
Contaminazione
Ct
35,0
30,0
25,0
20,0
-6
-5
-4
Controllo ad RNA
-3
-2
-1
log10 diluizioni virus
DSPVSA
Istituto Superiore di Sanità - Roma
Istituto Superiore di Sanità - Roma
0
DSPVSA
Controllo ad RNA
plasmide con
inserto di sintesi
sito di taglio
enzimaico
estrazione del
plasmide con
inserto
promotore RNA
polimerasi
linearizzazione
del plasmide
ALTERNATIVA:
coltura
trasformazione
E. coli
DSPVSA
Istituto Superiore di Sanità - Roma
RNA estratto da
coltura (HAV) o
da sospensioni
fecali (NoV)
standard a
RNA
Istituto Superiore di Sanità - Roma
trascrizione in
vitro seq a RNA
digestione DNA
DSPVSA
Controllo ad RNA
Definizione della concentrazione d'uso
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 ...
n
n
n
n
n
GRAZIE
...
Controllo di processo
45,0
Riproducibilità
40,0
Ct < cont. naturale
Ct
35,0
30,0
Contaminazione
25,0
20,0
-6
-5
-4
-3
-2
-1
log10 diluizioni virus
Istituto Superiore di Sanità - Roma
0
DSPVSA
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
6