Determinazione di HAV e Norovirus in molluschi bivalvi
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Determinazione di HAV e Norovirus in molluschi bivalvi mediante Real time PCR Metodi: CEN/TC275/WG6/TAG4 2004: istituzione del gruppo CEN/TC275/WG6/TAG4 “Horizontal method for detection of Norovirus and Hepatitis A virus in food by RT-PCR” coordinatore dr. David Lee (CEFAS) Elisabetta Suffredini Istituto Superiore di Sanità Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Ancona – 09.02.2010 Istituto- Superiore di Sanità - Roma Roma La Sapienza 17-01-2008 Metodi: DSPVSA CEN/TC275/WG6/TAG4 Stato dei lavori: - definizione metodo (PCR Real-Time) - modalità di estrazione dell’acido nucleico - definizione protocollo (primers & sonde, reagenti, condizioni di retrotrascrizione e amplificazione) - definizione dei controlli (controllo di processo, controlli interni per l’amplificazione) Istituto Superiore di Sanità - Roma Definizione metodi di riferimento per NV (GGI e GGII) e HAV: • Superfici • Frutta e vegetali • Acqua • Molluschi bivalvi DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA PCR convenzionale vs. real-time PCR • analisi end-point • qualitiativa • sensibilità: doppia PCR • specificità: sequenziamento, ibridazione • difficile standardizzazione • analisi durante la reazione • quali/quantitativa • sensibilità: one-step • specificità: probe • standardizzabile Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA Concentrazione del virus virus controllo di processo Real-time PCR Estrazione e purificazione RNA threshold Retrotrascrizione e PCR recupero (virus CP) inibitori (RNA) curve stnd Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 1 1. Preparazione del campione 2. Estrazione acidi nucleici • • • • • • • • • • • • • • • • • Pulizia esterna dei molluschi Apertura (min 10 individui) Prelievo dell’epatopancreas Pulizia epatopancreas Sminuzzare finemente Prelievo di 2 g Aggiunta di 10 µl di controllo di processo (Mengovirus, FCV, etc.) Aggiunta di 2 ml di soluzione di proteinasi K (0.1 mg/ml) 37°C per 60 min con agitazione 60°C per 15 min Centrifugazione 3000 g per 5 min Recupero sovranatante e normalizzazione volume (3 ml) 500 µl di campione (1/6 dell’estratto) Lisi con buffer a base di guanidina Cattura AN su silice Lavaggi con tamponi contenenti etanolo Eluizione Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der NJ. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology 1990;28:495-503. NucliSens MiniMag Extraction System Comelli et al. 2008 Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA • Resa • Contaminazione • Volume di campione estratto 3. Real time RT-PCR Primers/probes (Appendice C): - HAV: Costafreda et al. 2006 sonda FAM-MGB Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 2 3. Real time RT-PCR 3. Real time RT-PCR Primers/probes (Appendice C): - HAV: Costafreda et al. 2006 - NoV GI: da Silva et al. 2007 + Svraka et al. 2007 - NoV GII: Loisy et al. 2005 + Kageyama et al. 2003 Primers/probes (Appendice C): - HAV: Costafreda et al. 2006 - NoV GI: da Silva et al. 2007 + Svraka et al. 2007 - NoV GII: Loisy et al. 2005 + Kageyama et al. 2003 5’VPG ORF 1 NV Proteine non strutturali (hel-prot-polimerasi) ORF 2 Proteina capsidica ORF 3 AAA3’ - Mengo: Costafreda et al. 2006 - FCV: Di Pasquale et al. 2009 Proteina strutturale sonda FAM-TAMRA Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 3. Real time RT-PCR 3. Real time RT-PCR Condizioni di PCR (Appendice D): - One-step - Profilo termico - 5 µl di AN - Ottimizzazione concentrazioni (RNA Ultrasense Invitrogen) Campione Controlli: - Controllo negativo - Controllo di inibizione (RNA) > efficienza di PCR [campione+RNA vs. RNA] (curva stnd RNA) Controllo di processo > recupero virus dalla matrice [campione vs. virus CP] (curva stnd virus CP) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA DSPVSA Esempio di piastra 1 3. Real time RT-PCR Controllo di processo Aliquota dello stock virale utilizzato come CP per i campioni viene diluita 1:10 e sottoposta a trattamento termico per il rilascio dell'RNA Istituto Superiore di Sanità - Roma Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA Mix target 5 µl camp.A 5 µl camp.B 5 µl camp.C 5 µl camp.D 5 µl camp.A + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.B + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.C + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.D + 1 µl RNA-EC 5 µl H2O 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 10-1 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 10-2 5 µl camp.A 5 µl camp.B 5 µl camp.C 5 µl camp.D 5 µl H2O 5 µl virusCP 10-1 5 µl virusCP 10-2 5 µl virusCP 10-3 Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 3 Esempio di piastra 1 Esempio di piastra 1 5 µl camp.A 5 µl camp.B 5 µl camp.C 5 µl camp.D 5 µl camp.A + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.B + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.C + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.D + 1 µl RNA-EC 5 µl H2O 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.A 5 µl camp.B 5 µl camp.C 5 µl camp.D 5 µl H2O 5 µl virusCP 10-1 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 10-1 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 10-2 Mix target 5 µl camp.A 5 µl camp.B 5 µl camp.C 5 µl camp.D 5 µl camp.A + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.B + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.C + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.D + 1 µl RNA-EC 5 µl H2O 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 10-1 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 10-2 5 µl camp.A 5 µl camp.B 5 µl camp.C 5 µl camp.D 5 µl H2O 5 µl virusCP 10-1 5 µl virusCP 10-2 5 µl virusCP 10-3 Mix virusCP 5 µl virusCP 10-2 5 µl virusCP 10-3 DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma Esempio di piastra 1 5 µl camp.A 5 µl camp.A + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.A 5 µl camp.B 5 µl camp.C Esempio di piastra 1 Mix target 5 µl camp.D ∆Ct > efficienza PCR / inibitori 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl H2O camp.B + 1 µl RNA-EC camp.C + 1 µl RNA-EC camp.D + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.B 5 µl camp.C 5 µl camp.D 5 µl H2O 5 µl camp.B 5 µl camp.C 5 µl camp.D 5 µl camp.B + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.C + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.D + 1 µl RNA-EC 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 10-1 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 10-2 5 µl camp.A + 1 µl RNA-EC 5 µl virusCP 10-1 5 µl virusCP 10-2 5 µl virusCP 10-3 5 µl camp.A DSPVSA 3.1 Controllo di inibizione / efficienza di PCR vs. 5 µl camp.A 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC Istituto Superiore di Sanità - Roma 5 µl campione + 1 µl RNA-EC DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 5 µl H2O ∆Ct 5 µl > efficienza 5 µl 5estrazione µl 5 µl H2O camp.B camp.C camp.D 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 10-1 Mix virusCP 5 µl virusCP 10-1 5 µl virusCP 10-2 3.2 Controllo di processo / recupero 5 µl campione vs. 5 µl virus CP ∆Ct = Ct camp – Ct virus CP E = 2-∆Ct R = 2-∆Ct x d Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 5 µl virusCP 10-3 DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma ∆Ct = Ct camp – Ct stand Limite accettabilità: E ≥ 50% 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 10-2 Istituto Superiore di Sanità - Roma Limite accettabilità: R ≥ 1% DSPVSA 4 10µl virusCP 10µl virusCP 10µl virusCP 105/µl = 106 10µl virusCP 105/µl = 106 2g epatopancreas 2g epatopancreas 3ml sospensione 3ml sospensione 3.3x102/µl = 106 (1:300) 500µl 3.3x102/µl = 1.6x105 500µl (1/6) 100µl 100µl 5µl 5µl 100µl 1.6x103/µl = 1.6x105 100µl 104/µl = 106 5µl 1.6x103/µl = 8.3x103 5µl 104/µl = 5x104 1:6 d=6 Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA Esempio di piastra 1 5 µl camp.A 5 µl camp.B 5 µl camp.C 5 µl camp.D 5 µl camp.A + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.B + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.C + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.D + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.B 5 µl camp.C 5 µl camp.D DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma Esempio di piastra 2 Mix target 5 µl H2O 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 5 µl H2O 5 µl virusCP 10-1 Calcolo R2 5 µl camp.A 10-1= 5x103 d=0.6 10-2= 5x102 d=0.06 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 10-1 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC 10-2 5 µl camp.A 5 µl camp.A + 1 µl RNA-EC Mix virusCP Istituto Superiore di Sanità - Roma 5 µl virusCP 10-2 5 µl virusCP 10-3 DSPVSA 5 µl camp.A 5 µl camp.B 5 µl camp.C ∆Ct PCR 5 µl > efficienza 5 µl 5 µl / inibitori 5 µl H2O camp.B + 1 µl RNA-EC camp.C + 1 µl RNA-EC camp.D + 1 µl RNA-EC ∆Ct > efficienza estrazione 5 µl 5 µl 5 µl H2O 5 µl camp.B camp.C Mix target 5 µl camp.D camp.D 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC Ct di riferimento Mix virusCP 5 µl virusCP 10-1 Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA Esempio di piastra 3 5 µl camp.A 5 µl camp.B 5 µl camp.C 5 µl camp.D 5 µl camp.A + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.B + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.C + 1 µl RNA-EC 5 µl camp.D + 1 µl RNA-EC Mix target 5 µl H2O SAGGI PRELIMINARI 5 µl H2O + 1 µl RNA-EC Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 5 Controllo di processo Controllo di processo Caratteristiche: - Virus coltivabile - Caratteristiche strutturali simili al target - Non presente naturalmente nella matrice - Assenza di interferenza nelle PCR Definizione della concentrazione d'uso 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 ... n n n n n ... Controllo di processo 45,0 Riproducibilità 40,0 Contaminazione Ct 35,0 30,0 25,0 20,0 -6 -5 -4 Controllo ad RNA -3 -2 -1 log10 diluizioni virus DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma Istituto Superiore di Sanità - Roma 0 DSPVSA Controllo ad RNA plasmide con inserto di sintesi sito di taglio enzimaico estrazione del plasmide con inserto promotore RNA polimerasi linearizzazione del plasmide ALTERNATIVA: coltura trasformazione E. coli DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma RNA estratto da coltura (HAV) o da sospensioni fecali (NoV) standard a RNA Istituto Superiore di Sanità - Roma trascrizione in vitro seq a RNA digestione DNA DSPVSA Controllo ad RNA Definizione della concentrazione d'uso 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 ... n n n n n GRAZIE ... Controllo di processo 45,0 Riproducibilità 40,0 Ct < cont. naturale Ct 35,0 30,0 Contaminazione 25,0 20,0 -6 -5 -4 -3 -2 -1 log10 diluizioni virus Istituto Superiore di Sanità - Roma 0 DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 6
