Metodi per il rilevamento degli OGM in matrici alimentari: principi ed

Università degli Studi del Piemonte Orientale “A. Avogadro”
CORSO DI ALTA FORMAZIONE IN LEGISLAZIONE
ALIMENTARE
Metodi per il rilevamento degli OGM in matrici
alimentari: principi ed i metodi di analisi basati sulla
ricerca del DNA e delle proteine
Dott.ssa Patrizia Cesaro
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare
Alessandria 21 maggio 2010
Gli Organismi Geneticamente Modificati sono BATTERI,
FUNGHI, VIRUS, PIANTE e ANIMALI le cui caratteristiche
genetiche sono state modificate in laboratorio. In genere UNO O
PIÙ GENI PRESI DA ALTRI ORGANISMI vengono introdotti nel
patrimonio ereditario dell’organismo (DNA) che si vuole
modificare (Definizione giuridica in Direttiva 2001/18/CE).
IL GENE/I INSERITO CODIFICA
PARTICOLARE INTERESSE
PER
UN
TRATTO
DI
Le applicazioni degli OGM investono gli ambiti più disparati; la
MEDICINA, L'ECOLOGIA, IL SETTORE AGRO-ALIMENTARE e
ZOO-TECNICO. Meno conosciuto, ma molto importante dal
punto di vista medico, è il loro utilizzo in campo farmaceutico,
dove hanno consentito la produzione di vaccini sicuri.
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• Il DNA è la sede
dell’informazione
genetica
• È presente nel
nucleo
di
ogni
cellula
• È identico per
ogni cellula dello
stesso organismo
• Successione
di
nucleotidi contenti
le basi azotate A, T,
CeG
• Numero di geni
variabile a seconda
dell’organismo
• Diversi
livelli
organizzazione
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TUTTE LE PIANTE OGGI COLTIVATE SONO GENETICAMENTE MODIFICATE
o GENETICAMENTE MIGLIORATE
Il principale obiettivo del miglioramento genetico delle piante coltivate è
quello di ottenere varietà con caratteristiche PRODUTTIVE, QUALITATIVE e
di RESISTENZA AGLI STRESS migliori di quelle varietà già disponibili sul
mercato.
METODOLOGIE USATE:
• incrocio
SELEZIONE
• mutagenesi (uso di radiazioni che provocano mutazioni)
SELEZIONE
• trasferimento genico
SELEZIONE
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COMPONENTI DI UN COSTRUTTO O CASSETTA DI
ESPRESSIONE PER OTTENERE PIANTE GM
promotore
GENE
terminatore
ELEMENTI REGOLATORI DELLA TRASCRIZIONE E TRADUZIONE:
- promotore e terminatore
- sito di legame per il ribosoma
GENE: - gene di interesse
- gene reporter
- marcatore di selezione
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METODI PER IL RILEVAMENTO DEGLI OGM
NEGLI ALIMENTI (DETECTION)
1. RICERCA DELLE PROTEINE
2. ANALISI DEL DNA
Qualunque sia la tecnica utilizzata,
per garantirerisultati affidabili è
necessario ottimizzarne vari aspetti
legati alla qualità: PROCEDURE,
REAGENTI e STRUMENTAZIONE.
Risulta
pertanto
di
cruciale
importanza la “VALIDAZIONE” dei
metodi.
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TANTO PIU’ UN PRODOTTO E’ GREZZO TANTO PIU’ E’ FACILE
ISOLARE ED ANALIZZARE L’ANALITA
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Limite consentito <1% (10 volte superiore al limite di rilevabilità
0,1%, che rappresenta la più bassa soglia scientificamente
difendibile per la quantificazione di materiale OGM) 3 motivi:
•
STATISTICA (0,1% la variabilità delle ripetizioni è statisticamente accettabile)
•
TECNICA (0,1% per evitare errori tecnici dovuti al limite di sensibilità di un metodo che in
realtà è 0,01%)
•
CAMPIONAMENTO (una quantificazione affidabile al 0,1% richiede almeno 10000
fagioli di soia, 2,5kg, se si scende a 0,01% occorrerebbero 25kg
di grani)
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CAMPIONAMENTO
• Gli schemi per il campionamento degli OGM si basano sulle
procedure utilizzate per l’analisi delle micotossine. La direttiva
98/53 (Direttiva 98/53/CE del 16 luglio 1998, GUCE L 201 del
17/7/1998, pag. 93) riguardante il campionamento e l’analisi di
alcuni contaminanti negli alimenti è stata la prima linea guida di
campionamento per gli OGM ed è oggi ancora utilizzata, ma ce ne
sono altre più recenti.
• Il materiale OGM NON ha una distribuzione omogenea, di
conseguenza la rappresentatività del campionamento sta alla base
di tutta l’analisi. Per questo è indispensabile effettuare il prelievo
in modo ACCURATO, cercando di CAMPIONARE DIVERSI PUNTI
DEL PRODOTTO.
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Come si eseguono le analisi?
Tre livelli:
campione
- RILEVAMENTO (presenza/assenza OGM)
- IDENTIFICAZIONE (dell’evento di trasformazione)
RILEVAMENTO
- QUANTIFICAZIONE (determinazione %)
negativo
positivo
IDENTIFICAZIONE
È autorizzato?
< 1%
no etichetta
> 1%
QUANTIFICAZIONE
sì
no
È ILLEGALE
etichetta obbligatoria
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Metodi basati sulla RICERCA DELLE PROTEINE
Il transgene codifica per una PROTEINA
Metodi con un basso LIVELLO TECNOLOGICO si tratta di:
• saggi immunologici BASATI SUL RICONOSCIMENTRO ANTIGENEANTICORPO
• che consentono analisi qualitative e quantitative
• in cui l’analita deve essere conosciuto
9
9
9
Western blot
ELISA
Lateral flow assay
Limiti: - localizzazione della proteina
- le proteine non devono essere degradate
USATI PER IL CONTROLLO DI SEMENTI E MATERIE PRIME
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IL LATERAL FLOW ASSAY
• Basso costo
• Facilità di esecuzione
NON QUANTITATIVO
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Lateral Flow Strip Protocol
2
1
3
1. Punch leaf disc
2. Add buffer and
grind in tube
3. Insert flow strips
for testing
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OGM Sì
OGM No
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Limite detection 1seme/1000 semi
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TEST ELISA
• Analisi quantitativa, alta sensibilità, economico
• Ideale per analisi di laboratorio
• Sono processabili + campioni contemporaneamente
• Possibilità di automatizzare il saggio
• Disponibili kit commerciali
• Sono necessarie proteine NON denaturate
Provette singole o
piastre multipozzetto
Enzyme-labelled Antiantibody antibody
antibody specific
to antigen
Blocking protein
well
Colour Response
Concentration
Dependent
Antigen
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TEST ELISA: PRINCIPIO del Sandwich
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TEST ELISA: PRINCIPIO
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Western Blotting
• Test QUALITATIVO altamente specifico
• usato in ricerca
Metodi basati sulla RICERCA DEL DNA
Metodi con un MEDIO-ALTO LIVELLO TECNOLOGICO basati su:
• Polymerase Chain Reaction (PCR end point, PCR quantitativa),
• ibridazione con sonde (Southern blot, microchip GMO)
RILEVAMENTO GENERICO: si utilizzano primers o sonde specifici per sequenze
molto usate per la costruzione di OGM (p35S CaMV, tnos3’ A. tumefaciens, ecc.).
RILEVAMENTO SPECIFICO: si utilizzano primers o sonde per lo specifico evento
di trasformazione (transgene).
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campione
estrazione DNA
RILEVAMENTO GENERICO (PCR end-point, ibridazione con sonde)
negativo
positivo
IDENTIFICAZIONE - rilevamento SPECIFICO
(PCR end-point, ibridazione con sonde)
È autorizzato?
no
sì
ILLEGALE
< 1%
no etichetta
QUANTIFICAZIONE (PCR quantitativa)
> 1%
etichetta
obbligatoria
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QUALITATIVA
Verifica DNA estratto (PCR end-point con primers universali per geni di pianta)
Per una buona riuscita dell’analisi sono importanti:
1. CAMPIONAMENTO
2. PREPARAZIONE dell’ANALITA (estrazione e purificazione)
3. ANALISI QUALITATIVA e QUANTITATIVA dell’ANALITA
L’OBIETTIVO PRIMARIO DEI METODI DI ESTRAZIONE È QUELLO DI
OTTENERE DNA CON IL PIÙ BASSO LIVELLO DI DEGRADAZIONE
POSSIBILE
Es.: ESTRAZIONE DNA
2. Preparazione dell’analita: metodi di estrazione: CLASSICI (CTAB)
COMMERCIALI (resine brevettate)
COMBINATI
3. Analisi qualitativa e quantitativa del DNA: lettura allo spettrofotometro (260 e 280 nm)
Quantità: 1 unità assorbanza 260nm = 50 µg ds DNA/ml
Qualità (purezza): rapporto assorbanza 260nm/280nm (1,7-1,9)
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METODI DI RILEVAMENTO GENERICO E SPECIFICO
M +ve
• Southern Blot
•
•
•
•
•
•
Frammentazione del DNA dell’OGM mediante
digestione enzimatica
corsa e separazione dei frammenti su gel d’agaroso
trasferimento del DNA su membrana di nilon
incubazione con la sonda molecolare
sviluppo mediante autoradiografia
M
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-ve
M
P32 labelled
probe
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• PCR end-point
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Rendimento teorico di molecole di DNA che si
formano a partire da una singola molecola stampo:
N° molecole finali = N x 2C
N= n° di molecole iniziali
C= n° cicli
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PCR FRAGMENT CONFIRMATION
FALSI NEGATIVI:
FALSI POSITIVI:
amplificazione di un gene di pianta per verificare la
presenza del DNA nel campione analizzato
- digestione enzimatica dell’amplificati
- ibridazione con sonde specifiche (southern blot)
- sequenziamento
- PCR con primers interni al frammento amplificato
(NESTED PCR)
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ESEMPIO: RICERCA SOIA GM
Primer per le-1 ¼ 118bp
Primer per transgene ¼ 169bp
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campione
estrazione DNA
RILEVAMENTO GENERICO (PCR end-point, ibridazione con sonde)
negativo
positivo
IDENTIFICAZIONE - rilevamento SPECIFICO
(PCR end-point, ibridazione con sonde)
È autorizzato?
no
QUALITATIVA
Verifica DNA estratto (PCR end-point con primers universali per geni di pianta)
sì
ILLEGALE
< 1%
no etichetta
QUANTIFICAZIONE (PCR quantitativa)
> 1%
etichetta
obbligatoria
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METODI DI QUANTIFICAZIONE: LA REAL TIME PCR
COS’È:
è una reazione PCR che può essere seguita in tempo reale (mentre avviene);
la quantità di DNA che si sintetizza può essere misurata ad ogni ciclo PCR
pratica
• La crescita esponenziale è limitata
• Segue una crescita lineare
• Il plateau non è correlato alla quantità
iniziale del DNA
La REAL TIME PCR
misura il DNA ad ogni ciclo
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teoria
PCR
misura il DNA end-point
(saturazione)
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PCR quantitativa
• Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione
• Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio
• Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer
Plot lineare
Incremento di
fluorescenza
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Chimiche fluorescenti
per PCR Real-Time
LA FLUORESCENZA SI GENERA DURANTE LA PCR PER EFFETTO
DI DIVERSE POSSIBILI REAZIONI CHIMICHE
Le chimiche principali sono basate:
• sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano in modo
aspecifico nella doppia elica di DNA (SYBR Green);
• sia sull'ibridazione di sonde specifiche per il frammento di interesse
marcate con molecole fluorescenti (Dual-labeled (come le sonde
TaqMan) Molecular beacons, Scorpion, sonde FRET (Fluorescence
Resonance Energy Transfer))
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Fluorescenza
Curve di amplificazione
Plot lineare
Cicli di amplificazione
Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione
il cui CT (=Threshold Cycle) è inversamente
proporzionale alla quantità di templato iniziale
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Normalised reporter fluorescence (Rn)
Plot di amplificazione
Linea soglia scelta
d a l l ’ o p e r a t o r e
In maniera da intersecare le
curve di tutti i campioni nella
fase esponenziale
Indica il valore al di
sopra del quale inizia
l’accumulo di un
a m p l i f i c a t o PCR cycle number
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E’ il ciclo della reazione di
amplificazione in cui il segnale
di fluorescenza del campione
è maggiore rispetto a quello
della linea soglia (Threshold)
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Analisi tramite software
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DNA DI RIFERIMENTO (STANDARD)
STANDARD COMMERCIALI
• OGM
• 0% OGM
È necessario produrre almeno 5 diluizioni dello stesso standard
allo scopo di costruire una curva standard
I campioni da determinare vengono affiancati agli standard ed ai
controlli NEGATIVI (H2O)
È necessario produrre almeno 3 repliche sia per ogni campione sia
per gli standard per aumentare l’affidabilità del risultato
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STANDARD DI RIFERIMENTO
Un “CALIBRATORE” è una qualsiasi matrice da cui si ottiene
un DNA a percentuale nota di transgene con cui vengono
costruite le curve di taratura. Viene di norma utilizzato
Materiale di Riferimento Certificato (CRM) a percentuale nota
di OGM (w/w); si tratta di farine a granulometria finissima e
controllata, preparate da Institute for Reference Materials and
Measurements (IRMM, Belgio) e commercializzate dalla ditta
Fluka.
Sono disponibili in commercio per l’analisi quantitativa farine
standard a contenuto di OGM pari a 0%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%,
5% per i principali eventi transgenici.
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CURVA STANDARD
La retta di regressione deve avere un coefficiente correlazione il più possibile
vicino a 1 e un valore di pendenza il più possibile vicino a 3,322. La pendenza
della retta è indice dell’efficienza di reazione
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Quantificazione con METODO DELLA CURVA STANDARD
La quantità di DNA dei campioni deve essere compresa all’interno
della curva degli standard per un calcolo affidabile
Ct
10 1
35
10 2
10 3
unknown sample
10 4
25
10 5
10 6
3500 copies
10 7
15
1
2
3
4
log10 quantity
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5
6
7
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gene endogeno
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transgene
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Kit commerciali basati sulla tecnica PCR
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campione
estrazione DNA
RILEVAMENTO GENERICO (PCR end-point, ibridazione con sonde)
negativo
positivo
IDENTIFICAZIONE - rilevamento SPECIFICO
(PCR end-point, ibridazione con sonde)
È autorizzato?
no
ILLEGALE
< 1%
no etichetta
QUALITATIVA
Verifica DNA estratto (PCR end-point con primers universali per geni di pianta)
sì
QUANTIFICAZIONE (PCR quantitativa)
> 1%
etichetta
obbligatoria
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LA TECNOLOGIA E LA RICERCA VANNO AVANTI………
Sono disponibili NUOVI METODI SEMPRE PIU’ SOFISTICATI E
PRECISI:
• Biosensori
• Microarray
• Chip
……. MA OCCORRE LA LORO VALIDAZIONE
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