Presentazione della struttura

Dipartimento di Patologia Clinica
“S. S.D. Biologia Molecolare”
Caterina Valle
Dirigente Responsabile Struttura S. Dipartimentale
Biologia Molecolare
Ospedale S. Corona
Pietra Ligure
Biologia molecolare
Ospedale Santa Corona
Presentazione della Struttura Dipartimentale
Biologia Molecolare
•
Staff
Nella Struttura Dipartimentale operano le seguenti figure professionali:
Biologo, Biotecnologo,Tecnico di Laboratorio Biomedico.
Dr.ssa Caterina Valle
- Dirigente Responsabile SSD, Specialista in Immunologia Clinica, in Patologia Clinica e in Igiene c/o Università di
Genova e Master per Direttore di S.C. c/o Università di Genova
ECM come da programmazione.
Dr.ssa Giovanna Lavagna -Dirigente Responsabile RSQ , Specialista in Microbiologia ed in Patologia Clinica, c/o Università di Genova,
ECM come da programmazione
Dr.ssa Francesca Guerra - Coordinatore TSLB ,Master di I° Livello in Management per le funzioni di Coordinamento nell’Area tecnico Sanitaria
,
Università di Firenze e Master II° Livello in Teledidattica applicata alle Scienze della Salute e ITC in Medicina
ECM come da programmazione
Sig.ra Carmen Fata
- TSLB- Formazione secondo gli aggiornamenti previsti ed acquisizione ECM come da programmazione.
•
Recapiti utili
Dir. Responsabile della Struttura ( RUO) - Dr.ssa Caterina Valle
Tel: 019. 623.4954 (studio) – 019 623.2848 (portatile)
e-mail: [email protected]
Responsabile della Qualità ( RSQ) - Dr.ssa Giovanna Lavagna
tel: 019. 623.4955
Coordinatore TSLB – Dr.ssa Francesca Guerra
Tel.019.623.4955
Presentazione della Struttura Dipartimentale Biologia
Molecolare
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La Struttura Dipartimentale è composta da uno staff operativo nell’ Ospedale S.Corona
dal 1980.
Nel 1988 i Dirigenti Biologi introducono il settore di “ ImmunoPatologia e Virologia”
nell’ambito del Servizio Trasfusionale. Tale settore, inizialmente, comprende diagnosi di
laboratorio di Epatite B,C, positività ad HIV con metodica di screening MEIA e di
diagnostica differenziale RIBA ed Western-blot ; Immunopatologia per lo studio delle
patologie autoimmuni, con metodica IFA ed EIA; Studio del complesso T.O.R.C.H., con
metodiche IFA ed EIA; Citofluorimetria a flusso per lo studio di pannelli Immunologici di base
e pannello Immunologico per pazienti HIV positivi.
Dal 1995 i biologi iniziano l’ attività di Biologia Molecolare Diagnostica per HCV e HIV;
nel 1997 viene estesa alla validazione biologica per unità di sangue legata, inizialmente,
all’analisi “PCR “ ( reazione di polimerizzazione a catena) di HCV-RNA, per essere estesa
successivamente all’analisi di HIV-RNA e HBV-DNA, con metodica molecolare “PCR REAL
TIME” (TRINAT).
Dal marzo 2003, il settore diventa Struttura Semplice “ Virologia e Biologia Molecolare,
iniziando l’attività di genetica su DNA umano per lo studio di celiachia, trombofilia ed
emocromatosi. Dal primo agosto 2008 la Struttura presta la propria attività molecolare per
il Centro di Validazione TRINAT del Ponente Ligure, secondo il progetto Regionale di
centralizzazione ( Delibera G.R. n.587 1/06/07). Dal 2010 la Struttura Semplice diventa
Dipartimentale, con l’obiettivo di centralizzare l’ attività molecolare nell’ambito del
Dipartimento di Patologia Clinica.
dal I maggio 2011 l’attività di TRINAT viene trasferita alla S.C. Trasfusionale, nell’ambito di
un percorso condiviso per la centralizzazione dell’attività molecolare ( I percorso/sinergia
comune con un’altra Struttura del Dipartimento)
Presentazione della Struttura Dipartimentale Biologia
Molecolare
Aree di eccellenza
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INDAGINI VIROLOGICHE DI I E DI II LIVELLO
VIROLOGIA MOLECOLARE
GENETICA
FARMACOGENETICA
Per la diagnosi di laboratorio di Celiachia, dopo un semplice prelievo di sangue del paziente,
viene effettuato uno studio di Laboratorio completo, dai test di screening alla Biologia
molecolare( I test di screening, in immunofluorescenza ed immunoenzimatica,sono stati
trasferiti,per un percorso diagnostico condiviso di centralizzazione dell’autoimmunità, alla
S.C. Laboratorio di Patologia Clinica ,dal gennaio 2012: II percorso/sinergia comune con
un’altra Struttura del Dipartimento) . Il test in Biologia Molecolare per lo studio della
predisposizione alla Malattia Celiaca, prevede la ricerca di più gruppi allelici predisponenti:
DR3DQ2, DR7DQ2, DR5DQ7 e DR4DQ8; Per lo studio di Patologie Trombofiliche, su DNA
umano estratto da sangue intero, si ricerca, a carico del gene del Fattore V di Leiden, la
mutazione R506Q, del fattore V HR2 la mutazione H1299R, , Fattore II protrombina- la
mutazione G20210A e per il gene di Omocisteina-la-mutazione-C677T.
Per La FARMACOGENETICA , siamo l’unico laboratorio del Ponente Ligure ad effettuare lo
Studio di polimorfismi per IL 28B (per epatite c +)e della presenza di allele HLA CLI B*5701
( per HIV+)
Tipologia d’analisi
DESCRIZIONE
Metodica
Virus epatite B (HBV) HBsAg
Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT
Virus epatite C (HCV) Anticorpi
Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT
3
Virus immunodef. HIV1-2 ac/Ag p24
Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT
3
Virus HCV Immunoblotting RIBA
Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT
7
Virus HIV1-2 immunoblotting
Western blot
Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT
3
Virus epatiteB (HBV) Anticorpi HBcAg
Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT
3
Virus epatiteB (HBV)Anticorpi HBcAg-IgM
Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT
3
Virus epatiteB(HBV)Anticorpi HBeAg
Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT
3
Virus epatite B(HBV)Anticorpi HBsAg
Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT
3
Virus epatite B(HBV)Antigene HBeAg
Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT
3
Virus epatite A(HAV)Anticorpi IgG
Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT
3
Virus epatite A(HAV)Anticorpi IgM
Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT
3
Tempi
Di
conseg
na( gg)
3
Tipologia d’analisi
DESCRIZIONE
metodica
Tempi
Virus HBV-DNA quantitativa
PCR Real- time con Sistema di preparazione/
estrazione/rivelazione COBAS S-601 ROCHE (
*
7-10
(se urgente
PCR Real- time con Sistema di preparazione/
estrazione/rivelazione COBAS S-601 ROCHE (
3-7
(se urgente
Virus HCV-RNA quantitativa
di
cons
egna
gg
48
0re)
48
ore)
Virus HIV-RNA quantitativa
PCR
Real- time con Sistema di preparazione/
estrazione/ amplificazione-rivelazione COBAS
S-601 ROCHE
Genotipi HCV (sempre associata a HCVRNA)
PCR Real- time con Sistema di preparazione/
estrazione
COBAS
S-601
ROCHE;
amplificazione-rivelazione TAQMAN 48 ROCHE
3-7 (
se
urge
nte
in
giorn
ata)
7-10
Tipologia d’analisi
Metodica
Tempi di
consegna
(gg)
Preparazione manuale del campione e
delle MMX ;PCR per amplificazione
in termociclatore ; rivelazione in
LIPA ( Strumento INNO-LIPA
NUCLEAR LASER)
Preparazione manuale del campione e
delle MMX ;PCR per amplificazione
in termociclatore ; rivelazione in
LIPA ( Strumento INNO-LIPA
NUCLEAR LASER)
7
7
Preparazione manuale del campione e
delle MMX ;PCR Real- time su
ROTORGENE NUCLEAR LASER
7
Analisi dei polimorfismi di IL 28 B
Preparazione manuale
PCR Real- time
del
campione
7
HLA B5701 (ABACAVIR)
Preparazione manuale
PCR Real- time
del
campione
7
Preparazione manuale del
PER ESTRAZIONE
campione
//
DESCRIZIONE
Test genetico per lo studio di gruppi
allelici DQB1, DQA1, DRB1,
(gruppi allelici predisponenti
alla malattia celiaca)
Analisi Mutazione del DNA per
Fattori della Coagulazione
ESTRAZIONE DI ACIDI NUCLEICI
i
Biologia Molecolare:
percorsi/sinergie comuni ad altre
Strutture dipartimentali
ANALIZZATORE PER CENTRALIZZAZIONE DI
DIAGNOSTICA VIROLOGICA DI SCREENING
(TECNOLOGIA IN CHEMILUMINESCENZA PERFEZIONATA ABBOTT)
Sistema molecolare:
Cobas Ampliprep-TaqMan-P630
(metodiche in PCR-REAL TIME- sonde TaqMan)
Applicazioni attuali:
HCV-HIV-HBV-TNAI
(estrazione da sangue intero con TNAI e
amplificazione/rivelazione TaqMan
HCV,HIV,HBV:
PERIODO FINESTRA
Virus
giorni
HCV
4-172
HIV
7-41
HBV
9- 92
Infezione da HIV - profilo sierologico
anti-HIV
HIV-RNA nel plasma
Viremia
(infettante)
HIV-DNA (PCR)
in PBMC
Esposizione
HIVAg (p24)
0
10
20
30
40
50
60
Giorni pre/post infettività dall’esposizione
70
80
Test molecolari per virologia:
sensibilità a confronto
•
PCR-REAL TIME PER DONAZIONI DI
SANGUE :
Soglie di sensibilità ROCHE
•
•
•
1.
2.
•
HBV 3,7 UI/ml
HCV 10,7 UI/ml
HIV1 :
gr.O 154 UI/ml
Gr.M 49 UI/ml
HIV2 2,2 copie/ml
• TMA:
Soglie di sensibilità CHIRON
• HBV 7,46 UI/ml
• HCV 2,78 UI/ml
• HIV1 20,6 UI/ml
PCR REAL TIME PER
DIAGNOSTICA
Soglie di sensibilità ROCHE:
• HIV1-2 33 UI/ml (20 cp/ml)
• HCV
15 UI/ml
• HBV
20 UI/ml
Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan48
Software AmpliLink 3.2
• Completa automazione del processo di preparazione dei campioni di
siero o plasma: in questo modo si elimina completamente la fase di
estrazione manuale degli acidi nucleici realizzando un cospicuo risparmio
in termini di tempo-operatore.
• Riproducibilità e standardizzazione della fase pre-PCR grazie
all’automazione, che elimina tutte le variabili associate alla procedura
manuale.
• Kit dedicati, standardizzati e marcati CE
• Fino a 72 campioni a bordo dello strumento; caricamento in continuo
dei campioni per la massima versatilità di utilizzo;
• Produttività di 20 campioni all’ora per abbreviare i tempi di refertazione
e processare senza problemi anche routine importanti;
•
Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan48
Software AmpliLink 3.2
•
•
•
•
•
•
•
Software Amplilink 3.2 per la gestione completa del sistema: un solo PC e un
solo software, con interfaccia grafica semplice ed immediata, per governare a
seconda della configurazione, Cobas AmpliPrep e Cobas TaqMan 48 e 96
Backup dei dati analitici su DVD-R per una assoluta sicurezza dei dati ed
economia di spazio e costi di gestione;
Operazioni di manutenzione sullo strumento completamente guidate dal
software per rendere l’operatore completamente autonomo nella gestione dello
strumento, senza necessità di consultare guide o manuali durante il lavoro;
Riconoscimento positivo mediante codice a barre di campioni, rack e reagenti,
per la massima sicurezza e affidabilità del processo;
Principio di estrazione brevettato che utilizza particelle magnetiche di silice
con elevata affinità chimico-fisica verso gli acidi nucleici
Estrazione totale degli acidi nucleici del campione
Assenza di contaminazioni di qualsiasi tipo: i campioni vengono aspirati e
dispensati da un puntale dedicato dentro appositi contenitori (SPU), Sample
Processing Units: tutto il materiale che viene a contatto con il campione è
monouso. Una lampada UV incorporata nello strumento può essere accesa tra
una seduta e l’altra per garantire la sterilità delle superfici di lavoro.
Strumentazione:
Cobas Ampliprep-TaqMan 48
Applicazioni attuali:
HCV per Genotipo
GENOTIPI HCV
• I GENOTIPI DELL'HCV
Il virus dell'epatite C non è omogeneo e si
riconoscono almeno 6 genotipi principali.
Seguendo la classificazione di Simmonds i genotipi
sono numerati dall' 1 al 6 e i sottotipi sono classificati
in a, b, c.
L'importanza della determinazione del genotipo
risiede nel fatto che tali genotipi rispondono
differentemente alla terapia: migliore risposta si
ottiene con i genotipi 2 e 3 .
PCR REAL TIME : MICROARRAY
•
Un microarray di DNA
(comunemente conosciuto come
GENE CHIP, CHIP A DNA, BIOCHIP
o matrici ad alta densità) è costituito
da un insieme di microscopiche
sonde di DNA attaccate ad una
superficie solida come vetro, plastica,
o chip di silicio formanti un array
(matrice). Tali array permettono di
esaminare simultaneamente la
presenza di moltissimi geni all'interno
di un campione di DNA (che spesso
può rappresentare anche tutto il
genoma o il trascrittoma di un
organismo). Un utilizzo tipico è
quello di confrontare il profilo di
espressione genica di un individuo
malato con quello di uno sano per
individuare quali geni sono coinvolti
nella malattia o per lo studio di
antibiogramma per patogeni.
COBAS® TaqMan®
Amplificazione/rivelazione
ROTORGENE
• ATTUALE UTILIZZO ,CON
TECNOLOGIA PCR-REAL
TIME ( sonde FRET o sonde
TaqMan )PER:
• FARMACOGENOMICA
IL 28 B per epatite C
HLA cl.I B* 5701 per HIV+
• TEST GENETICO PER
TROMBOFILIA
mutazioni a carico di
• Fattore V Leiden,
• Fattore V HR2,
• Fattore II protrombina,
• MTHFR per omocisteina
INTERLEUCHINA 28B: TEST PREDITTIVO PER LA
PROGNOSI E LA TERAPIA DELL'EPATITE C
•
Il virus dell'epatite C è un RNA virus a singola elica e appartiene alla famiglia delle
Flaviviridae. La sua principale via di trasmissione è quella sanguigna o percutanea.
La diagnosi sierologica è basata sulla determinazione di anticorpi anti-HCV, mentre la
presenza del virus nel sangue è rilevata da HCV-RNA quantitativo e dalla determinazione
dei genotipi dell'HCV.
•
La mappatura del genoma umano ha individuato le basi della nostra "diversità" che si
riassumono nel concetto di POLIMORFISMO.
Il polimorfismo è una modificazione del DNA molto frequente che non altera il funzionamento
del DNA stesso, ma ne influenza le capacità sintetiche.
Il polimorfismo del gene IL28B ha un rapporto con la maggiore o minore probabilità di
risposta al trattamento dell'epatite C cronica.
•
Il polimorfismo più "predittivo ed utile" riguarda i nucleotidi Citosina (CC) ed ha evidenziato
una maggiore risposta terapeutica nei soggetti con epatite cronica, in particolare con i
genotipi 1 di HCV. In presenza di polimorfismo CC l'eliminazione definitiva del virus
dell'epatite C dopo terapia è stata osservata in circa il 71% di casi. (Thomas et all. Nature
2009)
IL 28 B
IL TEST
Il test esegue la ricerca di:
3 genotipi per RS 60:
•
•
•
omozigote TT : (polimorfismo compatibile con possibile tipologia di paziente non responder )
omozigote CC : (polimorfismo compatibile con possibile tipologia di paziente responder )
eterozigote TC : (polimorfismo compatibile con possibile tipologia di paziente medio o
scarso responder )
3 genotipi per RS 17:
•
•
•
omozigote TT : (polimorfismo compatibile con possibile tipologia di paziente responder )
omozigote GG :(polimorfismo compatibile con possibile tipologia di paziente non responder )
eterozigote TG : (polimorfismo compatibile con possibile tipologia di paziente medio o
scarso responder )
. Nelle note viene sempre indicato quanto segue:
“data la particolare tipologia d’analisi si consiglia di valutare il risultato nell’insieme degli
accertamenti effettuati ed in base alla storia clinica del paziente”.
• Il test viene effettuato su Rotorgene, PCR Real time, sonde Fret.
HLA B*5701
• Il farmaco antiretrovirale ( inibitore a trascrizione inversa,
analogo ai nucleosidi) ABACAVIR, nelle prime 6 settimane di
trattamento in soggetti affetti da infezione da HIV, scatena
una reazione immunomediata ,nel 5-8% dei casi.
• Da tempo è stata riscontrata l’associazione tra
l’ipersensibilità all’ Abacavir e la presenza di un allele del
sistema HLA: B*5701
• Test farmacogenomico molecolare per lo studio del
complesso maggiore di istocompatibilità di classe I, allele
HLA B*5701,da effettuare a tutti i pazienti HIV positivi, trattati
con Abacavir.
• effettuato su Rotorgene, PCR Real time, sonde TaqMan.
HLA CL.I- B*5701
•
1.
IL TEST si basa su due processi:
Isolamento del DNA genomico dai campioni
( su estrattore MagnaPure ROCHE)
2. Amplificazione Real TM con primer allele-specifici ( sonde TaqMan)
N.B. il test contiene un controllo interno IC , gene beta-globina umano, che
consente di controllare la presenza di materiale cellulare nel campione.
GENETICA PER CELIACHIA
• Estrazione con TNAI
(da 400 ul di sangue intero)
• Estrazione con MagnaPure
( da 200 ul di sangue intero)
GENETICA PER CELIACHIA HLA cl.II e PER HLA cl.I B27:
(TERMOCICLATORE PER PCR E PROFIBLOT T 48 PER LiPA)
• PCR End Point
• Line Probe Assay
( ibridazione inversa su striscia)
AMPLIFICAZIONE GENICA
mediante PCR
(Reazione Polimerasica a Catena)
• DENATURAZIONE:il DNA è denaturato a 9496°C,si ottengono 2 catene singole
• IBRIDAZIONE
: il DNA ,a 56-65° C è ibridato da
coppie di primer specifici alla
sequenza bersaglio
•
ESTENSIONE
:nel DNA ibridato a 72°C vengono
aggiunti ,grazie alla taq polimerasi, i
dNTPs complementariamente alla
catena di DNA preesistente.
Malattia celiaca e associazioni HLA
CL.II
DQ2
•
•
•
•
DR3-DQ2
DR3-DQ2, DR3-DQ2
DR3-DQ2 ,DR7-DQ2
DR5-DQ7,DR7-DQ2
DQ8
• DR4-DQ8
TEST DI CONFERMA
ImmunoBlotting per HCV/HIV1-2
HIV-1 Genome
Most conserved regions chosen to enable broad HIV-1 subtype detection
5' LTR
LTR 3'
env
pol
gag
Regions targeted by capture probes and amplification primers
p17
p24
Matrix Protein
(MA)
Capsid Protein
(CA)
Env 10
gp128
Surface Protein
(SU)
PR
Protease
(PR)
p7
p6
Nucleocapsid
(NC)
gp41
Transmembrane Protein
(TM)
RT
IN
Reverse Transcriptase
(RT)
Integrase
(IN)
GENOMA HCV
ESTRAZIONE DI ACIDI NUCLEICI
• Estrazione con TNAI
• Estrazione con MagnaPure
(A MICROPARTICELLE DI SILICE MAGNETICA
(A MICROPARTICELLE DI SILICE MAGNETICA,
TARGET- SPECIFICA)
•
•
Estrazione generica da sangue
24 campioni in due ore e 30 minuti
•
RESA: DA 400 ul sangue intero= 100 ul eluato
con una concentrazione pari a 20-50 ng DNA O
RNA
(COSTO ATTUALE 5 EURO A TEST)
Applicazioni attuali:Estrazione generica da sangue)
•
•
•
•
Possibili ulteriori applicazioni:
Estrazione generica da qualsiasi materiale
biologico,
RESA: DA 200 ul sangue intero= 200 ul eluato
con una concentrazione pari a 20-50 ng DNA O
RNA
8 campioni ogni 20 MINUTI,
(COSTO ATTUALE 5 EURO A TEST)