ANALISI DELL’RNA
Northen blot
E’ un metodo simile a quello di traferimento e di
ibridizzazione del DNA (Southern blot) e si usa per
sondare molecole di RNA.
Gli mRNA sono molecole brevi, in genere meno di 5
kb, per cui non c’è necessità di digerirli con un
enzima prima della separazione elettroforetica.
Separazione elettroforetica trasferimento a
nitrocellulosa ibridizzazione con sonda marcata
rivelazione.
Il metodo è utile per studiare l’espressione di geni
specifici. Tuttavia, non è una tecnica molto sensibile.
Northern Blot
Ibridizzazione in situ
L’ibridizzazione in situ permette di osservare
la posizione precisa di un RNA all’interno di
una cellula.
Le sonde per l’ibridizzazione possono essere
radiomarcate con 3H, coniugate ad un
fluoroforo (sonde fluorescenti) od a cui è
coniugato un antigene.
Saggio di protezione dalla Rnasi
(RPA)
La RPA è un metodo sensibile per rivelare e quantificare
trascritti specifici di mRNA in una miscela complessa di
RNA totale o di molecole di mRNA.
L’ibridizzazione di una sonda marcata di RNA con un
trascritto protegge parte della sonda dalla digestione con
una Rnasi che degrada specificamente RNA a singolo
filamento.
La quantità della sonda protetta dal trascritto è
proporzionale alla concentrazione del trascritto
metodo quantitativo.
Saggio di protezione dalla Rnasi
(RPA)
La RPA è almeno 10 volte più sensibile del
Northen blot ed è più accurata e diretta dell RTPCR.
Inoltre, permette di ottenere informazioni che
non possono essere ottenute in modo accurato
con gli altri metodi. Per esempio, permette di
identificare i siti di inizio della trascrizione, di
studiare le giunzioni introni-esoni, e di rivelare
differenze molto piccole tra trascritti correlati.
Espressione Genica
E’ un processo molto complesso e finemente
regolato che permette ad una cellula di
rispondere dinamicamente sia agli stimoli
ambientali che alle sue stesse necessità di
cambiament0.
DNA RNA Proteine
In ogni istante della propria vita ogni
cellula umana contiene:
• 20.000 geni
• 10-15.000 mRNA diversi
• > 100.000 proteine diverse
Misurare l’espressione di un gene
significa....
Dare una valutazione quantitativa della
presenza di trascritti (molecole di
mRNA) o delle proteine codificate da
quel gene nelle cellule in esame
Genoma: l’insieme di tutte le molecole di
DNA presenti nel nucleo di ogni cellula.
Trascrittoma: l’insieme degli RNA
messaggeri che la cellula sta esprimendo in
un dato momento.
Proteoma: la collezione completa delle
proteine che la cellula sta esprimendo in un
dato momento.
Analisi del trascrittoma
analisi dei profili globali di
espressione genica a livello di
mRNA
Espressione genica differenziale:
valuta le differenze nell’espressione genica tra
due trascrittomi.
cellule trattate con un composto esogeno (ad es.
un farmaco) a confronto con cellule non trattate.
un tessuto tumorale a confronto con uno sano
Tecnologia dei
microarray
Sfrutta la
capacità di una
data molecola
di mRNA di
ibridizzare con
il DNA stampo
da cui è stata
generata.
Un microarray consiste in un supporto di vetro o di silicio
su cui sono stati depositati (“spotted”) in maniera
ordinata numerosi campioni di DNA di sequenza nota,
corrispondenti a diversi geni. Durante l’ibridazione
questi legheranno specificamente le sequenze
complementari che troveranno in soluzione.
I campioni da depositare in maniera ordinata sui
microarray possono essere ottenuti in vari modi: a)
cDNA clonati e purificati; b) frammenti genici amplificati
mediante PCR; c) oligonucleotidi sintetizzati
chimicamente e poi depositati sul microarray; d)
oligonucleotidi sintetizzati direttamente sul supporto
(Affimetrix).
Agilent Microarrays
Materiale da analizzare:
RNA estratto dalle cellule o dal tessuto e
marcato con fluoroforo;
Per aumentare l’efficienza la preparazione
di RNA viene usata come stampo per una
RT-PCR sintesi di cDNA dallo stampo di
RNA medinate trascrittasi inversa
amplificazione mediante PCR in presenza di
precursori fluorescenti per la marcatura
delle molecole.
DNA microarray
DNA microarray
Cianine
DNA microarray
Acquisizione dell’immagine mediante laser
scanner
Cy3
Cy5
Scanner a due laser
– Lunghezze d’onda di eccitazione dei
fluorocromi
• 635 nm - Red
• 532 nm - Green
• Canali separati in acquisizione
– formazione di due immagini
• Codifica su 16 bit
– 2^16 = 65536 livelli di colore
• Occupazione di memoria
– 130 MB c.a.
Analisi dei dati
Quantizzazione dei dati
• “Gridding” dell’immagine GAL file.
• Segmentazione:
spaziale;
per intensità;
• Estrazione dell’intensità di segnale e
di background:
media del pixel;
mediana dei pixel.
segnale
background
Pre-trattamento dei dati
• Correzione del background:
“spotting” scorretto;
legami aspecifici del campione con il supporto;
fluorescenza propria dei reagenti.
• Sottrazione dal segnale utile dal suo valore calcolato:
su un intorno ristretto dello spot;
su una sezione dell’array;
su un intorno largo dello spot;
su spot dedicati.
• Applicazione di indicatori di qualità agli spot per la
selezione dei geni giudicati idonei per la successiva
normalizzazione.
SNR = Mediana del segnale / SD del rumore
Normalizzazione
• Disomogeneità nel processo di deposizione delle sonde;
• Quantità iniziali diverse di RNA;
• Diversa efficienza di incorporazione dei due fluorocromi;
• Disomogeneità di ibridizzazione sul vetrino;
• Diversa efficienza di emissione dei due fluorocromi;
• Diversa efficienza dello scanner nel leggere i due canali.
Variabili che possono influenzare i risultati di un esperimento
di microarray:
Determinazione di un fold change scorretto
Fold Change gene X = Valore di intensità del Trattato / Valore
di intensità del Controllo
Espressione differenziale del gene X nel campione trattato
rispetto al campione di controllo
Normalizzazione
E’ necessario che la normalizzazione tenga conto del
disegno dell’esperimento (confronto realizzato):
• Normalizzazione within array
Normalizzazione between arrays
La normalizzazione va applicata ad un gruppo di
geni appositamente scelti:
• Tutti i geni sull’array
• Geni espressi in maniera costante (housekeeping)
• Controlli positivi (spiked) e serie di diluizioni
(titration).
Normalizzazione
Per correggere le variabili (sistematiche) che possono
influenzare i risultati di un esperimento di microarray.
A =½ log (R*G)
M = log (R/G)
Estrazione dei dati di espressione genica
Metodi empirici
-selezione di una soglia empirica sulla
distribuzione dei rapporti delle intensità (log
[Trattato/Controllo])
Metodi statistici
- t-test, ANOVA, B-statistic
Clustering
- raggruppamenti sulla base di somiglianze
Microarray ad oligonucleotidi Agilent Whole
Genome
Human
44k 60meri
sintetizzati
sul vetrino mediante
inkjetting
41000 trascritti
Rat
44k 60meri
41000 trascritti
Yeast (S. cerevisiae)
2x44k 60meri
6256 trascritti
L’intensità della fluorescenza è proporzionale alla
quantità di molecola target nella soluzione e, quindi,
costituisce una stima della quantità di RNA espresso
dalla cellula.
Affimetrix
microarray
Applicazioni in ricerca e medicina
del DNA microarray
Valutazione di eventuali alterazioni dell’espressione
genica.
Evidenziazione di polimorfismi a singolo nucleotide
(SNP).
Evidenziazione di aberrazioni nei profili di metilazione.
Valutazione di variazioni nel numero di copie geniche.
Evidenziazione di “splicing” alternativi del mRNA.
Valutazione di cambiamenti dell’attività funzionale di
fattori di trascrizione.
Identificazione della presenza di patogeni.
Molte di queste applicazioni si trovano ancora
in una fase di sviluppo e validazione, l’analisi
dei profili di espressione genica ha subito un
processo di profonda ottimizzazione della
metodologia, che può oggi avvalersi di array di
alta qualità, standardizzazione dei protocolli di
ibridazione, tecnologie di analisi delle
immagini accurate e approcci computazionali
robusti, diventando uno strumento molto
potente e relativamente semplice per
correlare condizioni fisiologiche e patologiche
a profili distintivi di espressione genica,
conosciuti come “gene expression signatures”
(van’t Veer L.J. et al., 2008).
Ad oggi, l’analisi sistematica di profili di
espressione genica di campioni tumorali
rappresenta l’applicazione del microarray più
usata e standardizzata in campo oncologico,
che ha concretamente contribuito ad una più
accurata valutazione di molte patologie
tumorali attraverso l’identificazione di profili
definiti di espressione di gruppi di geni
associati con specifiche caratteristiche
tumorali.
Tumore
Applicazione
Referenza
Carcinoma mammario
diagnosi/prognosi
efficacia terapeutica
Sotiriou et al. ,2003
Foekens et al., 2008
Leucemia
diagnosi
diagnosi
prognosi
efficacia terapeutica
Kohlmann et al., 2008
Alizadeh et al., 2000
Rosenwald et al.,2002
Ge et al ., 2008
Melanoma
prognosi
diagnosi
efficacia terapeutica
Winnepenninckx et al., 2006
Talantov et al., 2005
Critchley-Thorne et al., 2007
Epatocarcinoma
prognosi
prognosi
efficacia terapeutica
Lee J.S. et al., 2004
Budhu A.S. et al., 2005
Zhu X.D. et al., 2008
Neuroblastoma
prognosi
efficacia terapeutica
Chen Q.R. et al., 2008
Schulte J.H. et al., 2003
Carcinoma renale
prognosi
diagnosi/prognosi
efficacia terapeutica
Yao M. et al., 2008
Jones, Pantuck, 2008
Pantuck, 2007
Carcinoma prostatico
prognosi
diagnosi
efficacia terapeutica
Zhang et al., 2008
Fromont et al., 2008
Lerner et al., 2008
