In condizioni fisiologiche
esiste un equilibrio tra le
specie ROS e le difese
antiossidanti
I fattori abiotici sono tra le
principali cause di incremento
delle specie ROS nel nostro
organismo
e,
se
tale
incremento
non
viene
neutralizzato dalle nostre
difese antiossidanti, provoca lo
STRESS OSSIDATIVO
INQUINAMENTO,
METALLI PESANTI,
ALCOL
FUMO,
RADIAZIONI
IONIZZANTI,
RAGGI UV
CATTIVA
ALIMENTAZIONE,
FARMACI
INCREMENTO
DEI ROS
INTENSA
ATTIVITA’ FISICA
Lo Stress ossidativo è uno stress chimico
indotto dalla presenza, in un organismo
vivente, di un eccesso di specie chimiche
Difese
antiossidanti
reattive, generalmente (ROS), secondario a:
un’aumentata produzione delle stesse
e/o a una ridotta efficienza dei sistemi
fisiologici di difesa antiossidanti.
ROS
Tutte le SPECIE REATTIVE
DELL’OSSIGENO possiedono attività
OSSIDANTE
Elettrone spaiato
OSSIDAZIONE
+
A
Radicale
(ossidante)
C
C
Molecola bersaglio
(doppio legame C-C)
A
+
Nuova molecola
(ridotta, stabile)
C
C
Nuovo radicale
(ossidante)
L’ossidazione, ovvero il trasferimento di
uno o più elettroni, è la base chimica
dello STRESS OSSIDATIVO
La propagazione dei radicali liberi
innesca una REAZIONE A CATENA che
si espleta in tre fasi :
FASE INIZIALE :
INNESCO
FASE INTERMEDIA :
PROPAGAZIONE
(a sfavore delle
macromolecole biologiche)
FASE FINALE:
TERMINAZIONE
(sistemi di difesa
antiossidante)
ENZIMATICI:
• Catalasi
• Superossido dismutasi
• Glutatione perossidasi
NON ENZIMATICI:
• VITAMINICI (vitamina C e E)
• NON VITAMINICI (polifenoli,
glutatione)
Tutti gli antiossidanti possiedono
attività RIDUCENTE
CATALASI
E’ un enzima presente principalmente nei
PEROSSISOMI ma anche nella frazione
citosolica dove rimuove con efficienza H2O2
(1 molecola di catalasi può convertire ~ 6
milioni di molecole di H2O2 ad acqua ed
ossigeno ogni minuto!).
Rappresenta la difesa cellulare primaria contro il perossido di idrogeno H2O2
LA SUPEROSSIDO DISMUTASI
E’ uno dei più importanti enzimi antiossidanti nei mammiferi.
Esistono molte forme comuni di SOD che possono avere cofattori
metallici diversi.
Nell’ uomo ne sono presenti tre differenti tipi:
- Cu, Zn- SOD citosolica,
-Mn- SOD mitocondriale (biologicamente più importante)
- SOD extracellulare
Sono tutte coinvolte nella dismutazione dell’anione superossido
(O2- ), cioè nella rimozione catalitica del radicale superossido
combinandolo a protoni per formare perossido di idrogeno e
ossigeno:
2 O2- + 2H+
H2O2 + O2
Rappresenta la difesa cellulare primaria contro l’anione superossido O2- .
LA GLUTATIONE PEROSSIDASI
(GPX )
Metalloproteina contenente Selenio (cofattore), localizzata sia a livello
della membrana cellulare che a livello extracellulare. Esistono due forme:
Se - dipendente
Se - indipendente.
Catalizza, utilizzando il glutatione (GSH) come substrato e agente
riducente, la riduzione di H2O2 ad acqua . Il perossido è un potenziale
substrato della reazione di Fenton. Il GSH nella forma inizialmente ridotta
(GSH) viene ossidato (GSSG).
H2O2 + 2GSHrid
2H2O + GSSGox
Rappresenta un importantissimo sistema di difesa contro i perossidi.
IL GLUTATIONE
• E’ un TRIPEPTIDE costituito da 3 amminoacidi : cisteina, glutammato e
glicina.
• E’ il più importante antiossidante tiolico solubile intracellulare che
l'organismo è in grado di produrre. La sua concentrazione è molto elevata
nel citosol, nei nuclei e nei mitocondri.
• E’ il cofattore dell’enzima GLUTATIONE PEROSSIDASI e Il suo potere
antiossidante deriva dalla capacità del gruppo tiolico – SH del residuo
cisteinico di donare facilmente un e- passando dalla forma ridotta (GSH)
alla forma ossidata (GSSG)
GLUTATIONE REDUTTASI
• E’ rigenerato dall’ enzima
• E’ un enzima NADPH – dipendente
• Durante la riduzione del glutatione , il potere riducente è ossidato
a NADP+ attraverso gli elettroni ceduti
Il rapporto GSH/GSSG rappresenta una buona
misura dello stress ossidativo di un organismo
La VITAMINA C o ACIDO
ASCORBICO
E’ un antiossidante non enzimatico idrosolubile,
spiccatamente acido.
E’ presente sia in forma ossidata (deidroascorbato) che
in forma ridotta (acido ascorbico).
Interviene nella rigenerazione di α-tocoferolo mediante
una reazione di ossidoriduzione (dona 1 elettrone al
radicale tocoferrosile):
Ascorbato + α-tocoferrosileox
Deidroascorbato + α-tocoferolorid
La rigenerazione di ascorbato ridotto avviene per opera
di una ascorbato reduttasi NADPH-dipendente
La sua attività antiossidante si esplica principalmente in
associazione ad enzimi antiossidanti, carotenoidi (vitamina
A) e vitamina E (ACE)
Ascorbato + α-tocoferrosileox
Deidroascorbato + α-tocoferolorid
La VITAMINA E o
α - TOCOFEROLO
Esistono 8 tipi di vitamina E, fra queste l’ α -tocoferolo è la
forma biologicamente più potente e attiva e rappresenta il più
importante antiossidante liposolubile utilizzato dalle cellule. E’
presente sulle membrane cellulari e nelle lipoproteine
plasmatiche. La sua attività antiossidante:
è volta alla prevenzione dell’ossidazione degli acidi grassi
polinsaturi , evento chiave nello sviluppo della perossidazione
lipidica
L’a-tocoferolo protegge le membrane dal danno
ossidativo in quanto blocca le reazioni a catena
caratteristiche del processo di perossidazione lipidica
delle membrane biologiche.
L’α – tocoferolo è in grado di bloccare la
perossidazione lipidica donando l’e- del suo
gruppo idrossilico (OH)
ai radicali
perossilipidici, rendendoli meno reattivi e
bloccando la loro perossidazione.
Tale reazione trasforma l’α-tocoferolo in un
radicale α-tocoferossilico, piuttosto stabile che
può reagire con la vitamina C per riformare l’αtocoferolo.
Gli effetti dei RADICALI LIBERI sulle
macromolecole biologiche
LIPIDI
Attacco agli acidi
grassi polinsaturi di
membrana con
PEROSSIDAZIONE
LIPIDICA
Perdita di permeabilità
Riduzione di flessibilità e
selettività
Irrigidimento
PROTEINE
Ossidano i residui aa delle
proteine per formare
DERIVATI IDROSSILATI.
Alterazione strutturale e
funzionale della proteina
Ossidazione
Inattivazione
Denaturazione
DNA
Ossidano le basi
azotate generando
BASI ANOMALE (idrossi
- guanina o idrossi adenina)
Mutazioni
Induzione alla
cancerogenesi
METODI PER LA
DETERMINAZIONE DI
ANTIOSSIDANTI NON
ENZIMATICI
ESTRAZIONE ANTIOSSIDANTI DA
TESSUTO FRESCO
Pesare 0,3 gr di tessuto fresco (polpa, frutto,
foglia)
Rottura meccanica mediante pestelli e forbicine
(in ghiaccio)
SONICARE (induce lisi cellulare e rottura rapida
e completa delle membrane )
OMOGENARE (POLYTRON)
BUFFER ESTRAZIONE IDROSOLUBILE
(metanolo, acqua e acido formico)
Lasciare al buio per 2 ore in agitazione blanda
Centrifugare 3500
rpm, 15 min a 4° C
Surnatante
(S1)
pellet (P1)
Sottoposto a 2^ estrazione
Centrifugare 3500
rpm, 15 min a 4° C
Surnatante
(S2)
(S1) e (S2) sono stati riuniti:
(S3) ESTRATTO IDROFILO
pellet (P2)
•Buffer estrazione: ACETONE
•Agitazione blanda per 2 ore al
buio
…
Centrifugare 3500
rpm, 5 min a 4° C
Surnatante
(S4)
pellet (P3)
Sottoposto a 2^ estrazione
Centrifugare 3500
rpm, 5 min a 4° C
Surnatante
(S5)
(S4) e (S5) sono stati riuniti:
(S6) ESTRATTO LIPOFILO
pellet (P4)
buttati
DETERMINAZIONE DELLA CAPACITA’
ANTIOSSIDANTE (IDRO – LIPO)
SOLUBILE TOTALE
Saggiare la CAPACITA’ ANTIOSSIDANTE (IDRO – LIPO)
SOLUBILE TOTALE significa rappresentare ciò che resta degli
antiossidanti dopo aver neutralizzato i ROS
Se c’è stress ossidativo =
[ ROS] ma
La capacità
antiossidante
La capacità antiossidante totale è diversa dalla determinazione
della concentrazione totale degli antiossidanti
1^ METODO: DETERMINAZIONE DELLA
CAPACITA’ ANTIOSSIDANTE
IDROSOLUBILE
Si allestisce un saggio in eppendorf (Vfinale = 1 ml)
I campioni (C) : surnatanti idrosolubili (S3) precedentemente estratti
Bianco
H2O (μl)
110,7
C1
C2
C3
10,7
10,7
10,7
Sample (μl)
/
100
100
100
Ammonio
Molibdato(μl)
800
800
800
800
Acido solforico
(μl)
33,3
33,3
33,3
33,3
Fosfato di sodio
(μl)
56
56
56
56
Incubare a 95°C nel bagnetto termostatato per 1 ora e 30 minuti
Raffreddare le mix di reazione
Lettura spettrofotometrica ( λ = 695 nm)
Principio del metodo :
Si basa sulla riduzione del molibdato con conseguente
formazione del fosfomolibdato (il blu di molibdato) in
ambiente acido .
La riduzione avviene ad opera dell’ACIDO ASCORBICO
Lo standard di riferimento per la costruzione
della retta
di
calibrazione
usato
è:
L’ACIDO
ASCORBICO (1 nm/μl):
y= 0,0118 x
equazione della retta
1.4
1.2
1
0.8
Abs (nmol)
0.6
nM
0.4
0.2
0
0
20
40
60
(nmol)
80
100
120
10
20
40
80
100
Abs (695 nm)
0,114
0,208
0,447
0,945
1,2
capacità antiossidante idrosolubile
espressa in nM totali/gr e rappresentata su di
un ISTOGRAMMA
Y = 0,0118 x
equazione della retta
1) X =
Abs
0,0118
= nM
2)
nM / µlcaricati = nM/ µl
3)
(nM / µl ) X Vfinale = nM totali
4)
(nM totali / gr peso fresco )
2^ METODO: DETERMINAZIONE DELLA
CAPACITA’ ANTIOSSIDANTE
LIPOSOLUBILE
Si allestisce un saggio in eppendorf (Vfinale = 1 ml)
I campioni (C) : surnatanti liposolubili (S6) precedentemente estratti
Bianco
H2O (μl)
110,7
C1
C2
C3
10,7
10,7
10,7
Sample (μl)
/
100
100
100
Ammonio
Molibdato(μl)
800
800
800
800
Acido solforico
(μl)
33,3
33,3
33,3
33,3
Fosfato di sodio
(μl)
56
56
56
56
Incubare a 37°C nel bagnetto termostatato per 1 ora e 30 minuti
Raffreddare le mix di reazione
Lettura spettrofotometrica ( λ = 695 nm)
Lo standard di riferimento per la costruzione della
retta
di calibrazione usato è:
l’α – TOCOFEROLO
(1 μM/μl):
Y = 0,020 x
equazione della retta
0.7
µmol Abs
0
5
10
15
20
25
0.6
0
0,095
0,184
0,275
0,346
0,6
0.5
Abs
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
5
10
15
µmoli
20
25
30
capacità
antiossidante liposolubile espressa in
μM totali/gr e rappresentata su di un ISTOGRAMMA
Y = 0,02 x
equazione della retta
1) X =
Abs
0,02
= μM
2)
μM / µlcaricati = μM/ µl
3)
(μM / µl ) X Vfinale = μM totali
4)
(μM totali / gr peso fresco )
3^ METODO: DETERMINAZIONE DEI
POLIFENOLI TOTALI
•ANTIOSSIDANTI
ESOGENI
NON
VITAMINICI
(frutta, olive, cereali,
cioccolato, legumi secchi, thè e caffè)
•Composti organici SOLUBILI in acqua
•Formati da più gruppi fenolici
•Comprendono: TANNINI, FLOVANOIDI e
ACIDI FENOLICI
ALLESTIMENTO DEL SAGGIO (Vfinale = 1 ml)
Bianco
C1
C2
C3
FOLIN (µl)
500
500
500
500
Sample (µl)
/
100
100
100
/
/
H2O (µl)
100
/
incubare i campioni a T ambiente per 4 minuti
Carbonato di
sodio (µl)
400
400
400
400
I campioni sono lasciati al buio per 2 ore
Lettura allo spettrofotometro λ = 720 nm
Principio del metodo:
Il reattivo di folin ossida i composti fenolici in
ambiente alcalino generando una miscela di colore blu
Lo standard di riferimento per la costruzione della retta
di calibrazione usato è: L’ACIDO
GALLICO (0,1 mg/ml):
1.6
µl caricati µg
0
10
20
40
80
100
Abs
0
0
1
0,17
2
0,295
4
0,582
8
1,1
10
1,375
1.4
y = 0.1386x
1.2
1
Abs 0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
2
4
6
8
10
12
µg
Y = 0,138 X equazione della retta
1) X =
2)
Abs
0,138
= µg
µg / µlcaricati = µg/ µl
3)
(µg / µl ) X Vfinale = µg totali
4)
(µg totali / gr peso fresco )
Determinazione dei polifenoli
totali espressa in μg/grpeso fresco e
rappresentata su di un
ISTOGRAMMA
4^ METODO: metodo DPPH
(DPPH • ) il 2, 2 – difenil – 1 – picrilideazil è un radicale stabile
Il (DPPH •) in una soluzione contenete metanolo mostra un
picco max di Abs a 515 nm ( colore viola intenso)
Principio del metodo:
Si assiste alla riduzione del radicale (DPPH •) in presenza di composti
antiossidanti, con la successiva formazione di un composto stabile non
radicalico (DPPH – H). L’aggiunta di antiossidanti determina la
decolorazione della soluzione che vira dal viola intenso al giallo e, la
riduzione di assorbimento
Preparazione della soluzione – radicale: viene
preparata una soluzione di DPPH• in presenza di
metanolo ( tale soluzione è stabile solo per 12 ore)
Determinazione dell’ attivita’ antiossidante
lipofila :
allestimento del saggio (Vfinale = 1 ml) in
eppendorf e al buio
bianco
C1
C2
C3
Metanolo (μl)
30
/
/
/
DPPH•
solution (μl)
970
970
970
970
si va a leggere l’Abs iniziale (A0)
Sample
(μl)
/
30
30
30
I campioni (C) usati nel saggio sono i
surnatanti (S6) di natura lipofilica
precedentemente estratti
Agitazione blanda per 15- 30 minuti a T
ambiente e al buio
Misura dell’Abs finale (A finale )
Retta di calibrazione: lo standard utilizzato
per la costruzione della retta di calibrazione è
Trolox in metanolo (20 mM): analogo della
vitamina E (equazione della retta y = a x)
L’ attività antiossidante è valutata come diminuzione di
Abs a 515 nm e, più precisamente espressa come % di
inibizione del radicale (DPPH • ) secondo l’equazione :
(%) inibizione = ( 1-A finale /A 0) · 100
Sostituendo i valori di % di inibizione
all’incognita ( y ) nell’equazione della retta e,
dividendo per i grammi di tessuto fresco, ricaviamo
l’attività antiossidante liposolubile espressa in
termini di ( mM/gr tessuto fresco)
5^ METODO: metodo ABTS
Il cromogeno 2 2 azinobis (ABTS) reagendo con
potassio persolfato genera un catione radicalico
ABTS+• di colore blu/verde con un picco max di
assorbimento a 734 nm
Il metodo è applicabile allo studio sia dell’attività
antiossidante lipofila sia dell’attività antiossidante
idrofila
Principio del metodo:
L’attività antiossidante è valutata come riduzione di
assorbimento a 734 nm del catione radicalico ABTS+• in
presenza di antiossidanti
Preparazione della retta di calibrazione (equazione della retta
y = a x) :
•Lo standard usato è il TROLOX (20 mM) in metanolo per il
calcolo dell’attività antiossidante lipofilica
•Lo standard usato è l’ACIDO ASCROBICO in acqua per il
calcolo dell’attività antiossidante idrofilica
Preparazione del catione radicalico (ABTS+• ):
acqua distillata, ABTS e una soluzione acquosa di
persolfato di potassio ( la soluzione ottenuta va
conservata al buio, a temperatura ambiente e
conservata per 2 giorni )
Determinazione dell’ attivita’ antiossidante lipofila :
allestimento del saggio (Vfinale = 1 ml) in eppendorf e al buio
bianco
C1
C2
C3
Etanolo (μl)
50
/
/
/
ABTS+•
solution (μl)
950
950
950
950
si va a leggere l’Abs iniziale (A0)
Sample
(μl)
/
50
50
50
• I campioni (C) usati nei saggi sono i
surnatanti (S6) di natura lipofilica e
surnatanti (S3) di natura idrofila
precedentemente estratti
• Agitazione blanda per 15- 30 minuti a
T ambiente e al buio
• Misura dell’Abs finale (A finale )
Determinazione dell’ attivita’ antiossidante idrofila :
allestimento del saggio (Vfinale = 1 ml) in eppendorf e al buio
bianco
C1
C2
C3
Acuqa (μl)
50
/
/
/
ABTS+•
solution (μl)
950
950
950
950
si va a leggere l’Abs iniziale (A0)
Sample
(μl)
/
50
50
50
L’ attività antiossidante è valutata come diminuzione di
Abs a 734 nm e, più precisamente espressa come % di
inibizione del radicale (ABTS+• ) secondo l’equazione :
(%) inibizione = ( 1-A finale /A 0) · 100
Sostituendo i valori di % di inibizione all’incognita ( y )
nell’equazione della retta ( Y = a X) e, dividendo per i
grammi di tessuto fresco, ricaviamo l’attività antiossidante
liposolubile espressa in termini di ( mM/gr tessuto fresco)
Sostituendo i valori di % di inibizione all’incognita ( y )
nell’equazione della retta ( Y = a X) e, dividendo per i
grammi di tessuto fresco, ricaviamo l’attività antiossidante
idrosolubile espressa in termini di ( nM/gr tessuto fresco)
