Adriana Maggi
DOCENTE DI BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE
CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO
AA 2011/2012
Lezioni 21-22 Vaccini
SISTEMA IMMUNITARIO
1. immunità aspecifica o innata
2. immunità specifica o adattativa
IMMUNITA’ INNATA NON SPECIFICA
Difese fisiche
• pelle
• muco
• mucose
Difese chimiche/umorali
• Enzimi (eg secrezioni esocrine quali saliva, lacrime ecc.)
• Mediatori infiammazione
• Complemento
Difese cellulari
• Fagociti( macrofagi, neutrofili e cellule dendritiche)
mast cell, eosinofili, basofili e cellule natural killer
IMMUNITA’ INNATA NON SPECIFICA
Caratteristiche fondamentali
capacità di rispondere ad un vasto numero di agenti patogeni
grazie al riconoscimento di un limitato numero di profili
molecolari non-self estremamente diffusi in natura (come
LPS, glicani ricchi in mannosio, RNA a doppia elica, ecc.).
La rapidità di risposta dovuta a meccanismi di riconoscimento
presenti uniformemente su tutti i componenti dell’immunità
aspecifica e sono completamente determinati a livello
genetico senza alcun bisogno di processi maturativi di tipo
epigenetico (cfr. immunità specifica).
IMMUNITA’ INNATA NON SPECIFICA- Limiti
• efficacia non sempre ottimale
• l’incapacità di adattarsi alle contromisure sviluppate dai
microrganismi patogeni
• una scarsa capacità di discriminazione tra self e non-self, che
determina lo sviluppo di danni tessutali spesso sproporzionati
rispetto all’entità dello stimolo immunogeno (infezione).
IMMUNITA’ INNATA NON SPECIFICA- Limiti
• efficacia non sempre ottimale
• incapacità di adattarsi alle
contromisure sviluppate dai
microrganismi patogeni
• scarsa capacità di discriminazione
tra self e non-self, che determina lo
sviluppo di danni tessutali spesso
sproporzionati rispetto all’entità
dello stimolo immunogeno
Microscopia elettronica di un
(infezione).
neutrofilo che ingloba un
batterio di antrace
IMMUNITA’ ACQUISITA
•
Immunità umorale: generazione di anticorpi efficace quando
il patogeno è nel tessuto ma non si è stabilito nelle singole
cellule
•
Immunità cellulo mediata: cellule citotossiche efficace per i
virus ed altri patogeni localizzati a livello intracellulare
l’immunità specifica ha la capacità di adattarsi variabilità di agenti
ambientali riconosciuti come un pericolo per l’organismo. Si calcola che
tutte le possibili combinazioni molecolari presenti in natura e in grado
di interagire con l’organismo si aggiri intorno a 1010
apprendimento – memoria - adattabilità
IMMUNITA’ ACQUISITA
Immunità umorale: anticorpi che sono prodotti dalle plasmacellule derivate
dai linfociti B. Il linfocita rileva un agente esterno grazie al suo recettore
specifico e inizia la produzione di cellule clone che in parte saranno
destinate alla memoria immunologica e in parte andranno a formare le
plasmacellule. le plasmacellule poi produrranno gli anticorpi che si
legheranno al corpo esterno bloccando i suoi siti attivi facilitando la
fagocitosi da parte dei macrofagi.
Immunità specifica cellulare: è svolta dai linfociti T citotossici che
distruggono un virus che ha già infettato una cellula. La cellula T citotossica
si lega alla cellula bersaglio, rilasciando perforina che forma canali sulla
membrana plasmatica della cellula bersaglio
La cellula B riconosce e internalizza xenocomposti e agisce quale
“antigen presenting cell” presentando gli antigeni alle cellule T
CD4+ (T helper) che, riconosciuto l’antigene causano il
differenziamento delle cellule B (nella milza e linfonodi) in
cellule di memoria o plasmoblasti
I plasmoblasti hanno la capacità di produrre anticorpi (con meno
efficienza delle plasmacellule, si dividono e sono ancora in grado
di agire quali antigen presenting cells e una vita di alcuni giorni
prima di differenziarsi in cellula plasmatica ad opera di specifici
fattori di trascrizione
Le cellule plasmatiche non hanno ipermutazione somatica, non
sono in grado di internalizzare e presentare l’antigene, hanno
una emivita che puo’ anche essere di mesi durante I quali
producono anticorpi monospecifici a una velocita di migliaia/sec.
IMMUNIZZAZIONE
• immunità congenita
• immunità naturale passiva: (es. allattamento)
• immunità naturale attiva
COMPONENTI DEL SISTEMA IMMUNITARIO
IMMUNITA’ INNATA
IMMUNITA’ ACQUISITA
Risposta aspecifica
Risposta specifica
Risposta immediata e massima
Intervallo tra esposizione e
risposta massima
Componenti cellulari e umorali
Componenti cellulari e umorali
Assenza di memoria
Memoria
Presente solo nei vertebrati
Presente in tutte le forme di vita
superiori (gnatostomi)
IMMUNIZZAZIONE
• immunità congenita
• immunità naturale attiva
• immunità naturale passiva: (es. allattamento)
• immunità artificiale attiva: vaccinazione
• immunità artificiale passiva: sieroterapia
IMMUNIZZAZIONE ATTIVA- risposta umorale
In seguito all’immunizzazione si
attivano le cellule B che esprimono
sulla superficie anticorpi specifici
nel riconoscere gli epitopi del
vaccino. Al momento del contatto
con il vaccino, in collaborazione con
le cellule T helper, la cellula B si
attiva e si ha una massiccia
proliferazione clonale. Si originano
così le plasmacellule che secernono
grandi quantitativi di anticorpi
solubili specifici
IMMUNIZZAZIONE ATTIVA- memoria
• Alcune cellule B attivate non diventano plasmacellule ma cellule della
memoria
• Persistono per anni
• Il contatto con un antigene identico induce una rapida differenziazione
a plasmacellule
• Esistono anche cellule T della memoria
Le cellule della memoria si riattivano in presenza di uno stesso patogeno e
danno luogo ad una reazione immunitaria più veloce ed efficace della
prima.
RISPOSTA SECONDARIA
Tucidide nella sua descrizione
della peste di Atene (430 ac) nota
i sopravissuti alla peste potevano
curare I malati senza contrarre la
malattia per una seconda volta
Tucidide –mosaico da Jerash,
Museo Altes, Berlino
VACCINI: le prime osservazioni
Osservo’ che i
mungitori
quotidianamente a
contatto col virus
vaccinico (cowpox)
raramente venivano
infettati
Edward Jenner (1749 - 1823)
“If you want to
marry a woman who
will never be
scarred by pox,
marry a milkmaid”
LE PRIME EVIDENZE
• Nel 1796 James Phipps (un
bambino di 8 anni) fu vaccinato
con materiale proveniente dalla
lesione provocata dal vaiolo bovino
sulla mano di Sarah Neimes
• 8 settimane dopo lo stesso
bambino fu inoculato con il virus
smallpox
agente patogeno del
vaiolo
• Il ragazzo non sviluppo’ il vaiolo
Hand of Sarah Neimes. Cowpox Pustule.
From Jenner’s Inquiry 1798
PERCHE’?
LE PRIME VACCINAZIONI
VACCINAZIONI SUCCESSIVE
1840
Disponibile per tutti
1841
Non obbligatoria
1853
Diventa obbligatoria
1871
Istituzione di uffici e personale
addetto alla vaccinazione
Multe ai genitori che non vaccinano i
figli
1948
E’ ritirata l’obbligatorieta’ della
vaccinazione
CRONOLOGIA DEI VACCINI
1790 Edward Jenner usò il virus vaccinico per proteggere dallo smallpox
1880 Luis Pasteur sviluppò il primo vaccino efficace per la rabbia
1890 Emil von Behring e Kitasato Shibasaburo svilupparono i vaccini per il
tetano e la difterite
1900 Furono messi a punto i primi vaccini per il tifo ed il colera
1910
Il vaccino per il tetano diventò disponibile
1920 Si iniziò ad usare il vaccino per la tubercolosi
1940 Si svilupparono i vaccini per l’influenza e la pertosse
1950 Vaccini per la poliomelite (orale Sabin e Salk iniettabile)
1970 Vaccino per il meningococco
1980
I primi vaccini prodotti con la tecnologia del DNA ricombinante
1990 Sviluppo di vaccini a subunità e vaccini contro malattie autoimmuni e cancro.
Produzione di vaccini in vettori virali ricombinanti
Nobel Prize in 1908
Elie Metchnikoff
Paul Ehrlich
INCIDENZA DI ALCUNE PATOLOGIE PRE E
POST-VACCINAZIONE
GLI ESITI DELLE VACCINAZIONI DI MASSA
PER IL VAIOLO
• Ultimo caso
registrato a livello
mondiale di “wild”
smallpox
• Somalia Ottobre
1977
• Ali Maalin (23 anni)
VACCINO
COS’E’?
E’ una sospensione di organismi o
una frazione di organismo, usata
per indurre una risposta
immunitaria
COME AGISCE?
Simula un’infezione in maniera
tale da attivare lo specifico
meccanismo naturale di difesa
dell’ospite contro il patogeno,
così l’ospite rimane immune dalla
malattia che normalmente segue
all’infezione naturale
IMMUNIZZAZIONE PASSIVA
COS’ E’?
E’ la somministrazione di anticorpi
specifici per assicurare all’ospite una protezione
immediata ma di breve durata.
Gli anticorpi sono isolati dal siero di pazienti
convalescenti o da donatori che hanno livelli
particolarmente alti di specifici anticorpi
ESEMPI: - Tetano
- Epatite B
- Rabbia
- Varicella Zoster
- Siero contro il veleno di vipere e serpenti
I VACCINI: CARATTERISTICHE
INNOCUO
il vaccino non deve provocare malattia o morte
PROTETTIVO il vaccino deve proteggere contro la malattia che deriva
dall’esposizione dell’agente patogeno vivo
CONFERISCE PROTEZIONE PROLUNGATA
l’esposizione deve durare per diversi anni
la protezione contro
INDUCE ANTICORPI NEUTRALIZZANTI alcuni patogeni infettano
cellule che non possono essere sostituite (es neuroni). Per prevenire
l’infezione di simili cellule sono necessari anticorpii neutralizzanti
CONSIDERAZIONI PRATICHE
Basso costo per dose, stabilità
biologica, facilità di somministrazione, pochi effetti collaterali
I VACCINI: CLASSIFICAZIONE
1- VACCINI CONVENZIONALI
VIVI
ATTENUATI
UCCISI
2- MODERNI
PERFEZIONATI CON LE TECNICHE DI INGEGNERIA
GENETICA
I VACCINI VIVI ATTENUATI
a- Mediante selezione di ceppi mutanti a virulenza o
tossicità ridotte es: antipolio orale, polivalente contro
parotite, rosolia, morbillo
b- Mediante mutagenesi chimica es: Salmonella Typhi
mutato con nitrosoguanidina
VANTAGGI: Sono sufficienti dosi minime perché proliferano
nell’ospite
SVANTAGGI: - Per i vaccini virali il loro ac. nucleico può
essere incorporato nel genoma dell’ospite
- Possono ritornare alla forma virulenta
I VACCINI VIVI ATTENUATI-metodologie
VACCINI UCCISI: CLASSIFICAZIONE
VACCINI UCCISI
I gen.
Sospensione
inattivata del
microrganismo
patogeno.
Purificazione
poco o nulla
II gen.
Purificazione del
microrganismo
patogeno o del
componente
protettivo
III gen.
Combinazione di
componenti
protettivi o
aggiunta delle
proprietà
immunizzanti ad
esso (es:
polisaccaridi
coniugati a prot
vettrici)
VACCINI UCCISI: organismi interi
•
Inattivazione del microrganismo
REAGENTI CHIMICI
(formaldeide, aldeide glutarica)
CALORE
•
Vaccini contro pertosse, colera, febbre tifoide e antipolio
•
Hanno alcuni svantaggi: inducono poca immunità cellulomediata, causano frequenti effetti avversi
VACCINI UCCISI: i tossoidi
• Alcuni batteri producono tossine
• Alcuni vaccini sono costituiti da tossine sottoposte a
trattamento chimico per eliminare le proprietà tossiche =
TOSSOIDI
• Tale preparazione ha immunogenicità relativamente
scarsa, si può migliorare adsorbendo il tossoide su una
sospensione di sali di alluminio
• Con le tecnologie moderne le tossine possono essere
detossificate con mutagenesi sito-diretta, questo
garantisce la riproducibilità della proteina mutante e
mantiene l’immunogenicità (es: tossina della pertosse)
PRODUZIONE DI UN TOSSOIDE
Toxin
Toxoid
chemical
modification
toxin moiety
antigenic determinants
VACCINI COSTITUITI DA UN TOSSOIDE:
meccanismo d’azione
How has the vaccine industry changed in the last several years?
This industry that used to be regarded as high volume, low value, low
price has been transformed into an extremely high-value, first-worldfocused industry. That's come about through the realization that
vaccination is an extremely cost-effective health care intervention and
through the development of new products for diseases that are a heavy
health burden, such as influenza and early childhood diseases. Some of
these new vaccines have become $1 billion-plus blockbusters for large
pharmaceutical companies. In the last few years, the vaccine industry has
seen a wave of consolidation driven by Big Pharma, and in my view, this is
likely to continue. In addition we have also seen the emergence of strong
regional players in the emerging markets such as India and China, as well
as greater collaboration between the public and private sectors.
Forbes intrview to Staph Leavenworth Bakali 2009
What opportunities and innovations do you see in
the industry today?
Some of the big advances in vaccine research are new
ways to discover novel vaccines, manufacturing
technologies and delivery systems. In the past,
vaccines were always administered through a needle.
Now, people are working on needle-free delivery,
including skin patches, oral vaccines, intranasal sprays
and even vaccination via food.
VACCINI VIVI ATTENUATI: nuove tecnologie
Pathogenic virus
Isolate virulence gene
2
1
Delete virulence gene
3b
Mutate virulence gene
3a
• L’attenuazione non deve deprimere l’azione immunogena
• Si deve escludere il ritorno alla virulenza del microrganismo
non mutazioni fini
I VACCINI A BASE DI POLISACCARIDI
I semplici polisaccaridi capsulari sono antigeni scarsamente immunogeni e
manifestano scarsa memoria immunologica
Il loro carattere immunogeno cresce di molto se si accoppiano chimicamente a
proteine vettrici contenenti epitopi in grado di attivare cellule T
Tra gli esempi di vaccini coniugati di terza generazione abbiamo i vaccini
polisaccaridici contro l’ Haemophilus influenzae di tipo b (ProHIBiT), recentemente
introdotti in molti programmi nazionali di immunizzazione. Esso è costituito dai
polisaccaridi capsulari del virus Haemophilus influenzae legati covalentemente al
tossoide della difterite
NUOVE TECNOLOGIE PER LA PRODUZIONE DI
VACCINI-1
1- VETTORI VIVI: per migliorare la sicurezza e l’efficacia dei
vaccini si usano come vettori per gli antigeni, virus o batteri vivi
inoffensivi
Il virus più utilizzato a questo scopo è il virus vaccino grazie ad alcune
caratteristiche:
• Sicurezza nell’uomo
• Possibilità di espressione immunogena multipla
• Facilità di produzione
• Relativa termoresistenza
• Adattabilità a varie modalità di somministrazione
UTILIZZO DEL VIRUS VACCINO COME
VETTORE
Vaccinia virus
Foreign gene
DNA
Foreign gene
Ligation
Transfection
Infection
TK gene
Tissue culture cells
Vaccinia promoter
Antibiotic
resistance marker
Homologous
recombination
selection
Foreign gene
TK-negative
recombinant virus
NUOVE TECNOLOGIE PER LA PRODUZIONE DI
VACCINI-2
2- PROTEINE ESPRESSE NELLE CELLULE OSPITI
Per aumentare la resa, facilitare la produzione e migliorare la
sicurezza dei vaccini di proteine, spesso si fanno esprimere gli
antigeni proteici in cellule ospiti facilmente manipolabili e che
assicurino alti livelli di espressione.
Tra gli ospiti ETEROLOGHI: lieviti, batteri e linee cellulari di
mammifero
Pros& Cons
Choice of an Expression System
Fast developent
Inexpensive production
High fidelity protein
folding
Protein can be directed
to accumulate in the
cell or be secreted
Posttranslational
processing
Versatile
High initial product
purity
High probablilty for
active therapeutic
Continuous production
possible
Low fidelity folding
Poor posttranslational
processing
N-terminal methionine
Proteases, endotoxins
Denatured protein
requires renaturing
Fastidious host cells
Specialized cell reactors
Slow cell growth and
product development
Expensive production
Bacterial
J
J
J
Yeast
J
J
Insect
J
Mammalian
J
J
J
J
J
J
J
J
JJ
J
J
L
LLL
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
$
$$
I VACCINI ANTICORPALI ANTI-IDIOTIPO
Si basa sul concetto di evocare anticorpi contro il sito di legame per l’antigene
dell’anticorpo protettivo
Il metodo è particolarmente interessante per epitopi non proteici come
carboidrati, difficili da isolare e da produrre in grandi quantità, oppure residui a
struttura zuccherina di lipopolisaccaridi o glicoproteine tossiche
Il principale inconveniente è che la porzione strutturale dell’anticorpo antiidiotipo non ha relazione con la struttura dell’antigene originale, per questo se
non si usano Ab umani può dare luogo a reazioni immunitarie.
I VACCINI BASATI SU PEPTIDI DI SINTESI-1
Si determinano gli epitopi
immunogeni,
si
sintetizza
chimicamente
la
piccola
sequenza lineare peptidica che
servirà da componente del
vaccino. Si applica solo agli
EPITOPI
CONTINUI
determinati unicamente dalla
sequenza
aminoacidica
primaria.
Per
gli
EPITOPI
DUISCONTINUI
si
sintetizzano migliaia di peptidi
a caso, poi si selezionano quelli
che si legano in modo ottimale
agli anticorpi protettivi
I VACCINI BASATI SU PEPTIDI DI SINTESI-2
VANTAGGI: - Si preparano in quantità illimitate
- Si purificano facilmente
- Non contengono materiali tossici o infettivi
SVANTAGGI: - Sono scarsamente immunogeni (possono però
essere
sintetizzati come peptidi antigenici
multipli o accoppiati ad una proteina vettrice)
-
Possono adottare varie conformazioni che
potrebbero dare origine ad anticorpi che
riconoscono il peptide e non l’antigene nativo
I VACCINI AD ACIDO NUCLEICO-1
Il soggetto vaccinato riceve il DNA plasmidico o l’RNA messaggero
che codifica per l’antigene desiderato. La proteina viene espressa
nelle cellule ospiti ed evoca la risposta immunitaria
La via di somministrazione efficace è l’iniezione intramuscolare.
Probabilmente ciò è dovuto al basso turnover delle cellule muscolari
VACCINI AD AC.NUCLEICO:
meccanismo d’azione
I VACCINI AD ACIDO NUCLEICO-2
VANTAGGI: - attività immunogena intrinseca degli ac nucleici
- risposta immunitaria a lungo termine
- risposta sia cellulare che umorale
- possibilità di produzione su larga scala
SVANTAGGI: - sconosciuti gli effetti a lungo termine
- possibile formazione di Ab anti-ac. nucleici
- possibile integrazione nel genoma dell’ospite
ADIUVANTI
Sono materiali atti ad aumentare la risposta cellulare ed
umorale contro l’antigene.
Generalmente hanno due proprietà:
a- convertono le proteine solubili in materiale particolato che
è più facilmente inglobato in cellule presentanti l’antigene,
quali i macrofagi.
b- Contengono un costituente batterico o prodotti microbici
che aumentano la risposta immunitaria
ADIUVANTI-2
Lo sviluppo di vaccini contro
Streptococcus Group B - GBS
(Streptococcus agalactiae)
Un batterio Gram+
I limiti:
La complessità dei serotipi
(almeno 9)
Rappuoli, Nat Rev Microbiol. 2006
Genomic approach
the genome sequences of eight GBS strains belonging to different
serotypes of GBS were analysed and compared
1,811 genes (∼80% of each genome) were shared by all strains —
the ‘core’ genome — and 765 genes were not present in all strains
— the ‘variable’ genome86.
By in silico analysis, genes encoding putative surface-associated and
secreted proteins were identified from these two subgenomes:
A total of 589 proteins were identified (396 ‘core’ genes and 193
‘variable’ genes), of which 312 were successfully expressed, purified
and used to immunize mice. A
The combination of four proteins, Sip (SAG0032), present in the
core subgenome, and three other putative, surface-associated
proteins (SAG1408, SAG0645, SAG0649), from the variable
subgenome, elicited protection in infant mice and their
combination proved highly protective against a large panel of
GBS strains, including all circulating serotypes.
This study validated the usefulness of the multigenome analysis
approach in the identification
The proteomic approach
VACCINI ANTI-TUMORALI-1
Le cellule tumorali possono esprimere due tipi di antigeni:
1. TUMOR SPECIFIC ANTIGENS (TSA)
Si trovano unicamente in cellule tumorali
Sono dovuti a mutazioni puntiformi o al riarrangiamento di geni cellulari
Alcuni antigeni tumorali sono di natura virale, derivati dai virus
trasformanti:
• virus dell’epatite B: carcinoma epatocellulare
• virus Epstein-Barr: carcinoma nasofaringeo
• Papilloma virus umano: cancro alla cervice
2. TUMOR ASSOCIATED ANTIGENS (TAA)
Si trovano sia in cellule normali che neoplastiche ma la loro espressione è
generalmente alterata/aumentata in cellule tumorali
Non sono riconosciute dal sistema immunitario
VACCINI ANTI-TUMORALI-2
Step 1:
Identificare ed ingegnerizzare gli antigeni
tumorali specifici (TSA) per essere riconosciuti
dal sistema immunitario
Step 2: Isolare e coltivare cellule dendritiche in presenza
di
antigeni
tumorali,
quindi
introdurle
nuovamente nel paziente con lo scopo di
stimolare
un’intensa
risposta
immunitaria
mediata da linfociti T
Staph Leavenworth Bakali has been involved in some of the biggest vaccine
exits of all time. Through various senior operating and leadership positions
over a 20-year career in vaccines, Leavenworth Bakali has played a critical role
in some of the most successful and leading vaccine companies. Bakali was
formerly the chief operating officer of both ID Biomedical, a Vancouver,
Canada-based developer of influenza vaccines that was acquired by
GlaxoSmithKline for $1.4 billion; and PowderJect Pharmaceuticals, an
Oxford, U.K.-based vaccine developer acquired by GlaxoSmithKline for $930
million. Bakali was also previously the director of worldwide sales and
marketing at Chiron Vaccines and the director of SmithKline Beecham's
Vaccine Business Unit in France. He is currently a non-executive director at
Vienna, Austria-based Intercell AG. Bakali holds a master's in management
from London Business School.
