Lez_11-12_Genomic_23-11-10_transg

corso di Genomica 2010-2011
lezione 13-14
giovedì 25.XI.2010
• laurea magistrale Biotecnologia
Industriale
aula 6A
orario : Martedì ore 14.00 - 16.00
Giovedì ore 13.00 - 15.00
D. Frezza
approcci diversi su topo
esperimento per fare topi transgenici in ogni parte del
genoma trascritta e tradotta (esoni)
creare una collezione (library) di cellule embrionali
ricombinanti in ogni gene
Organismi Transgenici
- Alterazione del genoma tramite tecniche di manipolazione
del DNA
- Metodo diverso rispetto all’induzione di mutazioni
- Le mutazioni indotte avvengono in maniera random
- Prime prove di organismi transgenici :
inserzione di un elemento esogeno nel genoma
- Preparazione di costrutti adatti per essere attivi in
genomi di origine diversa,
Nei genomi eucariotici non esistono unità autonome
autoreplicanti come i plasmidi nei batteri. Perché?
Meiosi e mitosi vogliono strutture cromosomiche con centromero
OGM e organismi transgenici
modi di dire e luoghi comuni
confusioni mediatiche
un OGM è anche un batterio che ha subito mutagenesi o
in cui abbiamo inserito un plasmide o un vettore di
espressione
adesso i giornali chiamano OGM gli organismi vegetali
trasformati o “ricombinanti” per un gene esogeno
organismi transgenici e topi trnsg.
le tecniche per ottenere organismi transgenici variano
molto da organismo ad organismo
metodologia:
trasfezione del vettore
transiente o per integrazione - ricombinazione
uso di cellule staminali, zigoti, embrioni,
trapianti (drafts)
sono pseudo ricombinanti o pseudo transgenici
non c’è mescolamento di genomi
le piante si innestano comunemente
piante da frutto usano l’innesto da centinaia di anni o più
da quando è stato possibile usare il DNA e clonarlo è
uscita la tecnica del DNA ricombinante
il salto dai batteri (metà anni ‘60) ai mammiferi (topo,
anni ‘80) ha fatto un grande scalpore
esempio dei topi transgenici
non abbiamo tempo per poter vedere le differenti tecniche
usate nei vari organismi eucariotici
negli organismi eucariotici non si possono usare plasmidi o
regioni autonome di replicazione, solo cromosomi
si deve ottenere un evento di ricombinazione del vettore nel
genoma e rendere l’integrazione del DNA eterologo stabile
il vettore deve essere veicolato nell’organismo (trasfezione)
il vettore si deve esprimere se vogliamo un fenotipo
il vettore deve entrare nella linea germinale per avere la
linea transgenica: sarà monoclonale?
Topi transgenici per
espressione e knock-out
Inserzione random
Ricombinaz. omologa (cellule ES)
Embrioni tetraploidi
Costrutti con BAC
Mutanti condizionali
Espressione inducibile
come si fanno i topi transgenici?
metodo di iniezione diretta del vettore nella blastocisti ed
inserzione random del vettore nel genoma ostite anche in
più copie (metodo di espressione di un gene esogeno)
metodo per ricombinazione omologa con vettori con
regioni omologhe alle regioni in cui vogliamo inserire il
vettore, necessario l’uso di cellule embrionali staminali
ES (metodo per ottenere KO di geni)
Topi transgenici per inserzione
random nel genoma
Primi topi transgenici solo di espressione di
marcatori, geni eterologhi, sovrannumerari,
- iniezione diretta del DNA nella blastocisti
- inserzione in una o più copie nel genoma ospite,
- inizialmente un marcatore carrier per il colore del mantello
come controllo della ricombinazione ed espressione
Metodologia di base
- organismo transgenico
Come si ottiene: trasfezione batterica come modello
Trasfettare cellule eucariotiche animali e vegetali col DNA
Tecnica del DNA ricombinante per i vettori
Cellule vegetali hanno anche la parete di cellulosa: metodi di
trasfezione più complessi
Cellule animali hanno solo la membrana meno resistente
Tecniche di trasfezione diverse e con efficienze diverse
Necessità della tecnica adeguata per veicolare il DNA
Organismi Transgenici
La selezione tramite incroci produce organismi “innaturali” ?
come gli organismi transgenici? Innaturale = manipolato ?
- la trasmissione orizzontale di informazione genetica per via
naturale esiste: es MIRs (mamm. interspersed regions)
SINE (short interspersed nucl. Elements) Vipera-Bovini
- pericolo (soprattutto in agricoltura) per il passaggio di geni
esogeni in altre specie che ne sono privi (batteri simbionti).
- i geni che si usano possono creare rischio?
- uso del criterio di cautela
Le stesse preoccupazioni sono state poste quando iniziarono i
clonaggi nei plasmidi e poi con vettori di espressione usando
batteri e reistenze ad antibiotici.
Sono nati i laboratori a contenimento negativo da cui non
possono uscire batteri ricombinanti.
Organismi trangenici II
Dopo i procarioti è stato possibile fare organismi transgenici con
organismi eucariotici.
- fattore limitante la tecnica adatta.
- manipolazione del DNA è sempre la stessa,
- cambia la veicolazione e stabilità nei genomi.
- non ci sono plasmidi nelle cellule degli organismi complessi.
L’integrazione in un genoma può creare dei problemi sia al
frammento da integrare sia al genoma ospite. C’è stata e c’è
una notevole differenza tra i modi di produrre organismi
transgenici vegetali o animali.
Per alcuni organismi vegetali si possono usare con facilità dei
trasposoni che facilitano l’integrazione nel genoma.
Per integrarsi un costrutto deve comunque ricombinare. Finchè
non erano note molte sequenze la ricombinazione era esclusa
anche perché è un evento raro (≈ 10-6)
Oragnismi transgenici III
Organismi modello transgenici: Drosofila, Coenorabditis el. ed il
Topo e tra i vegetali Arabidopsis e Nicoziana.
- sono stati usati organismi modello già usati in genetica con
sufficienti informazioni.
- per gli organismi vegetali: come veicolare il DNA attraverso le
protezioni esterne come la parete di cellulosa,
- sono stati usati virus o batteri trasformanti o micro sfere di
metallli pesanti (oro) come proiettili adsorbiti col DNA.
- negli animali le cellule sono più facilmente penetrabili
- l’uso dei virus come veicolo è il metodo più efficiente, i virus
devono essere non infettivi e non ricombinare per ridare origine
al virus “wild type” infettivo.
Nel topo la tecnica iniziale è stata quella di utilizzare la
blastocisti che era già utilizzata dai biologi dello sviluppo. Il
primo successo è stato ottenuto generando un topo chimerico.
Topi chimerici e transgenici
- un organismo transgenico deve avere trasfomrate le cellule
della linea germinale oppure il nucleo dello zigote. Nel topo in
cui è problematico intervenire sugli uni e sull’altro è stato
utilizzata la blastocisti su cui già veniva fatta sperimentazione.
La topolina da accoppiare viene trattata con estrogeni per far
avvenire l’ovulazione e per avere un buon numero di
blastocisti.
La blastocisti si riconosce più facilmente da uno zigote
(annessi) e si riesce a trovare facilmente nell’utero di una
topolina accoppiata poco prima. Dopo l’accopiamento in poche
ore si forma un tappo vaginale che è il segno dell’avvenuta
fecondazione. I primi topi chimerici sono stati ottenuti
iniettando direttamente il DNA nella blastocisti che lo riassorbe
e con buona probabilità riesce a trasformare le cellule.
Dal chimerico al transgenico
Iniettando il DNA nella blastocisti qualche cellula potrà assorbire
il DNA, ma non tutte e quindi si otterrà un topo chimerico in cui
non tutti i tessuti hanno nel genoma il DNA iniettato (con un
costrutto adatto per essere funzionale ed esprimersi, cioè un
gene completo e più spesso artificiale, recante un promotore
forte costitutivo come quello di un virus). Questo tipo di vettore
se porta un gene per una resistenza ad un antibiotico non deve
essere diffuso fuori dal laboratorio.
Tra i topi chimerici ci potrebbe essere quello che ha assorbito e
ricombinato nella linea germinale e che può dare origine ad una
linea transgenica. - un incrocio con un topo della linea isogenica
per poter riconoscere eventualmente dal pelo se si è trasmesso il
gene marcatore.
Quindi se si ottiene una F1 transgenica si reincrocerà sempre
con topi isogenici a quelli utilizzati per fare il topo chimerico.
Si ottiene sempre un eterozigote! 1 allele resta wt!
Controllo del topo transgenico
Come si può essere certi che il topo sia transgenico a parte il
colore del pelo (non sempre si associa un marcatore per il
colore del pelo) ? Si deve analizzare il DNA dell’animale, nel
caso del topo si prende un frammento della coda che non
provoca troppo trauma o danno fisico e se ne analizza il DNA
tramite Southern blot o tramite PCR.
Per sapere dove si è integrato si deve clonare il frammento
corrispondente a quello del Southern con PM alterato e
sequenziarlo, - tramite PCR inversa cercare la sequenza dei
frammenti limitrofi al costrutto integrato. - il gene che si esprime
corrisponde ad un fenotipo atteso, oppure diverso dal wt.?
- Per sapere se si sono integrate più copie con il Southern si ha
risoluzione migliore e cosa si vede? Per PCR inversa cosa si
deve fare per vedere se c’è più di una copia ?
Schema in cui si mostra l’iniezione con cellule, col DNA è uguale
Iniezione con ES
cells o DNA
Come si forma la blastocisti
Stadi diversi di maturazione dalla morula
alla blastocisti
Ricombinazione omologa e cellule ES
Topi transgenici con iniezione diretta del DNA nella blastocisti
possono avere il gene esogeno in un punto qualunque del
genoma e non sempre si potrà esprimere come vorremmo,
dipende dal sito in cui si inserisce. Potrebbe essere un sito
silente oppure che provoca danno ad una funzione del topo, per
cui non è vitale. Soprattutto si riesce solo a fare esprimere un
gene e non si può interferire con una funzione genetica
endogena del topo, caso mai si interferisce col metabolismo.
Capecchi ed alcuni altri sono riusciti a coltivare cellule ES
embrionali staminali di topo e a trasformarle per cui si poteva
ottenere un topo chimerico con efficienza iniettando le cellule già
con il DNA integrato, sapendo anche dove è integrato.
La cosa più eclatante è stata la possibilità di ottenere cellule ES
trasformate con DNA ricombinato in un sito specifico per
ricombinazione omologa. Prime prove con gene HPGRT
Vettore per Ricombinazione omologa
I primi esperimenti di ricombinazione omologa furono fatti da Capecchi
con il gene per la resistenza HGPRT ipoxantina-guanina fosforibosil
Transferasi.
Il problema e’ di selezionare le cellule con un fenotipo, ma sono pochi
i geni con un fenotipo selettivo, in tale assenza si utilizza la res. per un
antibiotico.
Il costrutto per far avvenire la ricombinazione omologa deve avere una
regione omologa a quella con cui vogliamo ottenere la ricombinazione:
mut.
x
x vettore a struttura W
w.t.
Di solito si utilizza un costrutto che abbia due regioni di omologia
(spalle) rispetto alla regione che si vuole inserire.
La frequenza e’ stata studiata ed e’ ~ 1- 2 x10 -6
A analisi olistica per cercare geni
A) analisi chiamata di “trapping” a seconda se si
cercano regioni codificanti = “gene trapping”
B) se si cercano regioni regolative = “regulative
region trapping”
olistico perchè non si sa a priori cosa andiamo a trovare,
il meccanismo di ricerca dipende dal costrutto,
si deve preparare un costrutto intelligente che possa
rispondere alle possibilità che il ricercatore ha saputo
prevedere con la sua creatività e informazione
Metodo del gene trapping
Per fare topi transgenici su vasta scala
generalizzata, senza un solo target
In realtà il topo transgenico “trapped” si ottiene solo
dopo aver selezionato la cellula staminale,
-la fase cruciale è lo screening per ottenere la
collezione di cloni di cellule staminali ES
mutagenizzate nei diversi geni.
- il buon trapping mi deve trovare dei geni noti che
danno la rappresentatività della collezione di cellule
ES mutagenzzate (trasfettate col vettore)
Gene trapping tramite Victr 3 e 20
vettori per il 3’o 5’ “trapping”(presenza di LTR virali per
l’integrazione nel genoma ospite)
LTR
VICTR3
VICTR20
LTR
PGK
SA IRES geo
puro
pA
SD
PGK
LTR
puro
5’ trap
3’trap
SD LTR
3’ trap
Wild-type locus
SA IRES geo pA
AAAAAn
PGK
G
LTR
puro SD LTR
AAAAAn
G
costrutti per gene trapping
PT1  geo lacz neo (5’ trap)
ei
 geo
ee
pA
ei engrailed 2 intron; ee eng 2 exon
geo = lac z - neo fusion
pA poly adenilation signal
U3  geo
U3 LTR region enhancerless Mol mur Leuk
Sup 5 E. coli sup F tRNA
 geo
U3
 geo
RU5
Sup 5
U3
RU5 Mason-Pfizer monkey virus translational enhancer
sa
TS4
Lac Z
P-neo
RU5
vettori per analisi olistica
il genoma dei mammiferi:
basso numero di geni (trascritti e tradotti) rispetto
alla grandezza dell’intero genoma
A) ricerca di geni nel topo non ancora conosciuti a
partire da ricombinanti ES con vettore intelligente
B) ricerca di regioni regolative non ancora conosciute
a partire da ricombinanti ES con vettore con reporter
se un topo transgenico KO non da fenotipo
può essere recessivo ed è necessario fare un omozigote
se è dominante letale non si riesce a sapere cosa modifica
è stato inventato un metodo con cui ottenere
mutanti condizionali
si ottiene un topo transgenico con fenotipo normale,
il vettore è inserito per lasciare la funzione normale
al momento voluto si induce ricombinazione e si
inattiva la funzione del gene
si può arrivare alle fasi di sviluppo successive a quella che
provoca la morte e studiare il fenotipo
Il costrutto per il gene floxed
costrutto
esone x
induz. di Cre
ricombinaz.
e delez. neo
esone y
esone x
introne x
loxP - neo - loxP
neo
esone x introne x
loxP
esone z
gene tk
loxP
loxP - neo - loxP
ricombinaz.
omologa
costrutto
ricomb.
introne x
esone z
esone y
gene tk
loxP
esone y
esone z
loxP
gene tk
Il gene per la timidino kinasi del virus Herpes simplex rende le cellule
sensibili al Ganciclovir
Nel caso di ricombinazione non omologa il gene tk non verra’ eliminato e le
cellule potranno essere eliminate con la selezione dell’antibiotico
Dopo l’eliminazione della resistenza alla neomicina per l’induzione del gene
Cre le cellule ES mutanti sono pronte per essere iniettate nelle blasocisti
sito per topi con costrutti Cre
http://authors.elsevier.com.
http://www.mshri.on.ca/nagy/Cre-pub.html
Ceppi di topo che esprimono il gene Cre in tessuti diversi
Analisi del topo transgenico
Dopo l’analisi del DNA della coda per PCR
Analisi dell’espressione con anticorpi anti CRE, scarsa espressione
eccetto nell’epidermide.
Analisi della presenza dell’ RNA estratto da vari tessuti
Transgene Cre - ERT
PvuII
CMV
promoter 3
 globin intron
SV40 polyA signal
inizio trascrizione
INTRON
Cre-ERT
1
poly A
4
2
PvuII
costrutto per un gene del SNC
pJOJO
cDNA Ngi
CMV-IE
 actina
loxP-GFP-loxP
IRES
lacZ - poly A
Ngi Nerve growth inibitor da gene trapping
CMV promotore del citomegalovirus
IE enhancer  actina di pollo
GFP green fluor. protein floxed
IRES internal ribosome entry site di encefalomiocardite
Lac Z per la  galattosidasi
Prova di espressione e funzionamento su un topo transgenico
“floxed” per il gene del recettore dell’acido retinoico  RXR
dopo induzione di Cre (controllo di funzionalità di Cre)
7
E8
E9
8
RXR(targetet floxed gene)
5
Tk neo
E8
LoxP
RXR(targetet floxed gene
Excision of floxed marker
After CRE recombinase)
50
40
30
20
Prodotto di PCR 156 bp
Primers 7 e 8
7
E8
E9
8
E9
6 LoxP
Prodotto di PCR 190 bp
Primers 7 e 8
100
80
60
40
10
20
0
0
mRNA CRE Er %
RXR wt
Livello di espressione di CRE (pallini) e di excisione dopo 3 giorni e dopo 1 giorno nella coda
RNA interference (hairpin double strand RNA)
Metodi per interferire con l’espressione di un gene: “stable suppression of
gene expression by RNAi in mammalian cells” P.N.A.S. vol.99 n.3 pp 1443-8 P.J.Paddison et al.
- mutagenesi, mutazioni termo sensibili(condizionali), soppressori
- knock out per ricombinazione
- anticorpi contro la proteina (prodotti da un vettore)
- RNA antisenso trascritto da un vettore
- oligo antisenso
Questi metodi hanno il difetto di non essere sempre applicabili ai sitemi eucarioti; in
certi casi non sono regolabili. L’RNA antisenso per funzionare deve essere aggiunto in
dosi massicce, oppure deve essere trascritto dentro la cellula, ma il funzionamento della
interferenza e’ legata al sistema Dicer, cioe’ ad un pathway enzimatico che riduce
l’RNA specifico del messaggero in frammenti.
E’ stato fatto un esperimento sfruttando il metodo CRE Lox per produrre
un RNA a doppio filamento per bloccare l’enzima Dicer stesso
Soppressione stabile dell’espressione genica tramite RNA
interference in cellule di mammifero
Sistema cellulare di
difesa antivirale
dimerizzazione
PKR
fosforilazione
Blocco non
specifico della
traduzione
EIF2
(kinasi)
dsRNA
esogeno
(~ 500 bp)
attiva
Cofattore per la ribonucleasi
non - specifica (Rnasi L)
2’- 5’ oligodenilato
polimerasi
pcDNA3
P
GFP
ZEO
r
L
GFP
L
ZEO r
Gene per la resistenza alla
zeocina;
L Lox P;
GFP
Le prime 500 bp codificanti di
enhanced gr. fluor. prot. EGFP;
P
Promotore di
citomegalovirus;
vettore per interference GFP
P
GFP
ZEO
r
L
GFP
L
Ricombinasi CRE
P
GFP
ZEO
r
ZEO
si interferisce con la
GFP endogena
nella linea cellulare
e si blocca
L
GFP
L
r
dsGFP
può essere
trasfezione
transiente o
stabile
Rapporto FF:REN
esperimento di controllo
Riduzione di 10 volte dell’espressione di FF in
cellule trasfettate con i due plasmidi FF/REN
FF = firefly luciferase
REN = renilla luciferase
ds = double strand
ss = single strand
as = antisense