Biochimica clinica

La biochimica clinica degli ormoni
dell’asse Ipofisi-tiroide
e principali test:
una overview
PROF. FABRIZIO BARBETTI
Anatomia della tiroide
Thyroid Cartilage
Pyramidal Lobe
Left Lobe
Isthmus
Right Lobe
Internal Jugular Vein
Primitive Carotid Artery
Trachea
Il follicolo tiroideo
Sintesi degli ormoni tiroidei
I-
DIT/MIT
Thyroid deiodinase
DIT
MIT
Trasporto dello iodio all’interno
della cellula tiroidea (“iodide trap”)
• E’ un trasporto attivo contro un gradiente elettrico
e di concentrazione:
– Cotrasportatore Sodio/Iodio
• La concentrazione dello Iodio nella cellula
follicolare è 30 volte la sua concentrazione nel
siero
• La regolazione avviene attraverso il TSH.
Imaging Studies of the Thyroid Grand in
Hyperthyroidism and Thyrotoxicosis
Tireoglubulina (Tg)
• E’ una glicoproteina con 140 tirosine
• Si trasferisce all’interno del lume follicolare per
esocitosi.
• Le tirosine vengono iodate ed accoppiate per
formare T4 and T3 (3 residui per molecola di Tg).
• Gli ormoni tiroidei vengono “immagazzinati”
insieme alla Tg.
Tirosina
3
NH3
HO
CH2CHCOOH
5
Monoiodotirosina
I
NH3
HO
CH2CHCOOH
Diiodotirosina
I
NH3
HO
CH2CHCOOH
Tiroxina (T4)
I
I
3’
3
NH3
HO
O
5’
CH2CHCOOH
5
Accoppiamento di 2 DIT = T4
Triiodotironina (T3)
I
I
3’
3
NH3
HO
O
5’
CH2CHCOOH
5
“Reverse” T3 (rT3)
I
I
3’
3
NH3
HO
O
5’
CH2CHCOOH
5
Perossidasi tiroidea (TPO)
• Enzima legato alla membrana apicale.
• Catalizza l’ossidazione dello iodio
I- + H2O2  2 HO- + E – I.
• Catalizza l’organificazione/iodazione dei residui
di tirosina della Tg.
• Catalizza l’accoppiamento delle iodotirosine.
Proteine di transporto degli ormoni
tiroidei
• Globulina legante la T4 (Thyroxine-binding
globulin, TBG). La TBG lega circa l’80% della
T4. I livelli/la capacità legante della TBG
possono modificarsi (ad es. gravidanza, uso di
estrogeni=TBG , malattie gravi=TBG ).
• Transtiretina (TTR)
• Albumina
T4 totale (T4) = T4 legata alle proteine +
T4 libera (FT4 ;  0.03%)
T4
T4
TBG
T4
T4
TBG
T4
TBG
T4
T4
T4
TBG
Asse Ipotalamo-Ipofisi-Tiroide
• L’ ormone rilasciante la tireotropina
(TRH) stimola la secrezione
dell’ormone stimulante la tiroide
(TSH) dalla ipofisi.
• Il TSH stimola la sintesi di T4 e T3 e
la loro secrezione dalla tiroide.
• La FT4 e la FT3 inibiscono la
secrezione di TSH e TRH.
Metabolismo extratiroideo degli ormoni tiroidei
La T4 viene convertita a T3 nel fegato (ed altri
organi) dalla T4 monodeiosidasi.
Tests di funzionalità tiroidea
• TSH
• T3, T4 totali
• FT3, FT4
Il dosaggio del TSH
E’ test più sensibile (e quindi di “prima
linea”) per escludere:
- Ipotiroidismo primitivo (TSH)
e
- Ipertiroidismo primitivo (TSH)
Piccoli cambiamenti dell’ FT4 inducono
importanti cambiamenti reciproci
(su scala logaritmica) del TSH
Il dosaggio del TSH: obiettivi
ideali e miglioramenti ottenuti.
• Sensibilità sufficiente da
consentire di distinguere i
livelli di TSH propri dell’
ipertiroidsmo primitivo da
altre condizioni con basso
TSH e risultare utile nel
monitoraggio della terapia
soppressiva con l-tiroxina
sodica dei pazienti operati
di carcinoma della tiroide.
• RIA (1-2 U/ml)
• Dosaggi
immunometrici di
• 1a (0.1-0.2 mU/ml)
• 2a
• 3a generazione
(<0.02 mU/ml),
[ICMA] (0.5-3.8
mU/ml).
TSH
E’ una glicoproteina composta da due subunità e .
La subunità  è comune alle glicoproteina LH, FSH e
hCG, la subunità  conferisce le specifiche proprietà
biologiche.
 Esercita i suoi effetti legandosi a specifici recettori
posti sulla superficie della cellula tiroidea ed attivando
l’enzima adenilciclasi.
 Accellera il riassorbimento della tireoglobulina, stimola
la crescita delle cellule follicolari, stimola tutte le fasi
del metabolismo dello iodio.
 I principali fattori che controllano la sintesi ed il rilascio
del TSH sono il TRH ed i livelli intraipofisari di T3.

Dosaggio immunometrico
1a incubazione
TSH, catena 
+
Ab monoclonale (MAb) anti catena  TSH, ancorato in fase solida
2a incubazione
TSH, catena 
+
Mab anti catena , marcato per agire da rilevatore
Applicazioni dei dosaggi ad
alta sensibilità
•
•
•
•
Screening della popolazione normale
Valutazione della terapia soppressiva
Eliminazione del test al TRH
Identificazione dei casi di ipo- ed
ipertiroidismo subclinico
• Identificazione dei casi di inappropriata
secrezione di TSH.
Potenziali problemi nell’uso
dei dosaggi ad alta sensibilità
• Screening di pazienti in trattamento con
corticosteroidi (TSH).
• Pazienti con malattie psichiatriche
acute (variazioni brusche del TSH).
• Monitoraggio delle fasi di transizione
dall’ IPO- ed IPERtiroidismo verso
l’EUtiroidismo (latenza lunga).
Quale diagnosi ? Caso 1
• FT3= 50 pg/ml (v.r.=80-350)
• FT4= 0,44 ng/ml (v.r.=0,8-2,4)
• TSH= 0,05 U/ml (v.r.=0,5-3,8)
Quale diagnosi ? Caso 2
• FT3= 433 pg/ml (v.r.=80-350)
• FT4= 3,14 ng/ml (v.r.=0,8-2,4)
• TSH= 5,17 U/ml (v.r.=0,5-3,8)
Il dosaggio di T4 e T3
Dosaggi immuno enzimatici (EIA) cosiddetti “omogenei”.
Non richiedono lavaggi e sono automatizzabili.
Questi dosaggi sfruttano le proprietà catalitiche di un
enzima (ad es. Fosfatasi alcalina) al fine di rilevare
e quantificare la reazione immunologica.
La sensibilità della tecnica dipende dal marcatore e dal
metodo di rilevamento. Un esempio di dosaggio omogeneo
in uso per la determinazione della T4 e T3 è
l “Enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT).
Il dosaggio EMIT
Ag-Enzima + Ab
+ Ag (siero)
Ab: Ag + Ag-Enzima
Enzima attivo
Assenza di Ag
Ab: Ag-Enzima
Nessuna attività
enzimatica
Catalizza l’ossidazione di un
composto organico come -ad es.- il
luminolo da parte di un agente
ossidante (ad es. H2O2). Il prodotto
ossidato emette luce che è
proporzionale alla reazione.
T4 totale (T4) = T4 legata alle proteine +
T4 libera (FT4 ;  0.03%)
T4
T4
TBG
T4
T4
TBG
T4
TBG
T4
T4
T4
TBG
Il dosaggio di FT4 e FT3
Metodi di riferimento: assicurano la separazione fisica
della quota libera da quella legata alle proteine di trasporto:
1) Ultrafiltrazione.
2) Dialisi.
Metodi di “immuno estrazione”. Ve ne sono di 2 tipi.
1) Quelli basati sull’uso di anticorpi specifici adesi alla
fase solida e che richiedono una fase di incubazione
seguita da lavaggio e seconda incubazione (2-step).
2) Quelli che utilizzano analoghi del T4 e T3 che
mantengono la capacità di competere con questi
ormoni per il legame ad anticorpi specifici, ma la cui
modificazione chimica impedisce l’interazione con le
proteine di trasporto sieriche (1-step).
Schema di dosaggio “One-step”
Incubazione
+
Ab in fase solida
= Ormone libero
= Proteina vettrice + Tx
= Analogo marcato
Il ruolo della biochimica clinica nella
diagnostica differenziale delle comuni cause
di IPERtiroidismo
• TSH ,T3 ,T4 . Nel
Graves sono presenti
Ab stimolanti il rTSH.
Gli esami strumentali e
la clinica permettono di
dirimere tra le due
condizioni.
• Se TSH normale o ,
T3 , T4
TSHoma.
Adenoma
tossico
Malattia di
Graves
Common Cause of Thyroid Hormone Overproduction
Toxic Adenoma = Toxic Nodule
 T3
 T3
T3
T4
 T4
 T4
 T3
 T4
Intrinsic Thyroid Autonomy
Common Cause of Thyroid Hormone Overproduction
Toxic Multinodular Goiter
 T3
 T3
 T3
T3
T4
 T4
 T4
 T4
Intrinsic Thyroid Autonomy
Common Cause of Thyroid Hormone Overproduction
Diffuse Toxic Goiter = Graves’ Disease
 T3
 T3
T3
T4
 T4
 T4
 T3
 T4
Abnormal Thyroid Stimulator
Imaging Studies in Hyperthyroidism
Pathogenesis of Graves’ Disease
Viral Antigen Defective
Ts
TH
Thyroid Antigen
B
Il recettore del TSH
Il sito di legame del TSH sul suo
recettore
Dosaggio degli Ab anti-TSHR, 3a
generazione (2004)
• Fase solida
• TSHR immobilizzati
• Competizione tra siero del paziente e
mAb* anti-TSHR marcato*
Graves’ Ophthalmopathy
• Lid retraction
(Wide-eyed stare)
• Periorbital edema
• Proptosis
La biochimica clinica nella diagnostica
dell’ IPOtiroidismo congenito ed acquisito
Il dosaggio del TSH (seguito dall’ FT4) è utilizzato nello
screening dell’ipotiroidismo congenito per instaurare
una terapia tempestiva. Il dosaggio del TSH è anche il test
di scelta per diagnosticare l’ ipotiroidismo acquisito.
Il test non è utile per stabilire le CAUSE di ipotiroidismo
congenito.
1) Disgenesia tiroidea da causa ignota o da mutazioni di
PAX-8, TTF-1, TTF-2;
2) Ipotiroidismo centrale da mutazioni del recettore del TRH,
della subunità b del TSH, di Pit-1, di Prop1;
3) Sintesi difettosa degli ormoni tiroidei da mutazioni del
recettore del TSH, del co-importatore I/Na, della TPO,
della TG.
Neurologic Effects of TH
• Necessary for normal fetal and neonatal
brain development
• Critical period from gestation to 2-3 years
of age
• Congenital hypothyroidism can result in
irreversible brain damage
• Reversible impairment of intellectual
functions in adults
Il cartoncino di Guthrie
Lo screening dell’ipotiroidismo neonatale:
dimensioni del problema e risultati pratici
•
•
•
•
•
1:3000/1:4000 nati (qualsiasi paese)
SCOZIA 1979-1993
Prelievo: a 6-7 giorni di vita
Notificazione del risultato: a 11 gg. di vita
Inizio del trattamento:tra 11 e 15 gg di vita
• Su 149 casi scozzesi:
• 1.4% dei bambini in scuole speciali
• 11.5% insegnante di sostegno (18% generale).
La biochimica clinica nella diagnostica
dell’ IPOtiroidismo acquisito
Tiroidite cronica autoimmune: distruzione dei follicoli tiroidei
ed infiltrazione linfocitaria.
Stadi iniziali:
Diffusamente
ingrandita,
indurita, gommosa,
nodulare.
Stadi tardivi:
Atrofica,
fibrotica.
La biochimica clinica nella diagnostica
dell’ IPOtiroidismo acquisito:gli autoanticorpi
Anticorpi anti microsomiali/antiTPO. Di elevata specificità
(>90%) nella tiroidite cronica autoimmune, soprattutto se
in alto titolo, sono presenti anche in circa l’85% dei pazienti
con Graves.
Anticorpi antiTg. Di minor specificità, se presenti possono
interferire con il dosaggio della Tg.
La determinazione degli autoanticorpi può essere effettuata
mediante tecnica ELISA (Enzyme-linked immunosorbent
assay).
Il ruolo della biochimica clinica nel monitoraggio
dell’esito della terapia chirurgica dei tumori della tiroide
Il dosaggio della Tg è utile nel rilevare la presenza di
metastasi o di recidive dopo la ablazione chirurgica di un
carcinoma differenziato della tiroide.
Una quota rilevante (15-35%) di pazienti con tumori della
tiroide hanno anche anticorpi anti-Tg, che possono
falsare l’analisi.
Il dosaggio deve essere effettuato dopo la sospensione
della terapia soppressiva con L-tiroxina fino al
raggiungimento di un TSH elevato in grado di stimolare la
produzione di Tg.
I livelli di riferimento della Tg circolante sono tra 3 e 42
ng/ml. La maggior parte degli individui ha livelli inferiori a
10 ng/ml.
La citologia nello studio delle
lesioni tiroidee
• Lo FNA è utile nella diagnosi differenziale tra
carcinoma tiroideo e nodulo benigno
• La citologia convenzionale tuttavia, spesso NON
è in grado di distinguere tra carcinoma follicolare
ed “iperplasia follicolare”
• L’immunodiagnostica con un mAb anti-galectin-3
(espressa solo nei tumori) conferisce una
accuratezza diagnostica del 99% (Bartolazzi,
Lancet, 2001).
That’s all Folks !
e occhio alla tiroide !!
FABRIZIO BARBETTI
[email protected] o [email protected]
www.diabeteneonatale.it
Sintesi degli ormoni tiroidei
Apporto di iodio alla ghiandola tiroidea
(desiodazione ormoni tiroidei, agenti iodati,
alimenti, acqua o farmaci).
Assunzione di iodio raccomandata: 150 g/die.
• Uptake: 115 g/die (75 g per sintesi ormonale).
• Pool tiroide: 8-10 mg.
• Assorbimento gastrointestinale, distribuzione nei liquidi
extracellulari, clearance tiroidea e renale.
•