Identificare le proteine che sono in grado di interagire
con il prodotto del gene di interesse in modo specifico:
1) Co-immunoprecipitazione
2) Libreria con il “sistema doppio ibrido di lievito”
-Interaction trap system (Fields and Sternglanz 1994): le
proteine che si legano fisicamente l’una all’altra vengono
Individuate mediante la loro capacita` di attivare la
trascrizione di un gene indicatore
Il sistema a singolo ibrido. Obiettivo identificare le proteine
che si legano ad un elemento di regolazione bersaglio, che
agisce in cis, solitamente una sequenza di DNA
Sistema a triplo ibrido: terza molecola che puo`essere un
RNA o una molecola proteica
I sistemi
“a doppio Ibrido”
e a “singolo ibrido”
in lievito
Phage Display
1) Inserimento di frammenti di DNA estraneo nel gene di
una proteina fagica di rivestimento. Il gene modificato
e`espresso come proteina di fusione, che viene incorporata
nel virione e risulta visibile sulla superficie del fago.
Tra le applicazioni:
-ingegneria degli anticorpi
-ingegneria dell proteine in generale (es. selezione di
varianti desiderabili da una libreria di mutanti)
-studio delle interazioni proteina-proteina
Phage display
Manipolazione genetica degli animali
-Studio della funzione genica
-Modelli animali per le malattie
Oocita fecondato
Cellule staminali embrionali (ES, post-zigotiche
nessuna separazione fra linea somatica e linea germinale)
Preparazione di topi transgenici mediante microiniezione nei
pronuclei
Le cellule ES modificate
geneticamente
costituiscono un mezzo
per trasferire DNA
estraneo o mutazioni
specifiche nella linea
germinale del topo
Vettori di inserzione
La mutagenesi mirata mediante ricombinazione omologa può
inattivare un predeterminato gene cromosomico all’interno
di una cellula integra
“Hit and run”
La mutagenesi mirata con doppia sostituzione può essere usata
per introdurre nel DNA piccole mutazioni
TK esterno
alla regione
di omologia
HPRT+ TK-
HPRT“Tag and exchange”
Vettori di sostituzione
Il metodo knock-in consente di sostituire l’attività di un gene di un
dato cromosoma con quella di un altro gene appositamente introdotto
Il gene En-2 va a finire sotto il controllo del promotore di En-1
Sistemi di ricombinazione sito-specifica
CRE-loxP del batteriofago P1
CRE Causa di recombinazione
media la ricombinazione fra due sequenze loxP
con lo stesso orientamento, in seguito a tale evento
la sequenza collocata fra I due siti viene escissa
Struttura della sequenza di riconoscimento di loxP
loxP
loxP
Gene trapping
Principio: gene indicatore è espresso solo dopo il suo inserimento
in un gene (sia introne che in un esone) o in un promotore.
Integrandosi puo’ acquisire gli elementi che mancano per essere
espresso
Clonazione animale
Anthony J. F. GRIFFITHS et al.
GENETICA
sesta edizione
Cap 11
Isolamento e Manipolazione del gene
Metodi con cui
si puo’ introdurre
in una cellula
DNA estraneo
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Due metodi con cui un ceppo ricevente di lievito puo’ essere
trasformato
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Ingegneria genetica delle piante
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200kb
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Il T-DNA insieme a qualsiasi segmento di DNA in esso contenuto
-si e’ inserito in un cromosoma della pianta transgenica, quindi
Viene ereditato come un carattere mendeliano semplice
Ingegneria genetica degli animali
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Gene targeting
Knockout
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Produzione di
un topo knockout
Terapia genica
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