Presentazione di PowerPoint - Università degli Studi di Roma "Tor
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Identificare le proteine che sono in grado di interagire con il prodotto del gene di interesse in modo specifico: 1) Co-immunoprecipitazione 2) Libreria con il “sistema doppio ibrido di lievito” -Interaction trap system (Fields and Sternglanz 1994): le proteine che si legano fisicamente l’una all’altra vengono Individuate mediante la loro capacita` di attivare la trascrizione di un gene indicatore Il sistema a singolo ibrido. Obiettivo identificare le proteine che si legano ad un elemento di regolazione bersaglio, che agisce in cis, solitamente una sequenza di DNA Sistema a triplo ibrido: terza molecola che puo`essere un RNA o una molecola proteica I sistemi “a doppio Ibrido” e a “singolo ibrido” in lievito Phage Display 1) Inserimento di frammenti di DNA estraneo nel gene di una proteina fagica di rivestimento. Il gene modificato e`espresso come proteina di fusione, che viene incorporata nel virione e risulta visibile sulla superficie del fago. Tra le applicazioni: -ingegneria degli anticorpi -ingegneria dell proteine in generale (es. selezione di varianti desiderabili da una libreria di mutanti) -studio delle interazioni proteina-proteina Phage display Manipolazione genetica degli animali -Studio della funzione genica -Modelli animali per le malattie Oocita fecondato Cellule staminali embrionali (ES, post-zigotiche nessuna separazione fra linea somatica e linea germinale) Preparazione di topi transgenici mediante microiniezione nei pronuclei Le cellule ES modificate geneticamente costituiscono un mezzo per trasferire DNA estraneo o mutazioni specifiche nella linea germinale del topo Vettori di inserzione La mutagenesi mirata mediante ricombinazione omologa può inattivare un predeterminato gene cromosomico all’interno di una cellula integra “Hit and run” La mutagenesi mirata con doppia sostituzione può essere usata per introdurre nel DNA piccole mutazioni TK esterno alla regione di omologia HPRT+ TK- HPRT“Tag and exchange” Vettori di sostituzione Il metodo knock-in consente di sostituire l’attività di un gene di un dato cromosoma con quella di un altro gene appositamente introdotto Il gene En-2 va a finire sotto il controllo del promotore di En-1 Sistemi di ricombinazione sito-specifica CRE-loxP del batteriofago P1 CRE Causa di recombinazione media la ricombinazione fra due sequenze loxP con lo stesso orientamento, in seguito a tale evento la sequenza collocata fra I due siti viene escissa Struttura della sequenza di riconoscimento di loxP loxP loxP Gene trapping Principio: gene indicatore è espresso solo dopo il suo inserimento in un gene (sia introne che in un esone) o in un promotore. Integrandosi puo’ acquisire gli elementi che mancano per essere espresso Clonazione animale Anthony J. F. GRIFFITHS et al. GENETICA sesta edizione Cap 11 Isolamento e Manipolazione del gene Metodi con cui si puo’ introdurre in una cellula DNA estraneo QuickTime™ e un decompressore sono necessari per visualizzare quest'immagine. QuickTime™ e un decompressore sono necessari per visualizzare quest'immagine. Due metodi con cui un ceppo ricevente di lievito puo’ essere trasformato QuickTime™ e un decompressore sono necessari per visualizzare quest'immagine. Ingegneria genetica delle piante QuickTime™ e un decompressore sono necessari per visualizzare quest'immagine. QuickTime™ e un decompressore sono necessari per visualizzare quest'immagine. 200kb QuickTime™ e un decompressore sono necessari per visualizzare quest'immagine. QuickTime™ e un decompressore sono necessari per visualizzare quest'immagine. Il T-DNA insieme a qualsiasi segmento di DNA in esso contenuto -si e’ inserito in un cromosoma della pianta transgenica, quindi Viene ereditato come un carattere mendeliano semplice Ingegneria genetica degli animali QuickTime™ e un decompressore sono necessari per visualizzare quest'immagine. Gene targeting Knockout QuickTime™ e un decompressore sono necessari per visualizzare quest'immagine. QuickTime™ e un decompressore sono necessari per visualizzare quest'immagine. Produzione di un topo knockout Terapia genica QuickTime™ e un decompressore sono necessari per visualizzare quest'immagine. QuickTime™ e un decompressore sono necessari per visualizzare quest'immagine. QuickTime™ e un decompressore sono necessari per visualizzare quest'immagine.
