I ROS e il controllo ormonale della PCD
• L’accumulo dei ROS è coinvolto con la
regolazione della morte cellulare
• Il perossido d’idrogeno e l’anione superossido
giocano un ruolo chiave in questo processo
• I segnali derivanti dai ROS interagiscono
direttamente o indirettamente con diverse altre
pathway di signalling come quella indotta dal NO
e con gli ormoni da stress SA, JA ed Et
• L’interazione e il bilanciamento di queste
pathway determina la vita e la morte della cellula
PCD
• La morte cellulare associata con l’HR è regolata
geneticamente ed è una forma di PCD come evidenziato
dal comportamento di mutanti in mais, pomodoro e
Arabidopsis che stimolano spontaneamente la PCD
anche in assenza del patogeno
• Questi mutanti che mimano la morte cellulare (lesionmimic) possono essere separati in 2 classi:
– I cosiddetti initiation mutants che sviluppano lesioni spontanee di
una certa grandezza che sono all’apparenza simili alle normali
lesioni-HR stimolate dal patogeno
– I propagation mutants che invece mostrano fenomeni di
diffusione incontrollata di eventi di morte cellulare
• Tipici esempi di propagation mutants sono lsd1 e rcd1 di
Arabidopsis e in questi casi l’anione superossido (aso)
che si produce nell’apoplasto è necessario e sufficiente
per stimolare la diffusione della PCD
PCD
• L’esistenza di 2 classi di mutanti suggerisce processi
geneticamente distinti sono coinvolti nella formazione
delle lesioni
• Questo implica che un insieme di segnali tra le cellule
morenti e quelle vicine ancora sane è in grado di
determinare l’estensione delle lesioni
• Quindi è lecito chiedersi quale sia la natura dei
processi che propagano o bloccano la diffusione della
morte cellulare regolando in tal modo l’estensione
della propagazione delle lesione stesse
Il controllo ormonale della PCD
dipendente da ROS
• 3 ormoni, l'acido salicilico, l'acido jasmonico e
l'etilene, sono particolarmente importanti nella
regolazione della morte cellulare stimolata dai ROS
• Le pathway di questi ormoni non operano
indipendentemente ma sono, piuttosto, legate
insieme in una complessa rete di interazioni (come
verificato attraverso lo studio del mutante hrl1 di
Arabidopsis)
• Quindi la sensibilità di una cellula vegetale verso un
tipo di ormone è almeno in parte stabilita attraverso
il cross-talk di molteplici ormoni
Interazioni ormonali e PCD dip. da ROS
• La NADPHox RBOH viene attivata da flussi ionici e cascate PK, l'azione
dei ROS è amplificata e la morte cellulare viene indotta attraverso l'SA nel
sito d'infezione. Durante l'inizio della PCD il JA-signalling è soppresso da
SA ed Et. Da questi primi siti di lesione un burst di produzione di Et
diffonde nelle cellule vicine e induce competenza per la PCD
• In pomodoro l'Et-signalling è richiesto per l'accumulo di SA e per la
diffusione della morte cellulare durante la formazione dei sintomi dopo un
attacco di un patogeno virulento
Interazioni ormonali e PCD dip. da ROS
• Qual'è il segnale che viene acceso da SA ed Et per stimolare le cellule ad
essere competenti? L'aso è attivamente prodotto nelle lesioni e poi,
durante la diffusione della morte cellulare, in una fila di cellule avanti al
fronte di avanzamento della PCD
• Questo pattern suggerisce che l'aso sia il segnale attraverso cui l'SA e l'Et
stimolano la PCD, quindi l'Et e l'aso sono sinergici nella diffusione della
PCD e quindi nell'allargamento delle lesioni
Interazioni ormonali e PCD dip. da ROS
• Quindi l’aso passa dalle cellule morenti alle cellule adiacenti
• Ma la morte cellulare è un segnale che porta anche alla produzione di JA
che stimola il contenimento delle lesioni
• Il JA può impedire l'allargamento delle lesioni in diversi modi ad es.
attraverso la soppressione della sintesi di SA e del suo relativo signalling
• L'attenuazione della sensibilità all'Et mediata dal JA contribuisce a bloccare
la diffusione della PCD
Cross-talk ormoni-ROS-PCD
• Quindi l'estensione delle lesioni da
HR è sotto il controllo ormonale
• I ROS, l'SA e la PCD funzionano in
un loop a feedback che si
autoalimenta, mentre l'Et serve per
stimolare continuamente l'accumulo
di ROS
• Il loop indica quindi che l'accumulo
di ROS insieme al SA induce la
PCD, l'Et serve per amplificare la
sintesi di ROS (feedback positivo)
che promuove la diffusione delle
lesioni
Cross-talk ormoni-ROS-PCD
• L'incremento di JA, sia attraverso
l'attivazione della sua biosintesi da
parte dei ROS (LOX dependent JA
pathway) o attraverso l'aumento di
disponibilità del substrato (acido
linolenico) proveniente dalle cellule
morte, agisce come regolatore
negativo del ciclo di morte
cellulare legata allo stress
ossidativo e può scavalcare
l'effetto dell'Et nel promuovere la
formazione dei ROS
• Questo incremento di JA risulta
quindi nel contenimento delle
lesioni cellulari
L'interazione orzo-Blumeria
• Blumeria graminis f.sp. Hordei (Bgh) è un patogeno
biotrofico che necessita di un efficiente penetrazione
della parete cellulare, lo sviluppo di un austorio
funzionale e il mantenimento dell'integrità delle
cellule dell'ospite per stabilire una reazione
compatibile con l'orzo
• La resistenza a Bgh è espressa prevenendo la
penetrazione attraverso una risposta di cell wall
reinforcement localizzata e dall'HR.
• La prima reazione, ovvero il CWR, è osservata
durante la PTI mentre la seconda avviene attraverso
l'interazione con il fattore R – Mla
• Durante l'interazione con Bgh, i ROS si accumulano
nell'epidermide e nel mesofillo fogliare vicino ai siti
d'infezione
Pattern subcellulare dell’accumulo di ROS
• L’accumulo di H2O2 avviene in 3 fasi:
– la prima (0-3h) coincide con l’adesione del tubo germinativo primario non
infettivo (A)
– La seconda (3-14h) è quando il patogeno cerca di penetrare attraverso
l’ifa di penetrazione che si sviluppa dall’appressorio. L’accumulo si ha nel
sito di attacco, nelle papille e nelle pareti delle cellule anticlinali. Il pattern
e l’intensità di produzione di H2O2 dipende dall’esito della penetrazione
(nelle reazioni compatibili scarsa produzione, alta in quelle
incompatibili)(B)
– La terza fase risulta nella diffusione di H2O2 in tutta la cellula,
inizialmente si accumula sia nell’interfaccia mesofillo-epidermide o vicino
ai siti di penetrazione in dipendenza del tipo di R gene che media la
risposta difensiva. Questa fase è sempre legata alla seguente morte
cellulare e all’arresto della diffusione del patogeno
Pattern subcellulare dell’accumulo di ROS
• In contrasto con l’accumulo di H2O2, l’aso si accumula (fase I) nelle cellule
epidermiche attaccate solo nell’interazione compatibile, indicando che l’aso
è implicato nell’accessibilità cellulare
• Infatti l’aso non si trova in associazione con la formazione di papille come
l’H2O2
• L’aso inoltre non viene rilevato nelle cellule attaccate che sono sottoposte ad
HR. Invece le cellule adiacenti lo producono attivamente (Fase II)
• Da questi dati emerge che l’H2O2 è un segnale e forse stimola la morte
ipersensibile mentre l’aso aiuta a delimitarla e diffonderla in un dato distretto
cellulare
Schema degli eventi
Il ruolo di MLO nel bilancio redox e
nell’interazione
• La proteina MLO potrebbe svolgere un ruolo come
regolatore negativo dei meccanismi di difesa e di PCD
nell’orzo
• La sua espressione è stimolata dall’attacco patogenico e
dallo stress ossidativo suggerendo quindi che MLO agisca
come putativo modulatore dello stato redox endocellulare
• MLO e l’accumulo di aso sono legati funzionalmente.
Infatti MLO è una proteina simile ad un GPCR che
interagisce in modo calcio-dipendente con la calmodulina
ed è quindi capace di regolare il funzionamento della
NADPHox e quindi la produzione di aso
• è quindi ipotizzabile che MLO sia capace di antagonizzare
le risposte difensive impedendo o regolando la produzione
di ROS in seguito a riconoscimento del patogeno
Il ruolo di MLO nel bilancio redox e
nell’interazione
• L’accessibilità dell’orzo a varietà virulente di Bgh potrebbe
quindi essere associata con un incremento nella capacità
di scavenging
• Infatti essendo l’H2O2 fondamentale per la fase I e III di
resistenza a Bgh e per lo scatenamento dell’HR è normale
che le capacità antiossidanti vengano stimolate in varietà
suscettibili di orzo
• Quindi un patogeno di “successo” probabilmente
sopprime, in questo sistema, le difese della pianta
dipendenti dall’HP stimolando, attraverso MLO e l’aso, la
sopravvivenza delle cellule dell’ospite
• Tale comportamento è legato allo stile di vita biotrofico di
Blumeria graminis f.sp. hordei
mlo mutants exhibit perturbed cell death control,
resulting in spontaneous cell death in response to
developmental or abiotic cues.
The wild type genes appear to function as negative
regulators of programmed cell death.
Barley mlo encodes the first-identified member of a
novel class of plant proteins, predicted to be membrane
bound and functioning in a cell-autonomous fashion.
Barley MLO is a G-protein coupled receptor
Inactivation of the MLO protein leads to enhanced H2O2 accumulation at epidermal cells and to cell death
in the mesophyll
Piffanelli, P., et al. Plant Physiol. 2002;129:1076-1085
Copyright ©2002 American Society of Plant Biologists
Bgh-triggered cell death in a partially resistant mlo
mutant
Piffanelli, P., et al. Plant Physiol. 2002;129:1076-1085
Copyright ©2002 American Society of Plant Biologists
Model of assumed MLO corruption by the powdery mildew fungus in
barley
Biochemical Society Transactions
www.biochemsoctrans.org
(2005) 33, 389-392
Biochem. Soc. Trans.
Le RNS
• L‘ossido nitrico (NO) è un altro importante
fattore che è richiesto per l'induzione della
PCD mediata da ROS.
• In soia il rapporto tra NO e l'H2O2 determina il
momento di attivazione della PCD
• Un eccesso di aso o di può servire a ridurre
l'NO e prevenire cosi l'accumulo di NO e di
H2O2 richiesti per l'attivazione della morte
cellulare
NO signaling nelle risposte di
difesa
• Negli animali l'NO funziona come molecola segnale in diversi
processi fisiologici tra cui il rilascio di neurotrasmettitori
• Inoltre in particolari condizioni patologiche l'NO è in grado di
uccidere i microrganismi e le cellule tumorali attraverso i macrofagi
• La sintesi di NO è catalizzata dall'emoproteina NO sintasi
calmodulina dipendente che ossida la L-arginina a NO e L-citrullina
• Una volta prodotto l'NO agisce attraverso delle modificazioni posttraduzionali e bersaglia in modo specifico i residui di cisteina (Snitrosilazione), di tirosina (nitrificazione) e il ferro e rame eme e non
eme (nitrosilazione dei metalli) di un largo spettro di proteine
• L'interazione del NO con le proteine che contengono un gruppo eme
è esemplificata dalla sua interazione con la guanilato ciclasi, infatti
legandosi al suo gruppo prostetico, attiva l'enzima che produce
cGMP
NO signaling nelle risposte di
difesa
• Nelle piante gli enzimi responsabili della sintesi di NO sono la nitrato
reduttasi (NR) e la AtNOS1 di At
• AtNOS1 appartiene al gruppo di enzimi dipendenti da calmodulina
che catalizzano la formazione di NO ma ha scarsa omologia con
quella animale, i mutanti Atnos1 mostrano una crescita ed una fertilità
ridotta cosi come un'alterazione della capacità di chiusura degli stomi
• La localizzazione cellulare di AtNOS1 è nei mitocondri, suggerendo
che l'enzima fornisca protezione contro i ROS prodotti nella fase
oscura della fotosintesi limitando cosi l'ossidazione dei lipidi e delle
proteine
• NO è prodotto inoltre nelle piante che vengono attaccate da patogeni
e in seguito a elicitazione. Ad esempio l'elicitazione con criptogeina
(una proteina di 10KDa prodotta da P. cryptogea) risulta in un rapido
e transiente incremento della sua produzione
NO signaling nelle risposte di
difesa
•
La produzione di NO in seguito a elicitazione si localizza inizialmente nei plastidi
e poi anche nel nucleo, nella membrana plasmatica e nel citoplasma. Questo
suggerisce che la sintesi di NO potrebbe essere plastidiale e poi diffondere
oppure avere più siti di produzione nella cellula
•
NO è capace di modulare l'espressione di diversi geni di difesa che includono
geni che codificano per PR proteins e di proteine correlate al metabolismo
secondario
•
A livello post-traduzionale l'NO promuove la S-nitrosilazione dei proteine
coinvolte nel bilancio redox come la glutatione S transferasi e la S-adenosilmetionina sintetasi, inoltre sia il cGMP che il cADP possono mediare gli effetti
mediato dal NO durante la difesa. Infatti ambedue i composti sono necessari per
l'induzione dei geni della PAL e PR-1
•
Dato che questi secondi messaggeri attivano i canali per il calcio sia negli
animali che nelle piante, è ipotizzabile che l'NO sia uno dei messaggeri chiave
che governa la mobilizzazione del calcio durante la difesa
•
Infatti NO partecipa all'incremento di calcio promuovendo il suo rilascio dai
compartimenti intracellulari attraverso l'attivazione di canali specifici (RYR)
NO signaling nelle risposte di
difesa
• Nei mammiferi l'NO è un potente induttore di apoptosi e il
meccanismo principale di stimolazione avviene attraverso la
sua reazione con l'aso per generare il perossinitrito (ONOO-) un
composto fortemente citotossico che causa una nitrosilazione
incontrollata dei residui di tirosina in diverse proteine
• Nelle piante l'HR dipendente da NO non è mediata dall'ONOOma risulta piuttosto dall'azione combinata del NO con l'H2O2
quando questa è formata per dismutazione dall'aso. Inoltre
questi due composti sono in grado di regolare reciprocamente
la propria sintesi
• Ad esempio H2O2 esogena stimola la produzione di NO
attraverso un processo dipendente dai flussi di calcio, mentre
l'NO è richiesto per l'attivazione di RBOH
• Necrotrophic fungi are unable to occupy living
plant cells
• How such pathogens survive first contact with
living host tissue and initiate infection is therefore
unclear.
• the necrotrophic grey mold fungus Botrytis cinerea
undergoes massive apoptotic-like programmed
cell death (PCD) following germination on the host
plant
• Manipulation of an antiapoptotic gene BcBIR1
modified fungal response to PCD-inducing
conditions.
• strains with reduced
sensitivity to PCD were hyper
virulent, while strains in
which PCD was overstimulated showed reduced
pathogenicity.
• Similarly, reduced levels of
PCD in the fungus were
recorded following infection
of Arabidopsis mutants that
show enhanced susceptibility
to B. cinerea
• Botrytis PCD machinery is
targeted by plant defense
molecules, and that the
fungal anti-apoptotic
machinery is essential for
overcoming this host-induced
PCD and hence, for
establishment of infection
