• Non esiste una singola strategia/procedura che funzioni
adeguatamente per tutti i casi
• Ciascuna proteina è un prodotto in sé unico
Quando un gene clonato utilizza codoni ai quali la cellula ospite ricorre
raramente, si verifica un’incompatibilità cellulare che può interferire
con una traduzione efficiente
Può accadere che la cellula ospite non produca a sufficienza i tRNA
che riconoscono i suddetti codoni di impiego raro e la resa in proteina
del gene clonato risulta conseguentemente inferiore alle aspettative
La presenza di insufficienti quantità di tRNA può determinare infatti
un rallentamento della traduzione, un arresto precoce della traduzione
o l’incorporazione di un aminoacido errato con conseguente sintesi di
forme varianti della molecola proteica di interesse
Di solito la presenza di un piccolo numero di codoni rari non
determina un abbassamento significativo dei livelli di espressione
Gli effetti sui livelli di espressione possono essere severi se nel gene
clonato i codoni rari sono numerosi o presenti in clusters
Gli effetti più severi sull’espressione sono stati osservati in presenza
di più codoni rari consecutivi localizzati all’estremità N-terminale della
sequenza codificante
Codoni rari in E.coli
Geni di E.coli con elevati livelli di
espressione (195 geni)
4290 geni di E. coli analizzati
Problemi di traduzione simili a quelli determinati dal codon usage
possono essere provocati da alti livelli di espressione di proteine
caratterizzate da un aminoacido abbondante.
In questo caso il livello di espressione può essere migliorato
fornendo l’aminoacido limitante nel mezzo di coltura.
1. SODDISFARE LA RICHIESTA
E’ stato dimostrato che il livello di espressione di una proteina il cui
gene contiene codoni rari può essere aumentato in maniera
significativa rifornendo la cellula ospite dei corrispondenti tRNA
Si possono inserire i geni codificanti i tRNA in questione in un
plasmide, che può essere lo stesso vettore di espressione o un
plasmide compatibile
E’ stato creato un vettore, pRARE, contenente i geni codificanti i
tRNA per i codoni rari di Arg, Ile, Gly, Leu e Pro
Codoni rari in E.coli
Geni di E.coli con elevati livelli di
espressione (195 geni)
4290 geni di E.coli analizzati
tRNAs rari o assenti
argU riconosce
le triplette
AGG/AGA
CCC
CUA
GGA
AUA
Tali plasmidi sono stati adoperati per trasformare diversi ceppi di E.coli
E’ stata così creata la serie RosettaTM di ospiti batterici per l’espressione
Tali plasmidi sono compatibili con i vettori pET e con altri vettori di
espressione batterici
I ceppi Rosetta hanno consentito di ottenere elevati livelli di espressione
di proteine i cui geni contenevano codoni rari di E.coli
2. OTTIMIZZAZIONE DEI CODONI
Produzione di una versione del gene contenente i codoni utilizzati
più comunemente dalla cellula ospite
• SINTESI CHIMICA
• MUTAGENESI
Ceppo di E.coli BL21(DE3)pLysS
• Presenta mutazioni della proteasi lon ed è privo della proteasi della membrana
esterna ompT, ciò che riduce gli eventi proteolitici a carico delle proteine
ricombinanti
• E’ un ospite lisogeno di λDE3 e dunque presenta nel cromosoma una copia del gene
codificante la RNA polimerasi T7, sotto il controllo del promotore lacUV5
• L’espressione proteica è sotto il controllo del promotore T7
• Presenta un plasmide contenente una copia del gene che codifica il lisozima T7,
espresso a bassi livelli
• Il lisozima T7 lega l’RNA polimerasi T7 inibendo la trascrizione guidata da questo
enzima
• In seguito ad induzione con IPTG, la produzione ad elevati livelli dell’RNA polimerasi
T7 sopprime ogni inibizione da parte del lisozima T7
Analisi dell’espressione di un mutante di delezione
dell’attivatore tessutale del plasminogeno umano
BL21
(DE3)
• Il costrutto codifica una proteina di 358 aminoacidi del
peso molecolare di 40 kDa e contiene 9 CCC, 8 AGA/AGG,
6 GGA, 6 CGG/CGA, 2 AUA, 1 CUA per un totale di 32
codoni rari (8,9%)
• E’ riportata un’analisi mediante SDS-PAGE di estratti
cellulari totali
Rosetta
(DE3)
BL21
(DE3)
pLysS
Rosetta
(DE3)
pLysS
M I U I U M I U I U
La ribonucleasi E (RNasi E) è un componente chiave del complesso di
degradazione dell’RNA
E’ stato osservato che in presenza di mutazioni che inattivano la RNasi
E della cellula batterica ospite, il livello di espressione di una proteina
ricombinante aumenta da 2 a 10 volte
E’ stato creato un ceppo di E.coli, denominato BL21 StarTM,
caratterizzato da una mutazione del gene codificante la RNasi E
Analisi dell’espressione dell’enzima β-galattosidasi
BL21 Star(DE3)
BL21(DE3)
U
I
U
I
Il tempo di dimezzamento di diverse proteine varia da qualche minuto a
qualche ora
L’origine di questa stabilità differenziale risiede sia nella misura in cui si
formano i ponti disolfurici sia nella presenza di certi aminoacidi
all’estremità N-terminale
E’ stato osservato che, aggiungendo certi aminoacidi all’estremità
N-terminale della β-galattosidasi, la sopravvivenza in vitro della proteina
modificata passa da circa 2 minuti a oltre 20 ore
Spesso è sufficiente la presenza di un unico aminoacido in più
all’estremità N-terminale per stabilizzare la proteina bersaglio
Le proteine con una emivita maggiore possono accumularsi nella cellula
aumentando, di conseguenza, la resa in prodotto
Analisi della stabilità della β-galattosidasi
Aminoacido
Tempo di dimezzamento
Met, Ser, Ala, Thr, Val, Gly
Ile, Glu
Tyr, Gln
Pro
Phe, Leu, Asp, Lys
Arg
20 h
30’
20’
10’
3’
1’
Al contrario degli aminoacidi all’N-terminale della proteina, certe sequenze
intermedie rendono la proteina maggiormente suscettibile alla
degradazione proteolitica
Queste regioni della proteina, dette sequenze PEST, sono ricche di prolina
(P), acido glutammico (E), serina (S) e treonina (T)
Tali sequenze sono spesso fiancheggiate da gruppi di aminoacidi a carica
positiva, i quali possono agire marcando le proteine ai fini della
degradazione all’interno della cellula
Alterando le regioni PEST è possibile migliorare la stabilità di una proteina
Non è semplice, dal momento che E.coli possiede almeno 25 proteasi e solo
alcune di esse sono state caratterizzate
Si tratta di enzimi coinvolti nella degradazione di proteine difettose o
anomale e dunque necessari ad assicurare la continua vitalità delle cellule
E’ stato osservato che i ceppi maggiormente carenti crescevano più
lentamente → la diminuzione dell’attività proteasica debilita le cellule
Nel caso di ceppi di E.coli portatori di mutazioni sia a carico del gene per il
fattore sigma della RNA polimerasi responsabile della sintesi della proteina
dello shock termico (rpoH) sia a carico del gene per una proteasi necessaria
alla crescita cellulare a temperature elevate (degP), le proteine secrete
possedevano un’attività specifica 36 volte maggiore di quella delle
proteine prodotte da cellule ospiti di tipo naturale
Questo aumento apparente di attività riflette la diminuzione della degradazione
proteolitica delle proteine secrete
Il ceppo BL21(DE3) presenta una mutazione del gene codificante la proteasi
Lon
Si tratta di una proteasi ATP-dipendente coinvolta nella degradazione di
proteine estranee o non correttamente ripiegate
Il ceppo RF6333 presenta mutazioni dei geni degP e ompT, le quali
determinano l’inattivazione di una proteasi periplasmatica (degP) e di una
proteasi della membrana esterna (ompT)
L’aumento dei livelli di proteine ricombinanti nei ceppi carenti di proteasi è
da ascrivere sia ad una ridotta degradazione allinterno della cellula sia ad
una ridotta proteolisi in seguito alla lisi cellulare
Sono disponibili diverse strategie per esprimere proteine ricombinanti solubili
ed attive
La solubilità di una determinata proteina è determinata da una varietà di fattori,
inclusa la sua specifica sequenza aminoacidica
L’ospite batterico, il tipo di vettore di espressione e le condizioni di crescita
possono determinare un incremento o una riduzione della quantità di
proteina ricombinante in forma solubile o insolubile
STRATEGIE PER FAVORIRE IL FOLDING E/O INCREMENTARE LA SOLUBILITA’ DELLA PROTEINA
RICOMBINANTE DI INTERESSE:
Fusione del prodotto proteico ricombinante ad un polipeptide altamente
solubile
Fusione ad un enzima che catalizza la formazione di ponti disolfurici
Traslocazione della proteina ricombinante nello spazio periplasmico
La crescita degli ospiti batterici a 37ºC determina l’accumulo di alcune
proteine ricombinanti nei corpi di inclusione
L’incubazione a 30ºC favorisce la produzione di proteine ricombinanti
solubili ed attive
La crescita e l’induzione a 25ºC o 30ºC possono risultare ottimali se si
desidera la secrezione della proteina ricombinante nello spazio
periplasmico, sfruttando la presenza del peptide segnale
In alcuni casi un’induzione prolungata (overnight) a basse
temperature (15ºC-20ºC) ha consentito di ottenere maggiori rese di
proteine ricombinanti solubili
• Ridurre il sovraccarico metabolico
• Eludere il problema del mantenimento del plasmide (tramite antibiotici
o altri metaboliti costosi) in scala industriale
In generale le condizioni sperimentali che determinano una riduzione
dei livelli di espressione, quali induzione a basse temperature o
crescita in un terreno minimo, determinano un incremento della
percentuale di proteina bersaglio in forma solubile
Per numerose applicazioni è necessario esprimere la proteina
bersaglio nella sua forma solubile e biologicamente attiva
Una proteina solubile non è necessariamente rinaturata in maniera
corretta → alcune proteine formano specie solubili inattive
Il tipo di vettore, il ceppo ospite, la sequenza della proteina
ricombinante e le condizioni di crescita sono tutti fattori che
contribuiscono ad incrementare o ridurre la proporzione di proteina
in forma solubile o insolubile
Sito di taglio
per proteasi
specifica
leader
Rinaturazione in
ambiente
ossidante
proteina
Traslocazione
attraverso la
membrana interna
N
leader
20-30 aa
C
proteina
Una strategia per ottenere proteine solubili ed attive consiste nell’utilizzo di
vettori che consentono il trasporto della proteina ricombinante nel
periplasma, un ambiente idoneo al folding ed alla formazione di ponti
disolfurici
A tale scopo sono adoperati vettori di espressione contenenti una
sequenza codificante un peptide segnale
Nel corso del clonaggio è importante fare in modo che la sequenza
codificante la proteina ricombinante di interesse sia in frame con la
sequenza codificante il peptide segnale
Alcune proteine non sono risultate buoni candidati per la localizzazione
periplasmatica
La carica netta degli aminoacidi N-terminali della proteina matura può inibire
la traslocazione
pET-22b(+)
peptide segnale
sito NcoI
Elevati livelli di espressione possono inibire la secrezione sovraccaricando il
macchinario secretorio della cellula
Strategie
• Variare le condizioni sperimentali in modo da ridurre i livelli di
espressione
• Rifornire la cellula di alcuni dei componenti limitanti del
percorso secretorio
Sono disponibili ceppi di E.coli trasformati con plasmidi contenenti i geni prlA4 e secE.
Tali geni codificano i principali componenti del sistema di trasporto attraverso la
membrana.
Adoperando tali ceppi si è osservato un effettivo incremento della secrezione di
proteine ricombinanti.
Basse rese
Può accadere che il peptide segnale non sia rimosso o che il taglio
avvenga in un sito inappropriato
Talvolta può risultare utile l’inserimento di uno spaziatore
aminoacidico tra il sito di taglio del peptide segnale e la proteina
ricombinante o l’utilizzo di ceppi di E.coli che esprimono ad
elevati livelli uno o più geni codificanti peptidasi specifiche per il
peptide segnale
Le proteine secrete nello spazio periplasmico di E.coli possono essere
isolate mediante shock osmotico
Il trattamento dei batteri con soluzioni ipertoniche contenenti EDTA
determina una variazione della permeabilità della membrana/parete
cellulare
La successiva incubazione con una soluzione ipotonica (ad es.
MgCl2 0.1 mM) determina la permeabilizzazione della parete cellulare
ed il rilascio dei componenti dello spazio periplasmico
Le cellule batteriche raccolte in fase esponenziale di crescita sono più
suscettibili allo shock osmotico rispetto alle cellule in fase stazionaria
Circa il 4% delle proteine totali di E.coli è secreta nello spazio
periplasmico
Le proteine secrete includono un certo numero di enzimi degradativi
L’utilizzo di ceppi di E.coli carenti di proteasi e l’aggiunta di inibitori
delle proteasi possono determinare un incremento della resa
• Alcune proteine restano legate alla membrana e non possono essere
isolate mediante shock osmotico
• In tali casi può risultare utile il trattamento con detergenti
• Elevati livelli di espressione di proteine ricombinanti in E.coli spesso
determinano la formazione di granuli citoplasmatici, i corpi di
inclusione, composti da aggregati insolubili della proteina espressa
• Ai fini della preparazione dei corpi di inclusione, le cellule, raccolte
mediante centrifugazione, sono lisate con metodi meccanici, quali
sonicazione o lisozima e detergenti
• I corpi di inclusione, raccolti mediante centrifugazione, sono lavati
(Triton X-100 + EDTA o urea) allo scopo di separare il più possibile
proteine solubili dalle proteine ricombinanti aggregate
• Nella maggior parte dei casi sono isolati corpi di inclusione
contenenti più del 90% di proteina ricombinante pura
I corpi di inclusione lavati sono solubilizzati e la proteina ricombinante è
sottoposta ad una procedura di rinaturazione
Varie condizioni possono essere adoperate per solubilizzare i corpi di
inclusione → guanidina-HCl, urea, pH basico, SDS, acetonitrile/propanolo
Indipendentemente dalle procedure è importante lisare le cellule in
maniera efficiente per ottenere i corpi di inclusione in grandi quantità
Le procedure di rinaturazione variano a seconda della proteina e devono
essere determinate in maniera empirica
In generale la rinaturazione è realizzata mediante rimozione graduale
dell’agente denaturante
1
Denaturazione riduttiva
e rinaturazione
ossidativa della RNasi A
Riduzione con b-mercaptoetanolo
(condizioni denaturanti)
Ossidazione
O2 a pH 8
(condizioni
rinaturanti)
Molecola
denaturata
ridotta
Allontanamento dei
denaturanti per
DIALISI
GSH 5 mM
GSSG 1 mM
5:1
pH 8.4
VANTAGGI
Crescita rapida
Elevata densità cellulare su substrati poco costosi
Organismo ben caratterizzato, con una ricca collezione di mutanti
Numero elevato di vettori di clonaggio e di espressione
SVANTAGGI
Formazione di corpi di inclusione
Rinaturazione ossidativa limitata allo spazio periplasmico
Modifiche post-traduzionali non adeguate (ad es. glicosilazione)
Bacillus subtilis è un batterio gram-positivo adoperato
per la produzione di proteine ricombinanti
• Si tratta di vettori che consentono il
clonaggio e l’espressione di due
diversi geni bersaglio
• Contengono due unità di espressione,
ciascuna regolata da un promotore
T7lac distinto
• L’utilizzo di diversi terreni di
coltura spesso determina
differenze notevoli nei livelli
di espressione
• Per definire i parametri
generali dell’espressione è
di solito adoperato il terreno
LB
• Si può poi procedere ad
effettuare delle prove
utilizzando altri terreni
Le colture batteriche tendono a perdere la resistenza all’antibiotico
ampicillina, dal momento che gli elevati livelli di enzima β-lattamasi
secreto e la riduzione del pH del mezzo di coltura associata alla
fermentazione determinano la degradazione dell’antibiotico
Si può sostituire il mezzo di coltura con un mezzo di coltura fresco
contenente ampicillina o si può utilizzare l’antibiotico correlato
carbenicillina, il quale è meno sensibile a bassi valori di pH
Nella maggior parte dei vettori pET il gene codificante la
β-lattamasi è localizzato a valle del promotore T7, nello stesso
orientamento → l’enzima si accumula nelle colture di cellule
batteriche indotte
L’orientamento del gene codificante la β-lattamasi è stato invertito
nei vettori pET- 43 e pET-44 → la trascrizione guidata dall’RNA
polimerasi T7 non determina l’aumento dei livelli dell’enzima
β-lattamasi
L’ossigeno si discioglie solo in misura limitata nei mezzi acquosi
Con l’aumento della densità cellulare si verifica una riduzione
della percentuale di ossigeno disciolto nel mezzo di coltura
Immettere nel mezzo di coltura grandi quantità di ossigeno o
applicare un’agitazione vigorosa non sempre risolve il
problema → l’ossigeno si discioglie molto lentamente
CONSEGUENZE
In condizioni di scarsità di ossigeno, la crescita esponenziale
rallenta e la coltura entra presto in fase stazionaria
Una conseguenza è la produzione, da parte delle cellule ospiti, di
proteasi
RIMEDI
Ottimizzare l’areazione e l’agitazione
Aggiungere al mezzo sostanze chimiche che aumentino la
solubilità dell’ossigeno
L’aggiunta di IPTG ad una concentrazione di 0,4 mM è raccomandata nel
caso dei sistemi pET
Per i promotori lac o T7lac è consigliata una concentrazione di IPTG pari
ad 1 mM
La concentrazione ottimale di IPTG è determinata in maniera empirica →
variare la concentrazione di IPTG tra 0.01 e 5 mM
In alcuni casi è importante indurre la trascrizione lentamente (basse
concentrazioni di IPTG) per non caricare eccessivamente il macchinario
biosintetico del batterio
Un parametro di fondamentale importanza è la temperatura alla quale
sono fatti crescere i batteri prima e durante l’induzione
Nei recipienti di coltura piccoli (da 1 a 5 litri), l’induzione si realizza
facilmente variando la temperatura o aggiungendo un induttore
chimico
Nei bioreattori di dimensione industriale la variazione di
temperatura richiede tempo (da 30 a 60 minuti) ed energia
In maniera simile l’aggiunta di un induttore chimico (IPTG) può
rendere il processo molto costoso, inoltre l’aggiunta alle vasche di
coltura/fermentatori riciede tempo e crea disomogeneità
Si può adoperare un sistema a due plasmidi → il repressore cI è
posto sotto il controllo del promotore trp in un plasmide a basso
numero di copie mentre il gene di interesse è posto sotto il
controllo del promotore pL
In assenza di triptofano il promotore trp si attiva ed è sintetizzata
la proteina repressore che inattiva il promotore pL
In presenza di triptofano è disattivato il promotore trp con l’arresto
della sintesi della proteina repressore cI → il promotore pL
acquista piena attività
Le cellule possono essere coltivate in un terreno non costoso contenente
piccolissime quantità di triptofano libero.
L’induzione è poi realizzata aggiungendo al mezzo il triptone che contiene
abbastanza triptofano libero da indurre la trascrizione in maniera
efficiente.
