lezione fibrosi cistica

Fibrosi cistica
•
La Fibrosi cistica, detta anche mucoviscidosi e’
un malattia genetica autosomica recessiva.
E’ una malattia poco conosciuta anche se si tratta
della più comune fra le malattie genetiche mortali
nelle popolazioni di origine caucasica.
•
Frequenza:1:200-1:6000 nati
•
PREVALENZA
In Italia la prevalenza è compresa tra

1/2500 e 1/3000 tra i nuovi nati

Prevalenza portatori di 1/26 e 1/30
Fibrosi cistica
•
Nella sua forma più grave, la FC
colpisce diversi organi, tra cui
pancreas, polmoni, fegato,
intestino
PATOFISIOLOGIA (I)
•
Funzionamento anomalo della proteina CFTR (cystic
fibrosis transmembrane conductance) che normalmente
presiede ad alcune funzioni di trasporto di sali e di
difesa contro le infezioni.
•
Questo difetto comporta che le secrezioni degli organi
siano dense e poco scorrevoli ristagnando ed
occludendo dotti e canali, con danno progressivo
degli organi interessati.
PATOFISIOLOGIA (II)
•
Il pancreas si atrofizza e non libera i suoi enzimi
digestivi (ad es. la tripsina), l’intestino si occlude,il
fegato trattiene la bile, i bronchi si ostruiscono e si
infettano
•
Progressivamente compare il danno polmonare con
infezioni ripetute fino all’infezione cronica che
determina un’insufficienza respiratoria che è la causa
principale di morte
PATOFISIOLOGIA (III)
•
Un tempo era considerata una malattia mortale
dell’infanzia.
•
Oggi il 50% dei pazienti supera I 37-40 anni.
Questo dato dipende da diversi fattori come la
diagnosi precoce, il miglioramento delle cure,la
diagnosi sempre più frequente di forme lievi.
•
•
Il trapianto di polmone , diventato più frequente solo
negli ultimi 10 anni, rappresenta un fattore decisivo
per il prolungamento dell’aspettativa di vita nelle
forme classiche gravi.
• Rispetto ai casi descritti nel XVI secolo, la sopravvivenza
mediana in CF è aumentata costantemente, da meno di 2
anni, nel 1938, a circa 30 anni nel 1989, quando il difetto
genetico è stato scoperto, ad una mediana dell’ età di
sopravvivenza del 41,7 anni nel 2015.
• Miglioramento della sopravvivenza in gran parte è stato
determinato grazie alla comparsa di centri di cura
specializzati, diagnosi precoce della malattia, allo screening
tempestivo per le comorbidità associate ed alla
realizzazione di terapie per ottimizzare la funzione
polmonare e nutrizionale ed alla creazione di linee guida
per la standardizzazione del trattamento in base ai sintomi
Screening neonatale per FC: razionale
1982 per la prima volta in Toscana
Identificazione precoce della malattia
Programma di cura prima che si manifestino i sintomi clinici:
il decorso clinico della malattia è migliore nei pazienti diagnosticati
precocemente
Possibilità di fornire alla coppia di un bambino affetto un’adeguata
consulenza genetica
Screening neonatale per FC: metodo
•Determinazione quantitativa della tripsina immunoreattiva (IRT) su
una goccia di sangue prelevata in terza giornata
•Tale enzima è elevato nelle prime settimane di vita del bambino e
poi diminuisce
•Nei casi sospetti il valore di IRT resta elevato a causa del reflusso di
tripsina verso il torrente ematico per ostruzione dei dotti pancreatici
•Valori elevati di IRT si possono trovare anche in soggetti non affetti
da fibrosi cistica.
•Per ridurre i casi di falsi positivi lo screening affianca il
dosaggio della lattasi nel meconio
Retesting
•I soggetti con valori elevati di IRT e lattasi sono sottoposti ad un
nuovo test ad un mese di vita, tempo in cui i valori di tali enzimi si
normalizzano
Elisa
(Enzyme-linked immunoadsorbent assay)
ELISA è un acronimo che deriva dall'espressione in inglese
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Saggio ImmunoAssorbente legato ad un Enzima).
Si tratta di un versatile metodo d'analisi immunologica usato in
biochimica per rilevare la presenza di una sostanza usando
uno o più anticorpi ad uno dei quali è legato un enzima.
VANTAGGI E SVANTAGGI DELLO SCREENING NEOANATALE SULLA FC
•L’introduzione di questa tecnica ha consentito di effettuare una
diagnosi precoce
•Ampio numero di falsi positivi
•I soggetti con valori elevati di IRT e lattasi sono sottoposti al test del
sudore che può essere effettuato non prima di 40-45 giorni di vita del
bambino
Test del sudore
•
•
•
Misura la concentrazione del cloro e del sodio
escreti nel sudore
La diagnosi di FC viene effettata su due
risultati positivi ottenuti in due giorni.
Caratteristiche cliniche, storia familiare, età
del paziente.
TEST DEL SUDORE
•Sudorazione indotta da iontoforesi pilocarpinica: si stimola
farmacologicamente la parte scelta.
•Misura della quantità di sudore e la concentrazione di cloro
in essa presente
•Valutazione analitica
Valori di riferimento
>60 mEq/L
40-60 mEq/L
<40 mEq/L
test positivo
borderline
test negativo
TEST DEL SUDORE
•Il test del sudore permette di stabilire la diagnosi nella
maggioranza dei casi.
•In alcuni casi il suo significato resta comunque dubbio e l’esame
deve essere ripetuto più volte.
Fibrosi Cistica:trasmissione
•
Ha una trasmissione
autosomica recessiva
•
I portatori hanno il 25% di
rischio di avere figli affetti
•
Maschi e femmine sono
ugualmente affetti
•
È dovuta all’alterazione di un
canale del cloro, denominato
CFTR (Cystic Fibrosis
Conductance transmembrane
regulator)
Aa
AA
aA
Aa
aA
aa
La proteina CFTR
•
Canale per il Cl- delle
membrane apicali delle
cellule epiteliali
•
Appartiene alla famiglia dei
trasportatori glicoproteici di
membrana che possiedono
siti intracellulari di legame
per l’ATP (ABC-family)
DOVE STA CFTR?

Nelle cellule epiteliali
del polmone, del tratto
digerente, ghiandole
del sudore, sistema
genitourinario
CFTR – IL CANALE DEL CLORO
•
•
•
2 metà omologhe
Ogni metà ha 6 domini
transmembrana
1 sito di legame per
nucleotidi (NBD) collegati
da un dominio regolatorio
citoplasmatico (R-domain)
che contiene i siti di
fosforilazione
CFTR: FUNZIONE

Trasporto epiteliale del ClL’efficienza del transporto
epiteliale di Cl- è
determinata dall’attivazione
di CFTR che dipende dal
suo stato di fosforilazione
Dalla mutazione alla malattia
La forma mutata del CFTR
impedisce l’uscita del cloro,
rendendo viscose le secrezioni
Le secrezioni ostruiscono I
dotti e alterano la funzionalità
di pancreas ed intestino
CF: Genetica
•
•
•
•
Gene CFTR localizzato sul cromosoma 7 (7q31-q32)
27 esoni
Oltre 2000 mutazioni: elevata variabilità allelica
Alcune diffuse in tutto il mondo, altre sono specifiche di alcuni
ambiti etnico-geografici
Epidemiologia delle mutazioni CFTR in Italia
Mutations
Campania Basilicata Puglia Northern
Italy
F508
55.6
55.8
46.8
47.6
N1303K, G542X,
W1282X, 17171G>A, R553X
18.6
13.4
18.1
10.1
4382delA, 1259insA,
I502T, G1349D
0.3
0
10.5
0
4016insT, G1244E,
R1158X, 711+1G>T,
L1065P
7.2
3.8
1.7
0
2183AA>G, R1162X
0
2.3
5.8
1.9
0.6
1.1
0
19.1
Other known
mutations
6.6
7.6
6.0
13.6
Total detection rate
91.6
8.4
92.1
7.9
84.6
15.4
90.2
9.8
852del22
Unknown mutations
Spettro delle mutazioni CF
•
•
alterazioni funzionali/strutturali del CFTR
F508: 70% alleli FC
Mutazioni gene CFTR
Missenso
41.76
Frameshift
15.76
Splicing
12.71
Nonsenso
9.66
In frame
in/del
2.01
Grandi
in/del
2.85
Promotore
0.52
Variazioni di
sequenza
14.59
LE MUTAZIONI
• Le mutazioni che colpiscono il gene possono essere suddivise in 3
gruppi:
- mutazioni causanti la fibrosi cistica
- mutazioni causanti le patologie CFTR-correlate
- polimorfismi e varianti alleliche senza conseguenze
cliniche
• Sulla base degli effetti provocati dalle mutazioni sul trascritto o sulla
proteina finale è stato possibile suddividerle in 5 classi differenti:
LE MUTAZIONI
La parziale riduzione della funzione (mutazione di classe III e IV) o la
produzione di una proteina funzionante ma in quantità molto limitata
(mutazione di classe V) danno un quadro clinico meno grave
• Per avere la forma classica della fibrosi cistica bisogna avere entrambi
i geni ereditati che presentano una mutazione causante la fibrosi
cistica
F508 Presente nel 70% dei pazienti
•
•
•
Delezione di un singolo
aminoacido (fenilalanina
in pos.508) nell’esone 10
che codifica per la prima
parte del NBD-1 di CFTR
Produce il misfolding di
CFTR nel reticolo
endoplasmico (ER)
Questa proteina immatura
viene degradata dal
proteosoma
CF: F508
•
Mutazione più comune
•
•
•
•
•
•
Etnia
Afro-Americani
Ebrei Ashkenazi
Spagnoli/Italiani
Canadesi
Caucasici nord americani
F508 frequenza
30%
37%
50%
70%
76%
CF: Indicazioni al test genetico
•
•
•
•
Individui affetti
Carrier test
Partners di individui con CF
Diagnosi prenatale
COMPLESSITA’ DIAGNOSTICA
Tecniche di analisi genetica molecolare
Possiamo distinguere vari livelli di analisi molecolare che si caratterizzano per diversi tempi
di esecuzione, tecnologie e costi. Vale la pena sottolineare che i test di I livello possono
vantare una minore copertura ma consentono l’identificazione di mutazioni note,mentre
quelli di II livello hanno una maggiore sensibilità, ma portano a risultati di più difficile
interpretazione perché possono individuare sia mutazioni che portano alla
malattia sia varianti che non sono patologiche.
•Screening di primo livello
•Screening di secondo livello
•Screening di terzo livello
SCREENING di PRIMO LIVELLO:
tipo di campione da cui partire
• Prelievo sangue venoso, o della mucosa
buccale, villi coriali, liquido amniotico

Estrazione del DNA

• Multiplex PCR delle regioni geniche

• Ibridazione DNA con sonde allele specifiche

• RIVELAZIONE
SCREENING di PRIMO LIVELLO
Ricerca delle mutazioni più frequenti causative della fibrosi
cistica mediante l’utilizzo di Kit diagnostici che sfruttano il
principio della ibridazione allele-specifica (ASO).
SCREENING di PRIMO LIVELLO:
Metodica Reverse dot blot
•
Le regioni del gene CFTR, dove sono localizzate le
mutazioni da analizzare, sono amplificate simultaneamente
mediante l’impiego di specifiche coppie di oligonucleotidi.
•
Dopo la multilex PCR, l’amplificato viene denaturato e
posto su una striscia di nitrocellulosa su cui sono presenti
le sonde allele specifiche da testare.
•
Tramite una reazione colorimetrica (biotina-streptavidina) si
forma un precipitato scuro che permette di visualizzare, per
ogni tratto di DNA, una o due bande colorate che
consentiranno di stabilire la presenza o meno della
mutazione testata e lo stato di omozigosi o eterozigosi
RDB - REVERSE DOT BLOT:ibridazione inversa degli acidi
nucleici
•Le sonde allele specifiche vengono fatte aderire stabilmente a una membrana
•di nylon.
• Dopo l’ibridazione tra le sonde e il DNA amplificato, nel quale è
incorporato dUTP biotinilato, si procede alla visualizzazione colorimetrica
con una reazionedi tipo biotina-streptavidina-fosfatasi alcalina.
Detection
omozigote
MM
eterozigote
NM
omozigote
NN
Kit Diagnostici
RDB MULTIPLO
analisi di 36 mutazioni della Fibrosi Cistica (gene CFTR)
Le mutazioni identificate devono essere successivamente
confermate mediante sequenziamento diretto
Indagine prenatale di Fibrosi Cistica
(analisi diretta)
Analisi di II livello
Quando?  per effettuare lo scanning dell’intero gene,
ricercare qualunque tipo di mutazione in ampie porzioni del
gene
ANALISI II LIVELLO
12 esoni
a 57°C
DHPLC
Ex 1,3,4,8,13,14a,15,
16,18,19,20,22,23
PCR dei 27 esoni
15 esoni
a 61°C
Sequenziamento
Ex 2,5,6a,6b,7,9,10,11,
12,14b,17a,17b,21,24
di II livello: d-HPLC
aturing Analisi
High-Performance
Liquid
Denaturing High-Performance Liquid Chromatography
omatography (dHPLC)
Metodica che prevede di far eluire il
La tecnica
si una
basacolonna
sulla diffe
DNA amplificato
attraverso
velocità
di eluizione
cromatografica
in condizione
di in una col
semidenaturazione.
cromatografia per gli eteroduplex
omoduplex. Questi duplex si form
quando
frammenti amplificati di D
1) Amplificazione
del DNA
vengono
termicamen
2) Denaturazione
termica denaturati
dei frammenti
di
DNA amplificatilasciati
e loro ricombinazione
ricombinare. Una qual
3) Formazione dei
duplex (mutazione o polimorfi
variazione
tra le due forme alleliche d
“HETERODUPLEX”
 combinazione
di
frammento
porta alla formazione
d
due catene di DNA
a
singola
catena,
non
eteroduplex (combinazione di
perfettamente corrispondenti,
catene
di DNA
a singola
caratterizzata dalla
presenza
di una
“bolla”,catena,
p e rsi
f etrova
t t a mile nmismatch
te corrisponde
a livello della quale
caratterizzata dalla presenza di
“bolla”
a livello della
quale si tro
OMODUPLEX 
combinazione
di due
catene di DNA amismatch).
singola catena,
perfettamente complementari: entrambi
wt o entrambi mutati
L’ e t e r o d u p l e x s i c o m p o
cromatograficamente in modo diffe
sia dall’omoduplex non mutato
-
Analisi di II livello: d-HPLC
Denaturing High-Performance Liquid Chromatography
-La tecnica si basa sulla differente velocità di eluizione per gli
eteroduplex e gli omoduplex
-L’eteroduplex è più veloce (meno trattenuto) degli omoduplex
-Vantaggi: maggiore sensibilità; notevole praticità e sicurezza
nell’uso.
-Svantaggi: costo elevato
Analisi di III livello
Quando?  per studiare le mutazioni che sfuggono al I e al
II livello, quindi riarrangiamenti genici rari e le mutazioni
introniche non adiacenti agli esoni e causanti alterazioni
dello “splicing”
Analisi di III livello: MLPA
Multiplex ligation-dependent probe amplification
-Si basa sulla amplificazione, mediante PCR, delle
SONDE che vengono aggiunte al campione
-Ogni sonda è costituita da 2 oligonucleotidi che
ibridizzano sequenze adiacenti
-I due oligonucleotidi adiacenti vengono ligati solo in
presenza del DNA target, permettendo la successiva
amplificazione dell’intera sonda
-Tutte le sonde presentano sequenze terminali che
permettono di amplificarle simultaneamente con una
sola coppia di primer
-I prodotti delle diverse sonde vengono distinti sulla base
della lunghezza e delle caratteristiche
Ibridazione & Ligazione
1.
2.
3.
MLPA probemix è costituito da 43 sonde disegnate
per ciascuno dei 27 esoni del gene e per geni di
controllo
Viene aggiunto al DNA genomico denaturato
Ciascuna sonda ibridizza due sequenze adiacenti
Ibridazione & Ligazione
4. La ligazione delle sonde avviene tramite una ligasi
termostabile
Amplificazione
5. Tramite una coppia di primer marcati vengono
amplificate tutte le sonde ligate
1
2
3
35
0
C17
C1P
ex10
C15
58kb >
ex22
C7
ex11
ex21
C5
ex9
ex20
C13
ex8
ex19
ex5
ex7
C1
ex18
ex6
ex12
ex17
ex6
C19
ex17
ex4
ex1
ex16
ex3
C12
ex15
ex2
ex24
C19
ex14
ex24
C19
ex14
ex1
ex23
ex13
58kb <
C5
C2
Elettroforesi capillare
CFTR delex2,3
1.5
1
0.5
COMPLESSITA’ DIAGNOSTICA
Diagnosi genetica … screening prenatale!
E’ possibile eseguire sul liquido amniotico o sui villi coriali la ricerca
delle mutazioni più frequenti che causano la FC (screening 34 o 48
mutazioni), che nel complesso permette di identificare circa l’85% dei
casi di FC nella nostra popolazione.
Cristiana Zollo M46621
LA DIAGNOSI PRENATALE nella FC
•
•
•
Nelle coppie a
rischio
Identificazione della
mutazione nei
genitori
Ricerca della
mutazioni parentali
nel feto
Analisi Diretta
•
I Livello: Reverse Dot Blot
•
- Analisi delle mutazioni più
frequenti
•
II Livello:
- DHPLC
- SEQUENZIAMENTO
III Livello: MLPA
Analisi Indiretta
IVS8GT
IVS17bCA
IVS17bTA
Utilizzo della segregazione dei polimorfismi
IVS8GT e IV17bCA che sono considerati
come i più frequenti.
Si vanno a valutare il numero di ripetizioni di
questi polimorfismi
Cura
Anche se attualmente nessuna cura è in grado di guarire completamente la Fibrosi
Cistica, numerose terapie permettono di contrastare l’evoluzione della malattia,
controllando le infezioni polmonari, fornendo un’alimentazione adeguata e
prevenendo l’ ostruzione intestinale.
Fisioterapia e riabilitazione respiratoria:
per rimuovere dalle vie respiratorie il muco che le ostruisce e che
favorisce le infezioni.
Aerosolterapia: per fluidificare il muco o somministrare antibiotici per via aerea
per controllare le infezioni respiratorie croniche.
Antibioticoterapia: per bocca o per via endovenosa, a cicli o per periodi molto
prolungati, anche in continuazione, per eliminare o contenere la carica e
l'aggressività dei batteri.
Nutrizione: alimentazione sostenuta, ipercalorica, ricca di grassi associata a
somministrazione di enzimi pancreatici ad ogni pasto, in sostituzione di quelli che
il pancreas non produce, e integrata da vitamine liposolubili.
Terapia genica
•
La terapia genica mira nell’uso
della forma normale del gene allo
scopo di correggere il gene mutato
causativo della malattia.
•
Il goal sarebbe quello di sostituire il
gene mutato nelle cellule del
polmone per curare la malattia o
per diminuirne la progressione.
•
Vettori per trasferire la proteina:
virus adenoassociati, liposomi,
cellule staminali.
•
Correzioni della funzionalità della
proteina legata al suo cattivo
ripiegamento.
•
Aumento del numero dei canali del
cloro funzionanti
COMPLESSITA’ DIAGNOSTICA
Dagli USA primo ok al farmaco per i
pazienti con mutazione F508del …
BOSTON, 13 maggio 2015 - Una nuova e importante buona notizia per i pazienti affetti
da fibrosi cistica.
Dopo appena una settimana dall’introduzione sul mercato italiano di ivacaftor, il primo
farmaco in grado di agire sulle cause della malattia, dagli USA è arrivato il primo parere
positivo su un’altra terapia potenzialmente in grado di cambiare radicalmente le sorti
della patologia …
…Si tratta della combinazione di ivacaftor con lumacaftor (ORKAMBI), prodotta
anche in questo caso da Vertex. La combinazione di farmaci ha dimostrato risultati
incoraggianti per i pazienti con due copie della mutazione F508del nel gene CFTR.
Noto come correttore del CFTR, lumacaftor ha lo scopo di trattare il difetto di
elaborazione e trasporto della proteina F508del-CFTR al fine di permetterle di
raggiungere la superficie cellulare dove il potenziatore del CFTR, ivacaftor, può
ulteriormente migliorarne la funzione di canale ionico.. !
LE NUOVE FRONTIERE DELL’INGEGNERIA GENETICA
Manipolare geni umani sarà dunque
possibile?
Editing genetico
•Tecnica di terapia genica in cui una specifica sequenza del DNA cellulare, definita “target”, è
direttamente modificata.
•Introduzione all’interno delle cellule di una sequenza esogena di DNA, in grado di riconoscere in
maniera specifica la sequenza target e apportare una specifica conversione.
• Il segmento di DNA esogeno ha una sequenza omologa alla sequenza bersaglio e differisce solo per
l’alterazione genica (inserzione, delezione, sostituzione) da “introdurre” o da “correggere”.