ANIMALI TRANSGENICI :
definizione
Animali transgenici: animali ottenuti
attraverso una manipolazione del genoma,
inserendo uno o più geni, appartenenti alla
stessa specie, o più spesso di specie diverse.
Vettori retrovirali (terapia genica)
Microiniezione del DNA nel
pronucleo maschile (in zigoti fertilizzati)
Cellule staminali embrionali
(trasfezione/elettroporazione blastocisti)
Cellule staminali embrionali
TOPO CHIMERA
È necessario selezionare la progenie per avete topi con un genotipo omogeneo
eterozigote o omozigote
P1
P2
P3
P1
Il topo chimerico (P1) puo’ avere la
mutazione nella linea germinale
(in eterozigosi) oppure no.
In P3 l’assortimento genotipico
segue le regole mendeliane per
l’incrocio tra due eterozigoti
ANIMALI TRANSGENICI :
come si producono???
GFP
Vettori retrovirali
Microiniezione del DNA
Cellule staminali embrionali
Gene targeting/ gene trapping
KO condizionali
Trasferimento del nucleo
YAC
STRATEGIE PER LA PRODUZIONE DI ORGANISMI TRANSGENICI
Gene trapping:
inserzione in una cassetta CASUALE
Gene targeting:
inserzione in un gene SPECIFICO
mutagenesi MIRATA
GENE TRAPPING
Per fare topi transgenici su vasta scala
generalizzata, senza un solo target...ma
anche per identificare nuovi geni
“Gene trapping is a form of insertional mutagenesis
specifically designed to disrupt gene function by
producing intragenic integration events”.
Integrazione casuale nel genoma di
un costrutto contenente un gene
reporter (entrapment vector)
Integrazione “produttiva” porta il gene
reporter sotto la regolazione
trascrizionale di un gene endogeno
Il GENE TRAPPING
1) Consente l’isolamento di nuovi geni
2) Consente la determinazione del profilo di espressione del gene
intrappolato
X-gal staining of E9.5d embryo
showing reporter gene expression
associated with a secretory trap
insertion in a novel gene.
Courtesy K. Pinson
3) È mutagenico: produce knockout
STRATEGIA DEL
GENE TRAP
Scelta opportuna del vettore e del sistema di trasferimento
Selezione dei cloni tramite “marker”
Localizzazione dell’inserto nel clone selezionato
ANALISI DEL FENOTIPO
ELEMENTI necessari per
gene trap:
• Cellule staminali embrionali di Topo o Uomo
• “Entrapment vector” contenente :
- gene reporter
- marker di selezione
• Cellule staminali embrionali di Topo
Integrazione
Sito specifica
SELEZIONE di ES CELLS con TRANSGENE
integrato nel sito corretto
• Geni reporter
• The E.coli lacZ gene (produzione di beta-Gal)
“Lac Z staining”: colorazione istochimica che rivela la presenza della beta-galattosidasi. Questo enzima, in presenza del
substrato X-Gal, produce un prodotto insolubile di colore BLU. Questo metodo visualizza la presenza della beta-galattosidasi
sia nell’organo “in toto” sia in specifici tessuti/cellule.
• The firefly luciferase gene
• The jelly fish green flourescence protein (GFP)
gene
Elementi importanti
per espressione di un gene e
utilizzati per il
GENE TRAPPING
Enhancer corte sequenze che stimolano l’attività trascrizionale
di un promotore
Promotore combinazione di elementi ai quali si lega l’RNA polimerasi
per iniziare la trascrizione di un gene
Poliadenilazione aggiunta di circa 200 A all’estremità 3’ di un mRNA.
La coda poly(A) è importante per la stabilità dell’mRNA
Vettori utilizzati per il GENE TRAPPING
•
•
•
•
Enhancer trap Vector
Promoter trap V.
poly A trap V.
Gene trap V.
Enhancer Trap
Vector
Endogenous gene X
Promotore e pA
INDIPENDENTI
P'
Promotore
MINIMO
Enhancer
Exon 1
Exon 2
DNA
RNA
protein
PROTEIN X
lac Z
neo
pA
Exon 3
Vector Integration
Promotore
MINIMO
lac Z
neo
lac Z
neo
β-gal
NeoR
pA
Promoter Trap
PROMOTORE
Endogenous gene X
Vector
Promotore
ASSENTE
P'
lac Z
neo
pA
Vector Integration
DNA
lac Z
RNA
protein
lac Z
PROTEIN X
β-gal
neo
neo
NeoR
Promotore e pA
INDIPENDENTI
pA
Poly A Trap
Vector
Promotore e pA
INDIPENDENTI
Endogenous gene X
P'
lac Z
neo
SA
SD
Vector Integration
SA
DNA
lac Z
neo
pA
SA
RNA
lac Z
neo
pA
protein
PROTEIN X
β-gal
NeoR
Gene Trap
Vector
Endogenous gene X
Promotore
ASSENTE
P'
neo
lac Z
SA
Introne gene X
Vector Integration
SA
DNA
lac Z
neo
lac Z
neo
Spliced transcript
SA
RNA
protein
PROTEIN X
β-gal
Promotore e pA
INDIPENDENTI
NeoR
Distruzione GENE X e ANALISI ESPRESSIONE
pA
pA
Gene Trap
RICAPITOLANDO…………..
Il GENE TRAPPPING consente
1) Identificazione NUOVI GENI
2) Produzione di TOPI TRANSGENICI (KO)
3) ANALISI dell’ESPRESSIONE di GENI
GENE TARGETING
PREMIO NOBEL per la MEDICINA 2007
Motivazione: for their work on "principles for introducing specific gene
modifications in mice by the use of embryonic stem cells and gene targeting.”
Mario R. Capecchi
Martin J. Evans
Oliver Smithies
GENE TARGETING
Mutagenesi MIRATA mediante ricombinazione
omologa in cellule ES
Permette la creazione di una mutazione in un
gene PREDETERMINATO
Questa mutagenesi può avere come risultato:
1) INATTIVAZIONE dell’espressione di un gene (KNOCK-OUT)
2) DIMINUZIONE dell’espressione di un gene (KNOCK-DOWN)
3) INSERZIONE di un gene difettivo/selvatico (correzione) (KNOCK-IN)
IL GENE TARGETING SFRUTTA LA RICOMBINAZIONE OMOLOGA
IL GENE TARGETING SFRUTTA LA RICOMBINAZIONE OMOLOGA
Nelle cellule di Mammifero la RICOMBINAZIONE OMOLOGA è un evento
MOLTO RARO (a differenza del Lievito)
La frequenza di questo evento aumenta se il grado di OMOLOGIA di sequenza
tra il DNA introdotto (esogeno) e il GENE BERSAGLIO (endogeno) è molto elevata
Per questo il clone di DNA esogeno è una sequenza ISOGENICA
(derivante dallo stesso ceppo murino)
vettori utilizzati per
GENE TARGETING
1) VETTORI DI INSERZIONE (per produzione di TOPI KNOCK-OUT)
Gene di interesse
M: marker esterno
alla regione omologa
Singolo evento di ricombinazione
Distruzione del locus genico: KO
2) VETTORI DI SOSTITUZIONE (per produzione di TOPI KNOCK-IN)
Gene di interesse
M: marker interno
alla regione omologa
Doppia ricombinazione
Sostituzione di parti del locus genico
1) Per correggere un gene
2) Per produrne forma inattiva
Un topo KO per un gene X non sempre ha “fenotipo”
Per effetto di RIDONDANZA GENETICA (presenza nel genoma di altri geni con funzione simile)
PER QUESTO PUO’ ESSERE NECESSARIO PRODURRE DOPPI/TRIPLI KO
DOPPI e TRIPLI KNOCK-OUT
…esempio di TRIPLO KO………
La famiglia delle Serin-treonine chinasi PIM
Ruolo di PIM
PIM1 KO: nessun FENOTIPO
PIM2 KO: nessun FENOTIPO
PIM3 KO: nessun FENOTIPO
Solo il triplo KO ha un fenotipo
“Mice Deficient for All PIM Kinases Display Reduced Body Size and
Impaired Responses to Hematopoietic Growth Factors”
…esempio di KNOCK-IN………
?
Qual è l’importanza della FOSFORILAZIONE della proteina ribosomale S6???
S6K1 KO: rpS6 fosforilata!
S6K2 KO: rpS6 fosforilata!
S6K1/K2 doppioKO: rpS6 fosforilata!
……..esiste un’altra chinasi (o piu’ di una!!)
Unica soluzione……..RPS6 KNOCK-IN non fosforilabile
Ribosomal protein S6 phosphorylation is a
determinant of cell size and glucose homeostasis
MUTAGENESI
CHIMICA/FISICA
Mutagenesi RANDOM
LABORIOSA ANALISI FENOTIPO E IDENTIFICAZIONE GENE MUTATO
PER CORRELARE GENE/FENOTIPO
Mutagenesi chimica: ENU (Etil-Nitrosurea)
EMS (Etil-Metilsolfonato)
Mutagenesi fisica : raggi X
CONFRONTO TECNICHE MUTAGENESI
MUTAGENESI
CHIMICA
GENE
TARGETING
GENE
TRAPPING
G 19/03: PRESENTAZIONE + Lez1 ANIMALI TRANSGENICI
G 26/03: OGM (Prof. Gravina)Lez1
G 02/04: OGM (Prof. Gravina)Lez2
G 09/04: Lez2 ANIMALI TRANSGENICI ***consegna articoli
G 16/04: Lez3 ANIMALI TRANSGENICI
G 23/04: Lez4 DROSOPHILA
G 30/04: Lez5 PIANTE
G 07/05: Lez6 PIANTE
(3 a lezione) 15m ognuna
G 14/05: PRESENTAZIONI
1A 1B 1C (topi tecniche)
G 21/05: PRESENTAZIONI
2A 2B 2C (topi KO K-In)
G 28/05: PRESENTAZIONI
3A 3B 3C (topi KO K-In)
G 04/06: PRESENTAZIONI
4A 4B
4C (Drosophila)
G 11/06: PRESENTAZIONI
5A 5B
5C (piante)
