Marcatori proteici

Marcatori Molecolari
 Introduzione
 Marcatori RAPD
 Marcatori proteici
 Marcatori STS
 DNA
 Marcatori AFLP
 Marcatori RFLP
 Tecniche elettroforesi
 PCR
 Considerazioni
 Applicazioni
Introduzione
 I fattori ambientali possono influenzare i
caratteri morfologici
 I marcatori molecolari (MM) focalizzano la
diversità del materiale genetico e misurano le
variazioni controllate da geni
I MM possono essere usati per :
misurare diversità genetica
 costituire mappe genetiche
 selezione assistita (MAS)
 supporto all’isolamento genico (PC)
Che cosa sono i
Marcatori Molecolari ??
 Marcatori Molecolari
sequenze proteiche e di DNA facilmente individuabili e
la cui eredità può essere controllata
 Polimorfismo in proteine
proteine del seme
isoenzimi ed alloenzimi
Polimorfismi di DNA
nucleare
citoplasmatico
Proprietà desiderabili
 Polimorfico
 Eredità codominante
 Distribuito in tutto il genoma
 Facile e veloce da individuare
 Poco costoso
 Riproducibile / Trasferibile
 Nessun marcatore le possiede tutte
Marcatori proteici
 Breve introduzione alle proteine
 Proteine di conservazione del seme
 Isoenzimi
 Alloenzimi
Struttura delle proteine
Struttura delle proteine
 Struttura primaria – backbone del polipeptide
 Struttura secondaria – legami ad idrogeno locali
 Struttura terziaria – legami che coinvogono i gruppi R
 Struttura quaternaria – interazione tra polipeptidi
Proteine ed ambiente
 La struttura tridimensionale delle proteine è il
risultato dell’interazione con l’ambiente.
 Bisogna quindi tenere conto della denaturazione delle
proteine ….
 …. e della diversità della loro funzione …
…facilitata dalla complessità di struttura
Proteine seed storage

Perché usiamo le proteine del seme ??
•
•
•

i semi sono ricchi di proteine
le proteine sono disponibili in sufficiente quantità
i semi sono uno stadio dello sviluppo ben definito
La metodologia
•
•
•
si estraggono le proteine e si separano in elettroforesi
si visualizzano sul gel con la colorazione (staining)
si analizza il pattern delle bande
Considerazioni ed Applicazioni

Considerazioni
•
•
•

co-migrazione
pattern delle bande complesso
variazione intraspecifica
Applicazione della tecnica
•
•
es. frumento, orzo
recentemente anche melanzana
Isoenzimi ed Alloenzimi

Forme multiple dello stesso enzima
• isoenzima : un enzima, più di un locus genico
• alloenzima : un enzima, un locus genico

Metodologie
• tessuti macerati
• enzimi separati per elettroforesi
• visualizzazione per colorazione istochimica
• analisi del pattern
Interpretazione del pattern
 Omozigote o eterozigote ??
 Struttura quaternaria dell’enzima
 Numero di loci
 Numero di alleli
 Analisi genetiche spesso necessarie
Formazioni di eteromeri
Applicazioni

Metodo potente e riproducibile per :
•
•
•

caratterizzare/identificare genotipi
studi di genetica di popolazione
esaminare patterns di variazione geografica
Limitato numero di enzimi disponibili
Marcatori su DNA
 Le basi del DNA
 Metodo RFLP
 Metodi basati sulla PCR
 Marcatori STS
 Marcatori AFLP
 Tecniche elettroforesi
Le basi del DNA
La sintesi del DNA
Marcatori RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism

Gli RFLP esaminano differenze in peso molecolare di specifici frammenti di DNA ristretti
 Usualmente si utilizza il DNA totale
 Richiedono DNA puro e di alto peso
molecolare
Metodologia RFLP

Tagliare il DNA in piccoli frammenti
 Separare i frammenti in gel eletttroforesi
 Trasferire i frammenti di DNA su filtro
Metodologia RFLP

Visualizzazione dei frammenti di DNA
• sonde radioattive
• sonde non-radioattive
 Analisi dei risultati
• bande selezionate per presenza/assenza
• differenze nel pattern riflettono differenze
genetiche
 La scelta di sonda ed enzima di
restrizione è cruciale
Interpretazione dei Risultati
Esempio di Analisi
RFLP su fragola
RFLP : vantaggi e svantaggi



Riproducibili
Marcatori codominanti
Tecnica semplice


Tecnica lunga e costosa
Utilizzo di sonde radioattive
Marcatori su DNA
 Le basi del DNA
 Metodo RFLP
 Metodi basati sulla PCR
 Marcatori STS
 Marcatori AFLP
 Tecniche elettroforesi
PCR
Polymerase Chain Reaction


Potente tecnica per amplificare il DNA
Prevede l’utilizzo di cicli di temeperature
• step di denaturazione
• step di annealing
• step di elongazione

Il DNA amplificato viene separato su gel
elettroforesi
I tre passaggi della PCR
PCR : componenti reazione




Utilizzo della Taq polimerasi
Condizioni di reazione
Importanza della standardizzazione
Una reazione contiene :
• target DNA
• Taq polimerasi
• uno o più starter o primer
• 4 deoxynucleotidi dATP, dCTP, dGTP, dTTP
• buffer di reazione con il cofattore MgCl2
PCR : riassunto
 DNA polimerasi
 Apparecchio Thermal Cycler
 Profilo delle temperatura (programma)
 Concentrazione del DNA target
 Concentrazione dello ione Mg
RAPD
Random Amplified Polymorphic DNA
 Tratti di DNA anonimi amplificati utilizzando
primer arbitrari
 Metodo veloce per individuare polimorfismi
 Marcatori dominanti
 Problemi di riproducibilità
Interpretazione dei RAPDs
 I marcatori RAPDs sono anonimi
 I marcatori RAPDs sono dominanti
 Problemi di co-migrazione
una banda, un frammento ?
 stessa banda, stesso frammento ?
RFLP : vantaggi e svantaggi



Semplici e veloci
Poco costosi
Non utilizza radioattivo



Marcatori dominanti
Problemi di riproducibilità
Problemi di interpretazione
Marcatori su DNA
 Le basi del DNA
 Metodo RFLP
 Metodi basati sulla PCR
 Marcatori STS
 Marcatori AFLP
 Tecniche elettroforesi
STS
Sequence-Tagged Sites
 Utilizzano la PCR a partire da :
 Sequence-Tagged Microsatellites (STMS)

Oligonucleotidi ancorati a MS
 inter-simple sequence repeat (ISSR)
 Sequence-characterized amplified regions
(SCARs)
 Cleaved amplified polymorphic sequence
(CAPS)
Marcatori Microsatelliti

Sequence-Tagged MS
 In genere single locus multiallelico

 Codominante
Inter-simple sequence repeats
 Amplificano segmenti adiacenti
sequenze ripetute (repeats)
 Marcatori dominanti
SCARs and CAPS

SCARs – sequence characterized amplified
regions
marcatore single locus derivante da frammento
RAPD

CAPS – cleaved amplified polymorphic
sequence
Marcatore locus specifico
Prodotto di amplificazione RAPD utilizzato come
sonda RFLP
Marcatori su DNA
 Le basi del DNA
 Metodo RFLP
 Metodi basati sulla PCR
 Marcatori STS
 Marcatori AFLP
 Tecniche elettroforesi
AFLP
Amplified Fragment Length Polymorphism

Tecnicamente sfruttano la combinazione tra
RFLP e PCR
 Il risultato è un fingerprint altamente
informativo
 Il metodo diviene sempre più popolare
AFLP
La Tecnica
AFLP : vantaggi e svantaggi



Altamente sensibili
Altamente riproducibili
Largamente applicabili
 Costosi
 Tecnicamente difficili
 Necessari radioisotopi
 Problemi di interpretazione
Analisi RAPD
su melanzana
Esempio di Analisi
AFLP su vite