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Le tecniche della
biologia molecolare
Le tecniche della biologia molecolare
Lezione 4
Domanda!
Perché dopo un vaccino
ci si può sentire poco bene?
Prova tu a rispondere e poi continua a leggere….
La biologia molecolare
Introduzione
DNA ricombinante
DNA ricombinante applicazioni
Vaccini
Alcuni tipi di vaccini
Vaccini: curiosità
La biologia molecolare
Studia le molecole complesse
presenti nella cellula
DNA, RNA e PROTEINE
Tecniche della biologia
molecolare
Prese da altre
discipline
(genetica, fisica,
biochimica, …)
Applicate
nell’ingegneria
genetica e in
biotecnologie
Il DNA ricombinante
Introduzione
DNA ricombinante
DNA ricombinante applicazioni
Vaccini
Alcuni tipi di vaccini
Vaccini: curiosità
L’ingegneria genetica nasce dalla possibilità di trasferire brevi segmenti
di DNA di un organismo al DNA di un organismo diverso.
La TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE permette di creare e
duplicare geni e proteine, isolando e ricombinando fra loro segmenti di
DNA di diversa provenienza.
Il DNA ricombinante
Introduzione
DNA ricombinante
DNA ricombinante applicazioni
Vaccini
Alcuni tipi di vaccini
Vaccini: curiosità
4 FASI
FASE 1:
Estrarre il DNA e
frammentarlo in
segmenti definiti
FASE 2:
Isolare il segmento
contenente il gene
di interesse
FASE 3:
Amplificare i
frammenti di
interesse
FASE 4:
Trasferire il
segmento di DNA
all’interno di una
cellula ospite, dove
quel gene verrà
duplicato ed
espresso
Il DNA ricombinante
Introduzione
DNA ricombinante
DNA ricombinante applicazioni
Vaccini
Alcuni tipi di vaccini
Vaccini: curiosità
Fase 1: Estrarre il DNA e frammentarlo in segmenti definiti
Per tagliare il DNA si utilizzano enzimi di restrizione che individuano
e tagliano la molecola di DNA solo in particolari siti caratterizzati da una
sequenza di basi azotate.
Sono stati scoperti molteplici tipi di enzimi di
restrizione che permettono
di tagliare la molecola di DNA ciascuna in una
specifica sequenza di basi azotate
Il DNA ricombinante
Introduzione
DNA ricombinante
DNA ricombinante applicazioni
Vaccini
Alcuni tipi di vaccini
Vaccini: curiosità
Fase 2: Isolare il segmento contenente il gene di interesse
Differenze nel DNA di ogni organismo:
anche le sequenze di DNA omologhe sono diverse
I segmenti tagliati, detti frammenti di restrizione,
hanno lunghezze disuguali
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism):
polimorfismi dei frammenti di restrizione
Tecnica di separazione: ELETTROFORESI SU GEL
Il DNA ricombinante
Introduzione
DNA ricombinante
DNA ricombinante applicazioni
Vaccini
Alcuni tipi di vaccini
Vaccini: curiosità
Tecnica di separazione: ELETTROFORESI SU GEL
I segmenti di DNA
hanno
carica negativa
data dai gruppi
fosfato
Diversa lunghezza
(e peso)
Il gel
serve da supporto
e da setaccio
molecolare
È immerso in
un capo
elettrico
I frammenti più piccoli si
muovono con velocità
maggiore
I segmenti vengono separati in base alla minore/maggiore
migrazione all’interno del gel
Il DNA ricombinante
Introduzione
DNA ricombinante
DNA ricombinante applicazioni
Vaccini
Alcuni tipi di vaccini
Vaccini: curiosità
Fase 3: Amplificare i frammenti di interesse
Non sempre si ha a disposizione abbastanza DNA per applicare l’analisi dei
frammenti di restrizione
1
molecola
I ciclo
2
molecole
II ciclo
22 = 4
molecole
III ciclo
……………………
23 = 8
molecole
PRC (Polymerase Chain Reaction): tecnica che
permette di amplificare (clonare) in provetta un
segmento di DNA
Il DNA da duplicare viene denaturato (separazione
dei due filamenti) e aggiunto a una miscela formata
da monomeri di nucleotidi e DNA-polimerasi (enzimi)
Ad ogni ciclo ciascun filamento viene completato dal
suo complementare, duplicando il DNA di partenza
Il DNA ricombinante
Introduzione
DNA ricombinante
DNA ricombinante applicazioni
Vaccini
Alcuni tipi di vaccini
Vaccini: curiosità
Fase 4: Trasferire il segmento di DNA all’interno di una cellula
ospite, dove quel gene verrà duplicato ed espresso
Le cellule in cui è più facile inserire il DNA sono i batteri.
DNA
estraneo
DNA batterico
Spesso inserito
sotto forma di
plasmide
BATTERIO
Nei batteri è presente un'unica molecola di DNA circolare a doppia catena,
per questo motivo risulta più semplice trasferirvi segmenti di DNA estranei.
Il DNA ricombinante
Introduzione
DNA ricombinante
DNA ricombinante applicazioni
Vaccini
Alcuni tipi di vaccini
Vaccini: curiosità
Tramite la clonazione si possono ottenere copie del batterio modificato.
Molte copie
del gene
DNA
ricombinato
Molte
proteine
codificate
dal gene
Si può quindi estrarre dai batteri le copie dei geni oppure ottenere
le proteine codificate dal gene inserito.
Il DNA ricombinante: applicazioni
Introduzione
DNA ricombinante
DNA ricombinante applicazioni
Vaccini
Alcuni tipi di vaccini
Vaccini: curiosità
Le applicazioni della tecnologia del DNA ricombinante sono molteplici e anche in futuro
questa tecnica, insieme ad altre tecniche di biologia molecolare, potranno portare progressi
notevoli in svariati campi.
MEDICINA:
•
•
•
Produzione dell’insulina
Sintesi di vaccini e farmaci
Fecondazione artificiale
AGRICOLTURA:
•
•
Creazioni di piante più resistenti
Eliminazione di rifiuti tossici
INDUSTRIA:
•
•
Produzione di vitamine per la cosmesi
Produzione di biocarburanti
Vaccini
Introduzione
DNA ricombinante
DNA ricombinante applicazioni
Vaccini
Alcuni tipi di vaccini
Vaccini: curiosità
I vaccini si basano su due
caratteristiche del sistema immunitario
Specificità
Memoria
Per ogni antigene (sostanza estranea)
si attiva una specifica risposta
immunitaria
In seguito alla risposta primaria alcuni
globuli bianchi che fungono da memoria
Se si ricontrae la malattia il sistema
immunitario è pronto a reagire creando
velocemente gli anticorpi
Vaccini
Introduzione
DNA ricombinante
DNA ricombinante applicazioni
Vaccini
Alcuni tipi di vaccini
Vaccini: curiosità
I vaccini
Sono microrganismi patogeni
(responsabili dell’insorgenza della malattia).
Provocano una infezione minima
(che non fa insorgere la malattia)
Trattati in modo da:
Non fa insorgere
la malattia
perdere le
proprietà
infettive
Mantenere le proprietà antigene
(che stimolano il sistema
immunitario alla
produzione di anticorpi)
Antigeni = falsi invasori che
scatenano la risposta immunitaria
Scatena la risposta
immunitaria primaria
Si creano i globuli
bianchi che difendono
dalla malattia
Vaccini a DNA
Introduzione
DNA ricombinante applicazioni
DNA ricombinante
Alcuni tipi di vaccini
Vaccini
Vaccini: curiosità
Vaccini basati sulla tecnologia del
DNA ricombinante
Non viene iniettato
direttamente l’antigene
Viene iniettato un batterio con
DNA ricombinato che contiene il
gene che codifica l’antigene
L’organismo stesso
produce l’antigene
Migliore risposta
immunitaria
Sperimentazioni per vaccini
antitumorali
Alcuni tipi di vaccini
Introduzione
DNA ricombinante applicazioni
DNA ricombinante
Vaccini
Vaccini: curiosità
Alcuni tipi di vaccini
Esistono quindi diversi tipi di vaccini, a seconda della modalità in cui
vengono preparati
vaccini da
microrganismi
vivi/attenuati
vaccini da
microrganismi
inattivati
Microrganismi in
condizioni particolari
Microrganismi uccisi
Esempio:
Vacc. Morbillo,
Vacc. Poliomielite
(Sabin)
Esempio:
Vacc. Poliomielite
(Salk)
Esistono 2 vaccini
per la Poliomielite
vaccini sintetici
Vaccini di 2°
generazione
Immunizzazione
contro la tossina in
questione tramite la
produzione in
laboratorio di una
antitossina
Prodotti
dell’ingegneria
genetica o da
tecniche come
quella del DNA
ricombinante
Esempio:
Vacc. Tetano
Esempio:
Vacc.Epatite B
Vaccini: Curiosità
Introduzione
DNA ricombinante
DNA ricombinante applicazioni
Vaccini
Alcuni tipi di vaccini
Vaccini: curiosità
Può succedere che i giorni seguenti a un vaccino ci si senta spossati.
Il vaccino infatti è spesso ricavato da un organismo patogeno ma inattivato in modo da
scatenare la reazione immunitaria primaria senza causare la malattia.
Dopo aver fatto il vaccino però i nostri anticorpi saranno pronti a difenderci da un
reale contagio.
Le tecniche della biologia molecolare
ESERCIZI
Le tecniche della biologia molecolare
Completa lo schema della tecnica del DNA ricombinante con le seguenti parole:
Fase 1
……………
Trasferimento del
DNA ricombinante
Fase 2
……………
Estrazione e
frammentazione
del DNA
Fase 3
……………
Amplificazione
del DNA
Fase 4
……………
Isolamento del
segmento di DNA
Soluzione
Fase 1
Estrazione e
frammentazione
del DNA
Fase 2
Isolamento del
segmento di DNA
Fase 3
Amplificazione
del DNA
Fase 4
Trasferimento del
DNA ricombinante
Le tecniche della biologia molecolare
Indica se ogni affermazione è vera (V) o falsa (F):
Gli enzimi di restrizione vengono utilizzati per duplicare il DNA
□V
□F
Gli enzimi di restrizioni riconoscono particolari sequenze di DNA
□V
□F
Tutti i segmenti di DNA isolati hanno la stessa lunghezza
□V
□F
L’elettroforesi su gel permette di separare i frammenti di DNA
□V
□F
I frammenti di DNA hanno carica negativa data dai gruppi fosfato
□V
□F
La PCR avviene in una miscela di monomeri di nucleotidi e DNA polimerasi
□V
□F
I batteri con DNA ricombinato perdono la possibilità di duplicarsi
□V
□F
La tecnologia del DNA ricombinante ha permesso di sintetizzare particolari proteine
□V
□F
La memoria è una caratteristica del nostro sistema immunitario
□V
□F
I vaccini sono trattati in modo da perdere le proprietà antigene
□V
□F
Il vaccino antitetanico è ottenuto creando in laboratorio un’antitossina
□V
□F
Soluzione
Gli enzimi di restrizione vengono utilizzati per duplicare il DNA
□V
□F
Gli enzimi di restrizione riconoscono particolari sequenze di DNA
□V
□F
Tutti i segmenti di DNA isolati hanno la stessa lunghezza
□V
□F
L’elettroforesi su gel permette di separare i frammenti di DNA
□V
□F
I frammenti di DNA hanno carica negativa data dai gruppi fosfato
□V
□F
La PCR avviene in una miscela di monomeri di nucleotidi e enzimi
□V
□F
I batteri con DNA ricombinato perdono la possibilità di duplicarsi
□V
□F
La tecnologia del DNA ricombinante ha permesso di sintetizzare particolari proteine
□V
□F
La memoria è una caratteristica del nostro sistema immunitario
□V
□F
I vaccini sono trattati in modo da perdere le proprietà antigene
□V
□F
Il vaccino antitetanico è ottenuto creando in laboratorio un’antitossina
□V
□F
Le tecniche della biologia molecolare
Individua la risposta corretta:
Partendo da una molecola di DNA, dopo 4 cicli quante molecole di DNA produce la PCR?




A)
B)
C)
D)
2
4
16
32
Un vaccino ha il compito di:




A)
B)
C)
D)
scatenare la difesa immunitaria secondaria
scatenare la difesa immunitaria primaria
curare una malattia
creare globuli rossi
Quali di questi vaccini è creato da microrganismi vivi/attenuati?




A)
B)
C)
D)
Vaccino antitetanico
Vaccino contro il morbillo
Vaccino contro l’epatite B
Nessuno dei precedenti
Soluzione
Partendo da una molecola di DNA, dopo 4 cicli quante molecole di DNA produce la PCR?




A)
B)
C)
D)
2
4
16
32
Un vaccino ha il compito di:




A)
B)
C)
D)
scatenare la difesa immunitaria secondaria
scatenare la difesa immunitaria primaria
curare una malattia
creare globuli rossi
Quali di questi vaccini è creato da microrganismi vivi/attenuati?




A)
B)
C)
D)
Vaccino antitetanico
Vaccino contro il morbillo
Vaccino contro l’epatite B
Nessuno dei precedenti
Le tecniche della biologia molecolare
Inserisci nel riquadro verde l’esempio corretto:
Tipologie di vaccini
vaccini da
microrganismi
vivi/attenuati
vaccini da
microrganismi
inattivati
vaccini sintetici
Vacc. Poliomielite
(Salk)
Vaccini di 2°
generazione
Vacc. Poliomielite
(Sabin)
Vacc. Tetano
Vacc.Epatite B
Soluzione
Inserisci nel riquadro verde l’esempio corretto:
Tipologie di vaccini
vaccini da
microrganismi
vivi/attenuati
vaccini da
microrganismi
inattivati
vaccini sintetici
Vaccini di 2°
generazione
Vacc. Poliomielite
(Sabin)
Vacc. Poliomielite
(Salk)
Vacc. Tetano
Vacc.Epatite B