Lez_11-12_vettori_13

Lezione 11 - 12
mercoledì 13 Marzo 2011
corso vettori biologici II
Biotec industriali
ore 14:00 -16:00 aula 6A
Colli di bottiglia limitanti
Strategie di clonaggio per una buona efficienza a monte
della trasfezione:
- siti di restrizione adottati (es. BamHI) per libraries o per
clonaggio di singoli frammenti,
- rapporti quantitativi inserto/plasmide o inserto/vettore
vettori virali analizzati a parte
La struttura del vettore dal punto di vista genomico non è
diverso dagli altri vettori per la struttura delle parti che
devono specificare la sua funzione nella cellula ospite.
la differenza sta nel capside con cui viene veicolato per
ottenere alta efficienza di trasfezione “pseudo-infezione”
molti vettori che vengono trasfettati con metodologie
chimiche o fisiche hanno delle parti che possono derivare da
virus o fagi e però non essere impacchettati o prodotti come
particelle virali, viceversa alcuni vettori possono essere
impacchettati in particelle virali senza contenere gran parte
del genoma virale, mediante helper-virus
Uso di vettori virali
L’uso di vettori virali è considerato valido non solo per la
facilità di trasfezione - infezione (passaggio dalla
membrana), ma anche per l’uso di strutture genomiche utili
per la replicazione del virus, l’integrazione del virus,
l’attivazione di geni tramite promotori virali, strutture come
IRES e molte altre utilizzate per ingegnerizzare i vettori
I limiti dei vettori virali
Nell’uso per trasfettare linee cellulari alcuni limiti sono dati dalla
difficoltà: - di fare virus incompleti che non possano ricombinare
per ridare virulenza,
- di avere solo le funzioni per la sintesi del capside,
- di impedire la ricombinazione con virus helper per ridare virus
completi riarrangiati
Nel caso di uso su animali in vivo i problemi possono essere:
- antigenicità dei virus, quindi l’impossibilità del riutilizzo per più
dosi o ripetizione della infezione
- ricombinazione con virus endogeni e rivirulentizzazione
Strutture dei vettori
La struttura dei vettori deriva dall’assemblaggio di parti
note per varie funzioni con alta efficienza per lo scopo
preposto.
- espressione integrazione o transiente : promotore forte,
costitutivo, polyA, IRES (internal ribosome entry site),
gene reporter,
- solo per integrazione: promotore inducibile, repressore
disattivabile inducibile, enzima per resistenza ad
antibiotico, strutture a cassetta per siti specifici di
ricombinazione,
Vettori per integrazione nel genoma
sono fatti per prevedere integrazione secondo il
meccanismo scelto a livello di organismi o cellule
- ci possono essere enzimi che attivano la ricombinazione
su siti spefici, sistema cre-lox o Frt FLP
-ricombinazione sito specifica solo per omologia di
sequenza con la regione endogena in cui si vuole fare
ricombinare il vettore, l’evento ha una frequenza 1/106
- per trovare i ricombinanti si seleziona per un antibiotico
Per preparare il vettore
Metodi per assemblare il vettore
Con enzimi di restrizione classici del clonaggio
Con prodotti di PCR con assemblaggio per
complementarietà
clonare e controllare
quando si clona come si può essere sicuri di aver clonato
la cosa giusta ?
cosa sono i controlli e come si fanno?
Si deve saggiare l’ipotesi opposta (esclusione/inclusione)
negare che non sia stato il caso a dare l’evento
la selezione con l’antibiotico garantisce che sia presente il
plasmide
ci deve essere anche l’inserto!
controllo dell’inserto clonato
1° controllo per grandi frammenti = Southern
2° corsa elettroforetica della miniprep batterica del DNA
plasmidico superavvolto o linearizzato o separando
inserto da vettore con enzimi esterni al sito di clonaggio
ma interni al sito multiplo di clonaggio SMC o MCS
3°controllo per PCR (vedremo prossimamente) con
strategie diverse tramite primers scelti sul plasmide ed
eventualmente sul DNA clonato quando è lungo con
successiva analisi su gel di agarosio
4° controllo: sequenziamento diretto dei punti critici del
clonaggio (conservazione della open-reading-frame)
oppure il verso di inserzione dell’inserto clonato
Piastra clonaggio E coli lac-z
Replica plate
Crescita di batteriofagi
Placche di fagi
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Tipi di vettori di clonaggio
VETTORE
OSPITE
Plasmide
batteri, lieviti
Batteriofago
batteri
Cosmidi
batteri
TIPO DI
GRANDEZZA
CLONAGGIO
INSERTO
genomico,
cDNA
genomico,
cDNA
fino a 15kb
genomico
fino a 45 kb
fino a 20 kb
BACs
batteri
genomico
da 100 a 300 kb
YACs
Lieviti
genomico
da 100 a
2000kb
genomi
dal genoma alla cDNA library
dal DNA al fenotipo
la doppia elica da e riceve
informazioni
l’informazione genetica
non procede a senso
unico dal genoma verso
il nucleo - citoplasma matrice - e ambiente,
è vero anche il contrario
perchè il genoma deve
essere pronto a ricevere
messaggi dall’ambiente
in cui si trova le cellula:
questa è la regolazione