Linfociti T

Corso di Immunologia
A.A. 2009-10
Linfociti T citotossici nella risposta
cellulo mediata
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La risposta citotossica (1)
Le
risposte citotossiche rappresentano uno dei
meccanismi difensivi effettori che l'organismo mette in
atto per difendersi dalle infezioni o dalla comparsa di
cellule trasformate. Tali meccanismi possono essere
distinti temporalmente in due fasi:
-
fase rapida, inducibile, ampiamente antigene-non
specifica, ed una
-
fase tardiva, T dipendente, antigene specifica, che
porta alla memoria immunologica.
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La risposta citotossica (2)
Quindi la risposta immune di tipo citotossico é responsabile
della eliminazione di cellule infettate da virus, di cellule
che hanno subito una trasformazione neoplastica e di
tessuti trapiantati. In questa lezione (risposta immune
citotossica-antigene specifica) parleremo dei linfociti T
CD8+, che hanno la capacità di riconoscere con il TCR
peptidi non-self associati alle molecole di classe I del
MHC e di subire una espansione clonale che porterà alla
maturazione di cellule effettrici con attività citotossica e
marginalmente del meccanismo di azione delle cellule
NK.
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Risposta antigene specifica (1)
Nella risposta immune citotossica-antigene specifica si
possono distinguere due fasi:
-
una fase induttiva o afferente
-
una fase di espressione o efferente.
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Risposta antigene specifica (2)
Nella prima fase avviene l'attivazione e proliferazione dei
linfociti che svolgeranno la funzione effettrice. Il
processo di attivazione e differenziamento dei linfociti T
effettori e` spesso aiutato dai linfociti T helper che
favoriscono la differenziazione dei linfociti T citotossici
mediante la produzione di IL-2 e di altri fattori
differenziativi antigene non specifici, quali inteferone
gamma ed altre citochine. I cloni T citotossici sono
fortemente IL-2 dipendenti, tanto che sono state isolate
alcune linee tumorali citotossiche, denominate IL-2
dipendenti, che necessitano per la loro crescita di IL-2.
Questa caratteristica é stata sfruttata per dosare IL-2
prodotta in vitro in altri sistemi (CTLL-2).
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Cytolytic T (Tc) Cells
• Tc exiting the thymus are pre-Tc cells,
i.e. have TCR that can recognize
antigen, but are not mature and cannot
kill until “armed”
• To become armed requires two signals:
1. Recognition by TCR of specific antigen
associated with class I MHC, and
2. Exposure to cytokines (IL-2 and IFN-γ)
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Mechanism of Arming Tc Cells
Class I
MHC
1. Cell expressing class I MHC
presents antigen ( )
to a pre-Tc cell
3. Th cell
makes cytokines
Pre-Tc cell
IFN
IL-2
2. Antigen-presenting
cell presents antigen in
association with
class II MHC to Th cell
T helper cell
Class II MHC
APC
4. Pre-Tc cell
differentiates to
functional Tc cell
Tc cell
5. Tc recognizes antigen on
class I MHC-expressing target cell
6. Target cell
is killed
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Risposta antigene specifica (3)
La fase effettrice della attività citotossica mediata dai
linfociti T (Tc) che ha come risultato la distruzione della
cellula bersaglio può essere suddivisa in 5 momenti
fondamentali:
- adesione;
- alterazione della membrana ("lethal hit" o colpo fatale)
- frammentazione prelitica del DNA (apoptosi);
- lisi della cellula bersaglio;
- riciclo del linfocita citotossico per iniziare una nuova
interazione litica.
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Steps in Tc Killing
Tc cell
Tc cell
Tc cell
Target cell
Target cell
1. Tc recognizes antigen on
target cell
2. A lethal hit is delivered by
the Tc using agents such as
perforin or granzyme B
Target cell
Target cell
3. The Tc detaches
from the target cell
4. Target cell dies
by apoptosis
. Step 1 also requires interaction of specific molecules on the CTL
cell (e.g. CD8) with their specific ligands on the target cell.
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Adesione (1)
La superficie cellulare del Tc e quella della cellula
bersaglio (che deve esprimere sulla sua superficie la
stessa associazione MHC classe I + epitopo
responsabile dell' attivazione del Tc) tenderebbero a
non avvicinarsi per la presenza di forze elettrostatiche
di repulsione. Tuttavia, la presenza di ioni Mg2+ vince
tali forze permettendo un primo contatto tra la
superfice della cellula bersaglio (cellula target, TC) ed
il linfocita Tc via l'interazione LFA-1-ICAM-1. Tale
interazione favorisce anche il riconoscimento dell'
antigene da parte del complesso TCR-CD3 del Tc. In
assenza di riconoscimento il Tc si stacca dalla TC, se,
invece é avvenuto il riconoscimento, il CD3 trasmette
alla molecola LFA-1 un segnale di attivazione.
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Adesione (2)
La molecola LFA-1 così attivata rafforza l'avidità del
legame con il suo ligando, rafforzando di
conseguenza anche il legame delle cellule Tc-TC. In
tale interazione partecipano anche altri legami quali il
CD8-MHC classe I e CD2-LFA3. Le molecole di
membrana dei Tc, così attivate, mediano un aumento
degli ioni Ca2+ sia mobilizzati dai depositi intracellulari
che trasportati attraverso la membrana e trasferiscono
l'informazione
al
citoscheletro.
I
centri
di
organizzazione dei microtubuli (MTOC) si orientano
verso i punti di contatto con la cellula bersaglio grazie
anche all' aumentata concentrazione di Ca2+.
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Adesione (3)
Il MTOC e` associato con l'apparato del Golgi che a sua
volta viene coinvolto nella secrezione orientata di
proteine ed altri componenti di membrana nella zona
di contatto in maniera tale da determinare un
processo di esocitosi polare. Infatti i granuli
citoplasmatici che sono abbondanti nelle cellule
citotossiche migrano verso la cellula bersaglio e
riversano all'esterno il loro contenuto. L'adesione
cellulare e` l'evento piu` importante della citossicita'
mediata dal colpo fatale (lethal hit) che determina
depolarizzazione del potenziale di membrana e la
formazione di canali nella membrana della cellula
bersaglio.
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Alterazione della membrana, apoptosi e lisi
L'alterazione della membrana e` la seconda tappa del processo
di lisi: infatti, in pochi secondi dal contatto, la membrana della
cellula bersaglio forse grazie alla disposizione polare dei ligandi
che sono venuti a contatto con il Tc, diviene permeabile a tutta
una serie di elettroliti tra cui un ruolo importante é mediato dal
Ca++. Tale ione infatti sembra stimolare i fenomeni di
degradazione
endocellulari
mediando
l'attivazione
di
endonucleasi, ATPasi e proteasi che portano alla
frammentazione
prelitica
del
DNA
partendo
dalla
condensazione della cromatina ed alla digestione del
citoscheletro. Inoltre, il cambiamento del gradiente osmotico
favorisce l'entrata di acqua e macromolecole nella cellula
bersaglio. La cellula si rigonfia fino alla sua conseguente
rottura, tappa finale della lisi cellulare che avviene in assenza
della cellula citotossica
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Granuli
I granuli isolati dalle cellule ad attività citotossica, hanno la
capacità di lisare, in maniera fortemente Ca-dipendente, cellule
nucleate ed eritrociti. Tale caratteristica é legata alla presenza
nel loro interno di proteine citolitiche chiamate perforine o
citolisine per la formazione di canali/pori nella membrana
cellulare, di proteasi della famiglia delle serina-esterasi
(granzymes A-F) e di proteoglicani. L' attività citolitica delle
perforine é legata alla proprietà di legarsi in maniera Cadipendente ai fosfolipidi e per la loro composizione ed il loro
meccanismo d'azione queste proteine ricordano molto i fattori
del complemento C6, C7, C8 e C9 che si legano alla
membrana cellulare.
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Mechanism of Tc Killing
Tc cell
Perforin
Ca++
polymerizes
Perforin
monomers
Tc cell
Granzymes
Polyperforin channels
Target cell
Target cell
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Perforine (1)
Le perforine hanno il 20-30 % di omologia di sequenza con
il componente C9 del complesso complementare. Le
perforine sono formate da una singola catena proteica di
70kD, che inserendosi nella membrana delle cellule
bersaglio crea quelle alterazioni morfologiche che sono
state notate quando una cellula citotossica ed i suoi
granuli vengono a contatto con essa. La molecola
contiene due domini ricchi in cisteina uno dei quali
sembra coinvolto nel legame con il Ca2+ ed un dominio
formato da una a elica anfipatica. Utilizzando perforine
purificate e` stato possibile studiare le modalità di
formazione dei pori.
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Perforine (2)
In seguito al legame con i fosfolipidi di membrana, le
perforine subiscono un cambiamento conformazionale
che evidenzia il dominio anfipatico. Tale cambiamento
favorisce l'inserzione delle perforine nel doppio strato
lipidico e la polimerizzazione che porta alla
formazione di pori trans-membrana. Tali pori sono
delle strutture cilindriche di 2-18 nm che crescono in
diametro con l'aggiunta di piu` monomeri di perforine.
Minimo 3-4 monomeri sono necessari alla formazione
di un poro funzionale. Gli ioni Ca2+ sono necessari sia
al legame delle perforine alla cellula bersaglio che alla
loro polimerizzazione.
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Granzymes
I "granzymes" sono delle proteasi simili a quelle contenute
nei granuli dei mastociti ed alle catepsine, proteasi
contenute nei granuli dei neutrofili. Per quanto non siano
noti né i substrati né le funzioni di tali proteasi, tali
molecole potrebbero contribuire alla citotossicità mediata
dalle perforine. Infine i proteoglicani si legano sia alle
perforine che ai "granzymes" e probabilmente favoriscono
sia la secrezione di questi enzimi che la protezione delle
cellule citotossiche dalla autolisi. Dopo l' interazione tra Tc
e cellula bersaglio, i granuli si avvicinano alla membrana
del Tc e riversano nell' ambiente esterno il loro contenuto
con un processo di esocitosi e tale fenomeno corrisponde
"al colpo fatale".
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Azione delle perforine
Non e` stato definitivamente stabilito se l'azione delle
perforine sia necessario al fenomeno del “killing” anche se
e` chiaro che non e` sufficiente. Parecchi ricercatori hanno
riportato che il "killing" cellulare avviene anche in assenza
di ioni Calcio e di serina esterasi. Dal momento che il
calcio e` necessario alla esocitosi e la serina esterasi e`
un marker enzimatico dei granuli, questi esperimenti
suggeriscono che la degranulazione non è una tappa
essenziale al "killing". Recentemente e` stato notato un
"killing" perforine- indipendente mediato da una
citotossina di 50kD purificata dai linfociti T citotossici
chiamata leucalessina molto simile ad altre due citochine
ad attivita` citotossica, TNF e LT
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Natural Killer (NK) Cells
• Derived from bone marrow
• Lack most markers for T and B cells (do not
have TCR)
• Do not undergo thymic maturation
• Express CD56, a specific NK marker
• Express a low affinity receptor for Fc portion
of IgG, called FcRIII (CD16), also expressed
on granulocytes and macrophages
• Cytokines, especially IL-2, promote
differentiation into lymphokine-activated killer
(LAK) cells
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NK Cell Effector Mechanisms (1)
• Mechanism of killing similar to those of Tc cells
• Not MHC-restricted
• Kill a variety of virus-infected cells and tumor cells,
but not all. Susceptibility to killing by NK cells is
inversely correlated to expression of class I MHC.
Killer inhibitory receptors (KIRs) on human NK
cells that recognize class I MHC prevent killing.
Some virally-infected cells and tumors downregulate the expression of class I MHC and they
can be killed by NK cells. Because such class I
MHC-deficient cells might escape being killed by
cytotoxic T cells, NK cells afford another type of
protection to the host
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NK Effector Mechanisms (2)
• IgG-coated target cells recognized by FcRIII
(CD16) are killed by antibody-dependent cellmediated cytotoxicity (ADCC)
• LAK kill broader range of cells - including some
normal cells - than NK cells
• LAK cells predominate in lesions in graft-vshost disease in recipients of bone marrow
transplants
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TNF, LT e leucalessina
TNF é prodotto principalmente dai macrofagi, anche se e`
stato isolato da linfociti e cellule NK; le linfotossine (LT)
sono state purificate da linfociti stimolati da antigeni e
mitogeni. Sia TNF che LT sono stati clonati e sequenziati e
sono omologhi con una identita` di sequenza del 36%;
legano lo stesso recettore e LT viene anche chiamata TNF
beta. La leucalessina differisce da TNF e LT per le sue
caratteristiche biochimiche, e` presente sia nei granuli che
nel citosol dei Tc. TNF, LT e leucalessina provocano oltre
alla lisi osmotica anche fenomeni di frammentazione del
DNA.
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Contatto TC-target
Il contatto Tc-target e` reversibile permettendo al Tc di
attaccare altri target (ovviamente con la stesso
specificita` e restrizione). La terza tappa che
consiste nella lisi cellulare e` indipendente dalla
presenza dei Tc. La lisi richiede molto tempo: in
vitro almeno 1 ora, mentre le due tappe precedenti
solo 10 minuti.
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Resistenza alle perforine (1)
Uno dei quesiti fino ad oggi non risolto e`come le
cellule citotossiche evitano la propria lisi. L'ipotesi
piu` accreditata per spiegare la resistenza alle
perforine si riferisce alla presenza sulla membrana
cellulare del Tc di una proteina, la protettina, che
interagendo con le perforine impedisce la
formazione dei pori. Ma e` ancora molto poco
conosciuto il fenomeno della resistenza agli altri
meccanismi di lisi indipendenti dalle perforine.
Molto probabilmente, vi sono diversi meccanismi di
protezione quanti sono quelli di lisi.
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Resistenza alle perforine (2)
Recentemente é stato proposto un nuovo modello per
spiegare sia il rilascio delle molecole citotossiche dai
granuli che la protezione dall' autolisi. P. Peters e
collaboratori in seguito alla osservazione al
microscopio elettronico della struttura dei granuli in cui
si possono distinguere una parte centrale elettrodensa
e piccole vescicole formate dalla membrana esterna
cellulare su cui sono presenti sia il TCR-CD3 che altre
molecole di adesione, suggeriscono che i mediatori
della citotossicità non vengono rilasciati nello spazio di
interazione Tc- cellula bersaglio in forma solubile, ma
avvolti da una membrana cellulare.
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Risposta citotossica non-MHC ristretta (1)
Oltre ai linfociti T citotossici antigene specifici ed MHC
ristretti, vi sono altri linfociti T che mediano una
risposta citotossica non MHC ristretta simile a
quella delle cellule NK: una popolazione di cellule
CD3+ presente nel periferico che può mediare l' attività
citotossica in seguito all'azione delle linfochine (LAK).
Le cellule con citotossicità linfochine dipendente sono
state messe in evidenza nel 1981 studiando i fenomeni
di citotossicità, diretti verso cellule tumorali fresche,
indotti da fattori di crescita dei linfociti. Tale induzione é
stata successivamente confermata attivando in vitro
linfociti con IL-2 ricombinante (rIL-2) e le cellule
responsabili sono state chiamate LAK.
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Risposta citotossica non-MHC ristretta (2)
Le cellule LAK negli ultimi anni sono state molto studiate alla
luce di un possibile impiego nella terapia dei tumori. Infatti
cellule mononucleate del sangue periferico di portatori di
tumore vengono attivate in vitro con alte dosi di rIL-2 e
reintrodotte nel paziente con l' intento di limitare il numero di
metastasi tumorali. Recentemente é stato visto che la
maggior parte delle cellule isolate dal periferico, dalla milza
o dal midollo con attività LAK, é rappresentata da cellule
CD3- con fenotipo NKH1/Leu 19+ anche se cellule CD3+,
NKH1/Leu 19+ contribuiscono alla attività LAK. Tra le
citochine che esercitano un importante ruolo nella
amplificazione dei linfociti T, ricordiamo l' IL-4, già usata in
clinica in associazione con IL-2, IL-7, IL-6, IL-1 e TNF.
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Test citotossicità
Per valutare la citotossicita` si usa
il test della produzione di
perforina e granzima. In
questo test, le cellule Tc
previamente attivate vengono
sottoposte
a
marcatura
citofluorimetrica
intracitoplasmatica con mAb
diretti
contro
le
suddette
molecole ad attività citotossica.
La percentuale
di
cellule
positive alla marcatura é indice
della loro attività citotossica.
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Reazione mista linfocitaria (1)
La reazione citotossica contro i prodotti di MHC allogenici e` alla
base del rigetto dei trapianti e la sua intensita` puo` essere
valutata in vitro nella reazione mista linfocitaria. Coltivando
insieme linfociti allogenici (A e B), queste cellule si stimolano
a vicenda dando origine ad una reazione mista bidirezionale,
con lo sviluppo di linfociti T citotossici A diretti verso B e
linfociti T citotossici B diretti verso A. Se una popolazione
cellulare viene irradiata o bloccata con Mitomicina C si avra`
ovviamente una reazione mista monodirezionale. Le cellule
che si attivano e proliferano nella reazione mista linfocitaria
sono sia i linfociti T helper che i linfociti Tc, e le linfochine
prodotte da entrambe le popolazioni favoriscono la
successiva differenziazione funzionale dei linfociti T
citotossici.
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Reazione mista linfocitaria (2)
Gli antigeni responsabili di tale attivazione sono chiamati
alloantigeni e la risposta immune, allorisposta, il
fenomeno, alloreattività e le cellule , alloreattive.
Per molti anni gli immunologi hanno tentato di spiegare
l'alto numero di cloni alloreattivi presenti nel circolo
periferico in assenza di allo-stimolazione, frequenza
simile a quella di cloni T presenti dopo una
stimolazione antigenica.
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Reazione mista linfocitaria (3)
Sono state fatte diverse ipotesi e solo recentemente grazie
alle moderne acquisizioni sulla presentazione e
riconoscimento antigenico é stato possibile analizzare
più in dettaglio l'alloreattività. Sembra sempre più
probabile che l'alloreattività non sia un fenomeno
univoco ma dipendente da diversi fattori quali:
i)
il tipo di molecola MHC
stimolatrice e rispondente
presente
sulla
cellula
ii)
il peptide endogeno capace di associarsi alle molecole
MHC della cellula stimolatrice che viene visto in maniera
ristretta dalla cellula rispondente
iii) particolari sequenze della molecola MHC-allo che
favoriscono un riconoscimento diretto da parte del
recettore antigenico.
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