Clonazione cellule staminali

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APPLICAZIONI DELLE
BIOTECNOLOGIE
Prof. Elisa Prearo
LST 2007/2008
Biotecnologie: definizione
• Per biotecnologia si
intende l’insieme dei
prodotti industriali che si
ottengono per mezzo di
processi in cui sono
coinvolti organismi o
sistemi biologici
• Utilizza le tecniche del
DNA ricombinante
Perche’
• Produzione di
proteine utili
–
–
–
–
Insulina
Somatostatina
Rennina
Cellulasi
• Produzione di vaccini per
le malattie virali
Trasferimento di geni tra cellule
eucariote
• Lo scopo è quello di sostituire dei geni “cattivi” con i
geni “buoni” oppure per migliorare le “prestazioni” di
una specie
• Complesso: devono essere incorporati nei cromosomi,
introdotti in molte cellule, regolati
• Esperimenti riusciti con i topi: il gene della β-globina
di coniglio
• Introdotta nelle uova con un plasmide è stata
inglobata nel genoma al posto giusto ed espressa, topo
con la βglobina di coniglio e trasmessa con
distribuzione mendeliana
Applicazioni delle biotecnologie
 Clonazione
 OGM
 Cellule staminali
 Terapia genica
 Bioremediation
Clonazione
 La clonazione in senso stretto è una tecnica che permette di
riprodurre identicamente un frammento di DNA utilizzando la
cellula batterica.
 Se si parla di organismi eucarioti pluricellulari è’ una tecnica in
cui il nucleo proveniente dalla cellula di un donatore viene
trapiantato in una cellula uovo ospite , viene fatta normalmente
sviluppare fino allo stadio adulto in modo da ottenere la
generazione di soggetti a corredo genetico identico.
 Ottenere una serie di individui adulti 2n senza la fusione di due
gameti.
– Vegetali: si parte da una cellula del corpo della pianta
– Animali: si opera su embrioni molto precoci: splitting
Lo Splitting
•In genere lo fanno alcuni allevatori per ottenere più esemplari
di bestiame pregiato
•Suddividere un embrione molto precoce (che non abbia più di
otto cellule) in due, quattro o otto cellule e ottenere altrettanti
embrioni geneticamente uguali fra loro.
•i singoli embrioni, dopo essere stati suddivisi, vengono poi
inseriti nell'utero di madri che porteranno a termine la
gravidanza
Cloni a scopo di ricerca
Cloni ad alto valore commerciale
Cloni di specie a rischio
Cloni produttori di proteine umane
Cloni per xenotrapianti
Esperimento di Gurdon che
dimostra come ciascuna
cellula somatica di un
organismo contenga tutti i
geni per codificare l’intero
organismo
Dolly
• La pecora Dolly (5 luglio 1996 - 14 febbraio 2003) è il primo
mammifero ad essere stato clonato con successo da una cellula
adulta. E’ stata creata al Roslin Institute in Scozia (Edinburgo)
da Ian Wilmut, dove ha vissuto fino alla morte. Gli scienziati
annunciarono la sua nascita solo l'anno successivo (22 febbraio
1997).
• La tecnica usata è un trasferimento nucleare in cellule
somatiche. I nuclei di cellule non riproduttive del donatore sono
state trasferite in cellule embrionali denucleate e quindi indotte
ad avviare lo sviluppo del feto. Quando Dolly è stata clonata, è
diventata il centro di una controversia che continua ancora oggi.
• Il 9 aprile 2003 i suoi resti impagliati sono stati posti al Royal
Museum di Edinburgo, che fa parte del National Museum di
Scozia.
 Keith Campbell: fu questo biotecnico (oggi passato
all’università di Nottingham) ad avere l’idea di coordinare il
ciclo vitale delle cellule riceventi e private del nucleo con
quello delle cellule donatrici, il cui materiale genetico era
destinato ad essere clonato.
 prima di ottenere un embrione vitale (Dolly appunto) sono
andati male ben 430 tentativi: cosa da segnalare, visto che il
gruppo di Wilmut ha dichiarato apertamente di voler
arrivare alla clonazione di un essere umano.
 Dolly ha poi dovuto essere liquidata per «eutanasia», dato
che presentava gravi disturbi, fra cui l’invecchiamento
precoce.
 Questo perché la cellula somatica denucleata proveniva
da un’esemplare dell’età di 6 anni. Paradossalmente il
patrimonio genetico di Dolly, alla nascita, era già vecchio di
6 anni.
K. H. S. Campbell e I. Wilmut, hanno concluso un esperimento
ancora più delicato, ottenendo due pecore identiche che,
all'età di sette mesi, nel marzo del '96 sono finite sui giornali
di mezzo mondo: Megan e Morgan, due esemplari identici
come gemelli monovulari.
OGM
Cosa sono gli OGM
La sigla OGM significa organismi geneticamente
modificati. Gli organismi possono essere
modificati geneticamente attraverso metodi
“classici” da sempre usati nelle pratiche
agricole quali:
 Reincrocio ricorrente per ottenere individui
con caratteristiche di interesse
 Mutagenesi
 Ibridazione tra specie diverse
TRASFORMAZIONE
Un plasmide contenente DNA esogeno può
essere usato per infettare una cellula
batterica o eucariotica.
Questa cellula può integrare il DNA
esogeno con il DNA nucleare e venire
quindi
TRASFORMATA
PLASMIDE TI
di
Agrobacterium
tumefaciens
Tumor Inductor
Lungo circa 200 kb Esso
contiene una regione
trasformante detta T-DNA
che può essere excisa e
trasferita. Essa è lunga 30
Kb
La cellula vegetale integra la T-DNA e acquista tutti i
geni che essa contiene. Nella regione T-DNA è possibile
inserire un frammento di DNA esogeno.
Si introduce un gene di interesse nel plasmide TI
( nella T-DNA )
Si incubano batteri A.tumefaciens con il plasmide Ti
modificato
Si infettano cellule vegetali con il batterio
A.tumefaciens
Perchè gli OGM
 La popolazione mondiale aumenta, mentre la terra
coltivabile diminuisce a causa delle crescenti siccità,
salinità, urbanizzazione.
 Dopo il 2030 si ipotizza che tutta la superficie
coltivabile non sarà più in grado di produrre
sufficiente cibo
 Ogni terreno coltivabile dovrà produrre il doppio di
oggi, nel rispetto dell’ambiente e con minor ausilio
della chimica (insetticidi, diserbanti, fungicidi,
fertilizzanti, fitofarmaci).
 Gli OGM non sono la soluzione definitiva ma sono
essenziali per affrontare il problema
Le coltivazioni GM più diffuse
• Mais
•
•
•
•
•
•
•
Soia
Colza
Pomodori
Cotone
Riso
Tabacco
Patate
Pomodoro transgenico
arricchito in β -carotene
Pomodoro
“selvatico”
Alcune caratteristiche
 Attività insetticida
 Resistenza a erbicidi
 Tolleranza a stress ambientali
 Vita più lunga o maturazione ritardata
 Migliori qualità nutrizionali
(nutraceutics)
 Allungamento dei tempi di conservazione
Interventi sull’ambiente
Indiretti
Miglior utilizzazione dei suoli
Riduzione impatto ambientale
Diretti
Disinquinamento suoli e acque (Arabidopsis
thaliana )
Riforestazione
Protezione specie a rischio
Lotta biotecnologica insetticida
contro i parassiti
Il mais brevettato dalla Novartis contiene un gene del
Bacillus thuringiensis (Bt) che produce la proteina (Cry
Protein) che cristallizza nell’intestino delle larve di piralide
provocandone la morte, ma innocua per l’uomo e per molti
insetti utili.
Esistono diversi "geni Bt" in grado di sintetizzare diverse
proteine insetticide e con diversi meccanismi di azione
legati al diverso gene promotore responsabile della
produzione della proteina insetticida. Ci sono quattro
diversi "eventi" Bt ad uso commerciale:
176 - denominato Knockout da Novartis Seeds e
NatureGard da Mycogen Seeds (espresso solo nei tessuti
verdi e nel polline)
Bt 11 - denominato Yieldgard da NK Novartis Seeds
Mon 810 - denominato Yieldgard da Monsanto (non
contiene marcatori)
DBT 418 - denominato Bt-Xtra da Dekalb.
Non tutti i geni Bt sono uguali ma differiscono per
modalita' di espressione e livello di protezione della pianta.
Grafico 1: produzione (q.li/ha al
15.5 % umidita') dei migliori ibridi
Bt a confronto con i migliori ibridi
"normali" nelle localita' di Lonigo
(VI) e Ceregnano (RO)
Grafico 2: Valutazione visiva dei
sintomi dell'attacco di piralide alla
spiga e numero e lunghezza delle
gallerie (cm) per i diversi eventi in
prova (176, Mon 810 e Bt11 (5=
massima gravita' dell'attacco; 0=
assenza dei sintomi).
Vantaggi del mais Bt
 aumento delle rese mediamente
quantificabili nell'ordine del 10 %
 una maggiore "stabilita’" e stay green
della pianta in campo
 una minore incidenza di malattie
fungine alla spiga.
Rischi ecologici
esiste il pericolo di selezionare
piralidi resistenti o quantomeno piu’
tolleranti alle proteine Bt prodotte
dalla pianta
Soluzione
creazione di "zone rifugio" di mais
normale nello stesso appezzamento o in
campi adiacenti al mais Bt, in cui la
piralide puo' liberamente incrociarsi .
 Farfalla monarca: il
20% in meno delle larve
esposte al polline di mais
Bt raggiunge l'età adulta.
 Se si usano i pesticidi,
una percentuale molto
maggiore di larve di
farfalla monarca non
raggiunge l’età adulta; ma
non solo farfalle, anche
molte altre specie di
insetti vengono sterminate
Migliori qualità nutrizionali:
Golden Rice
basmati
japonica
 Il riso è l’unica fonte di cibo per molte popolazioni,
soprattutto asiatiche, ma manca della provitamina A (β carotene)
 La sua carenza porta a cecità e immunodeficienze
 Sono stati introdotti geni in modo che venga espresso il
β -carotene nell’endosperma dei semi.
 Vantaggi: la provitamina A è espressa nel riso quindi
anche alimentandosi di solo riso si garantisce l’apporto di ßcarotene nella dieta
 Obiezioni: la quantità di β -carotene è comunque poca.
Facendo affidamento solo sul Golden Rice,
un adulto dovrebbe mangiare almeno 9 Kg di
riso cotto, per soddisfare il bisogno
quotidiano di β -carotene. In altre parole,
consumare quotidianamente 300 grammi di
riso coprirebbe solo l'8% della richiesta
fisiologica giornaliera di β -carotene. Una
donna in allattamento dovrebbe mangiare
addirittura 16 Kg di riso cotto al giorno!
Vantaggi per l’ambiente
La coltivazione del
cotone Bt negli USA (1
milione di ettari)
consente di ridurre l’uso
di pesticidi di 450
tonnellate all’anno
Rischi per la salute
• Possibilità di sviluppare allergie se i geni trasposti
provengono da un alimento “allergizzante” (soia più
ricca di metionina con un gene proveniente dalla noce
brasiliana) o da organismi non abitualmente consumati
(petunie, Golden Rice)
• Resistenza agli antibiotici se viene introdotto un gene
di resistenza ad un antibiotico come "marcatore“.
Permette di identificare le cellule in cui è riuscito il
"trapianto" dei geni e successivamente non svolge più
alcuna funzione.
Soja
Noce brasiliana
Trasferimento geni
RISCHIO ALLERGIE
Risposte
• La ricerca può sostituire il gene allergizzante con
quello presente in un’altra specie non allergizzante,
inoltre è stata sviluppata una soia priva di una
proteina che provoca allergie
• I microbiologi ritengono che sia improbabile il
trasferimento della resistenza; inoltre sono state
sviluppate nuove tecnologie di selezione delle piante
transgeniche che non comportano l’impiego di
marcatori con resistenza agli antibiotici. Dal 2004,
secondo la vigente legislazione europea, nei Paesi
aderenti all’UE non possono essere coltivate piante
OGM recanti geni di resistenza ad antibiotici come
marcatori.
Brevetti…..
•
•
Con “brevetto biotecnologico” si intende la
protezione commerciale per lo sfruttamento
esclusivo sia di un ogm che dei suoi discendenti, ma
anche delle tecniche usate per ottenerlo e
riprodurlo nonché dei geni utilizzati per ottenere il
nuovo organismo
Attualmente sono tre i tipi di “bioinvenzione” che
devono essere esclusi dalla brevettabilità:
1. IL CORPO UMANO E I SUOI ELEMENTI
2. MANIPOLAZIONE DEL GENE UMANO A FINI NON
TERAPEUTICI
3. PROCEDIMENTI DI MODIFICAZIONE DELL'IDENTITÀ'
GENETICA DEGLI ANIMALI
….e legislazione
• Normativa internazionale:
– la Convenzione di Rio sulla tutela della biodiversità
– Protocollo sulla biosicurezza
• Normativa europea:
– l’applicazione del Principio di precauzione
– prevede verifiche e controlli più accurati rispetto agli altri
alimenti su due livelli: europeo e del singolo paese
appartenente all’UE
– devono avere le stesse caratteristiche nutrizionali dei
tradizionali
– Test di allergenicità
– etichettatura
• Normativa italiana:
– Gli Ogm devono essere controllati dal Ministero della Sanità
– Vige il divieto di coltivare transgenico
– Legislazione regionale “OGM-free”
• Batteri, piante, nuove razze di animali ottenuti
con l’ingegneria genetica possono venire
brevettati... tuttavia, è etico brevettare
organismi viventi?
• Il dibattito non è ancora concluso. C’è la
possibilità di brevettare nuove forme di vita o
loro parti.
• In questo modo, gli istituti e le industrie che,
dopo aver speso cifre considerevoli per la
ricerca, riescono a creare OGM, possono
garantirsene in esclusiva la proprietà e lo
sfruttamento economico dell’invenzione (perché
di invenzione si tratta) almeno per un certo
numero di anni.
• Dopo tale termine, l'invenzione
diviene di pubblico dominio e
chiunque altro può farne uso. Tale
possibilità certamente incoraggia la
sperimentazione e per conseguenza
aiuta la scienza a progredire.
• La vita, di per sé, non può essere brevettata;
invece possono venire brevettate le modifiche
effettuate con l’ingegneria genetica sulle
cellule viventi. Purché tali modifiche
rappresentino un’invenzione con
caratteristiche di novità e con possibilità di
utilizzazione produttiva.
• Dunque, un gene, o meglio, una particolare
sequenza di acidi nucleici in esso compresa,
possono essere brevettati solo se l’inventore
non ha semplicemente scoperto quanto avviene
in natura, ma ha saputo isolare e riprodurre la
struttura e la funzione delle sequenze di acidi
nucleici necessari allo sviluppo di nuovi
processi o prodotti.
Brevetti agro-biotech
Università e centri di ricerca USA
20.5%
19.2
9.3
7.8
5.9
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