ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti biologici

ORGANISMI MODELLO
Anno Accademico 2015-2016
Attività a scelta: 4 cfu
Orario lezioni: lunedì e mercoledì ore 14,00-16,00
Aula G2B
Proff. P. Malaspina, C. Gargioli, G. Cestra
ORGANISMI MODELLO
ORGANISMI MODELLO
• Gli organismi modello sono utilizzati dall’inizio della genetica per studiare
tutti i processi biologici fondamentali della cellula e degli organismi
• Presupposto: i meccanismi molecolari di base sono estremamente
conservati nel corso dell’evoluzione
• La genomica comparata permette di conoscere le relazioni tra i diversi
organismi e la possibilità di estrapolare i processi biologici degli organismi
modello ad altri organismi
• Possono essere studiati tal quali o essere modificati geneticamente per
studiare l’effetto fenotipo di una mutazione
• Attualmente possono essere utilizzati per la scienza di base e per la ricerca
applicata (produzione molecole utili o sperimentazione di terapia genica o
terapia farmacologica)
ORGANISMI MODELLO nell’era pre-genomica
Pisum sativum - Ereditarietà dei caratteri;
geni e alleli; nascita della genetica
Neurospora – Segregazione dei cromosomi durante
mitosi e meiosi; analisi della ricombinazione
Drosophila – Teoria cromosomica dell’ereditarietà;
struttura dei cromosomi (cromosomi salivari politenici);
mappatura cromosomi attraverso ricombinazione
ORGANISMI MODELLO nell’era pre-genomica
E. coli – Mappatura dei geni; decifrazione del
codice genetico; processi di trascrizione e
traduzione. Regolazione genica
Zea mays – Genoma dinamico: gli elementi trasponibili
ORGANISMI MODELLO nell’era pre-genomica
Il genoma dinamico: gli elementi trasponibili nel mais
1940: la scoperta di Barbara McClintock premio Nobel per la Medicina nel 1983
Espressi gli alleli recessivi
Ds nel gene C (inattivato)
Pigmentazione normale viola delle cariossidi
(antociani). Ceppo di mais con cariossidi a
fenotipo variegato.
Analisi citogenetiche: cromosoma 9 con
elevata frequenza di rottura se presenta Ds
Ds (dissociazione): elemento trasponibile che
favorisce la rottura del cromosoma 9;
Ac (attivatore): attiva la rottura
Rimozione di Ds ad opera di Ac
1940: la scoperta di Barbara McClintock premio Nobel per la Medicina nel 1983
c-m (Ds)= gene c mutato da Ds
Se non è presente Ac, Ds non si muove:
colore assente uniforme
Se è presente Ac, Ds si può muovere: alcune
cariossidi con colore a macchie
Raro: Se Ac è presente nel gene C il sistema è
sempre instabile e tutte le cariossidi a macchie
Fenotipi prodotti dagli elementi trasponibili nelle cariossidi
ORGANISMI MODELLO nell’era pre-genomica
Il genoma dinamico: gli elementi trasponibili nei procarioti
I trasposoni presenti in tutti gli
organismi ma differiscono nelle
diverse specie.
Numerosi IS, diversa dimensione
Producono mutazioni ( delezioni o
inversioni)
Composto: IS10 = IS contiene gene
trasposasi, solo uno è attivo.
Semplice: IR,Trasposasi + revolvasi
(ricombinazione)
ORGANISMI MODELLO nell’era pre-genomica
Il genoma dinamico: gli elementi trasponibili negli eucarioti
- Classe dei retrotrasposoni
- Classe dei trasposoni a DNA
- Retrotrasposoni in lievito e Drosophila
meccanismo retrovirale per inserzione in
nuovo locus
ORGANISMI MODELLO nell’era pre-genomica
Il genoma dinamico: gli elementi trasponibili nella specie umana
Esempio della presenza di elementi trasponibili negli introni di un gene umano
(selezione negativa per presenza in esoni). La maggior parte ha perso capacità di
trasporsi per meccanismi ospite (es RNAi che silenziano trasposasi).
ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti
biologici
Embriologia e sviluppo animale: anfibi (rana, tritone, rospo Xenopus);
riccio di mare; pollo
Elettrofisiologia e neurobiologia: molluschi (calamaro e aplysia)
Neurobiologia e sviluppo animale: nematode Caenorhabditis elegans
ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti
biologici
I primi studi sullo sviluppo embrionale: manipolazione fisica di
embrioni, cellule e tessuti
La scoperta degli organizzatori embrionali negli animali
Anfibio
Labbro dorsale del
blastoporo embrione
Trapianto in ectoderma
ventrale di un ricevente
Zona di sviluppo arto
Cellule blastoporo mantengono proprie
caratteristiche: formazione di un secondo asse
ventrale ed embrione completo
Doppia ZPA
Pulcino
Zona di Attività Polarizzante = ZPA
Il destino cellulare può essere modificato in tempi precoci. Cellule
dell’organizzatore producono “morfogeni” che inducono risposte nei
tessuti circostanti in modo dipendente dalla loro concentrazione
Ma che molecole sono i “morfogeni” ?
ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti
biologici
Mutanti di Drosophila e controllo genetico dello sviluppo
Calvin Bridges (1915) osservò un moscerino con
un fenotipo mutante con 2 coppie di ali e lo
soprannominò Bithorax
Antennapedia: zampe al posto delle antenne
Mutazioni omeotiche (simili): una parte del
corpo è trasformata in un’altra
ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti
biologici
Lo studio dello sviluppo embrionale attraverso l’approccio molecolare
La scoperta dei geni omeotici, i geni che regolano lo sviluppo tridimensionale
(antero-posteriore e dorso-ventrale) e temporale di tutto il regno animale
Drosophila: otto loci Hox che influenzano
identità dei segmenti e delle appendici
definendo l’intera struttura corporea.
Complessi Bithorax e Antennapedia sul terzo
cromosoma.
L’ordine dei geni corrisponde all’ordine delle
regioni in senso antero-posteriore
ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti
biologici
Le proteine codificate dagli 8 geni Hox hanno sequenze comuni tra
cui un omeodominio di 60 aa composto da 3 eliche. Le eliche 2 e 3
formano il motivo helix-turn-helix
Le proteine codificate dai geni Hox (fattori di trascrizione) si legano al DNA
ed esercitano il loro effetto controllando l’espressione dei geni per lo
sviluppo dei segmenti e delle appendici. Mutazioni in questi geni
producono lo sviluppo di una struttura in un segmento sbagliato
ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti
biologici
Geni Hox nel topo (nei mammiferi):
da un singolo cluster a quattro
Geni espressi in modo sequenziale
lungo l’asse antero-posteriore
I geni omeotici sono espressi in
modo parzialmente sovrapposto
ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti
biologici
L’ordine dei geni Hox è equivalente all’ordine delle parti del corpo in cui sono
espressi
ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti
biologici
Le proteine Hox di Drosophila e dei vertebrati mostrano notevoli
similarità
ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti
biologici
ZPA: cellule che producono la
proteina Sonic Hedgehog (Shh) il
“morfogeno” che diffonde e
determina un gradiente
controllando l’espressione dei geni
Hox D per lo sviluppo dell’arto,
Le cellule più vicine alla ZPA
formano dita più piccole nei
vertebrati (sia mani che piedi)
Trapianto di altra ZPA o
pallina rivestita con Shh o ac.
retinoico determina
attivazione geni Hox D e
sviluppo arto
Morfogeni: fattori di trascrizione o componenti di vie di segnalazione che agiscono
direttamente (sulle cellule adiacenti) o indirettamente (interazione con recettori
nucleari che si legano a promotori) sull’espressione genica (es: ac. Retinoico)
ORGANISMI MODELLO
Come scegliere un organismo modello?
Principali caratteristiche per essere un buon organismo modello
- Utilizzo economico
- Possibilità di allevarlo (o coltivarlo) in condizioni controllate di
laboratorio in poco spazio
- Ciclo di riproduzione rapido
- Progenie numerosa
- Sequenza del suo genoma nota
- Caratteristiche che permettano applicazioni di tecniche di biochimica,
genetica e biologia molecolare
ESEMPI DI ORGANISMI MODELLO
Procarioti unicellulari: E. coli
Eucarioti unicellulari: S. cerevisiae (lievito di birra)
Eucarioti multicellulare: N. crassa (muffa del pane)
Eucarioti: A. thaliana (pianta angiosperma)
Eucarioti: C. elegans (invertebrato, verme Nematode)
Drosophila melanogaster (invertebrato, insetto)
Danio rerio (vertebrato, pesce)
Xenopus (vertebrato, anfibio)
Gallus gallus (vertebrato, uccello)
Mus musculus e Rattus norvegicus (vertebrati, mammifero)
ORGANISMI MODELLO
Con la genomica comparata è possibile:
- conoscere le relazioni tra i diversi organismi e costruire alberi
filogenetici molecolari delle specie esistenti e capire quali
processi abbiano plasmato un genoma permettendogli di
evolvere
- identificare il DNA funzionale e quello non funzionale
- identificare le regioni genomiche fortemente conservate
IL SEQUENZIAMENTO DEI GENOMI
FILOGENESI SEMPLIFICATA DEGLI EUCARIOTI E DEI METAZOI
FILOGENESI SEMPLIFICATA DEI VERTEBRATI
Circa 800
milioni di anni fa
RICOSTRUZIONE DI UN ALBERO FILOGENETICO
Allineamento di 50 aa N- terminali di globine epsilon di 7 vertebrati
Matrice delle distanze. Es. uomo-scimpanzè 1/50aa, frazione = 0,02
Albero filogenetico
di tipo UPGMA
L’aumento della complessità è dovuto a duplicazione
genica e divergenza
L’aumento della complessità è dovuto alla duplicazione
genica: la superfamiglia delle globine nei vertebrati
Monomeri
Tetramero
DIVERGENZA FUNZIONALE DEI GENI DUPLICATI
Nuova funzione
Espressione in tessuti diversi
EVOLUZIONE DEI MAMMIFERI ATTRAVERSO IMPORTANTI
RIARRANGIAMENTI CROMOSOMICI
Separazione delle linee umana e murina: 75 mya
80% di tutti i geni umani e murini sono identificabili come ortologhi: le proteine
sono essenzialmente le stesse.
Regioni di sintenia: regioni genomiche che contengono gruppi di geni simili,
spesso disposti nello stesso ordine (in celeste) o in ordine inverso (in verde)
EVOLUZIONE DEI MAMMIFERI ATTRAVERSO IMPORTANTI
RIARRANGIAMENTI CROMOSOMICI
SINTENIA: CONSERVAZIONE DELL’ORDINE LUNGO IL CROMOSOMA DI GENI
ORTOLOGHI IN UOMO E TOPO
1990 – 2003:
il sequenziamento del genoma umano
Partecipazione di 20 centri di ricerca in USA, Europa, Giappone, Cina
Obiettivi: 1) sviluppo di tecnologie per mappatura e sequenziamento
2) costituzione di banche dati pubbliche
99,7% del genoma eucromatico  21000 geni distinti
codificanti per proteine
molte più proteine che geni!
GENOMICA COMPARATA: NON ESISTE UNA RELAZIONE TRA
COMPLESSITA’ DI UN ORGANISMO E IL SUO NUMERO DI GENI
Specie
Tipo
Dimensioni del
genoma (Mb)
Numero di geni
strutturali
H. sapiens
Uomo
3100
 20.000
D. melanogaster
Moscerino
della frutta
169
 14.150
C. elegans
Nematode
100
 20.200
Tetrahymena
termophila
Protozoo
cililato
104
>27.000
A. pisum
Afide piante
del pisello
517
>34.666
APPROCCI PER LO STUDIO DELLA RELAZIONE
GENE-FENOTIPO
GENETICA CLASSICA (FORWARD): osservazione di un fenotipo mutante
spontaneo, individuare il gene in cui si è verificata la mutazione e
determinare la proteina codificata
Approcci:
- inducendo mutazioni a caso nel genoma e cercando il gene associato
al fenotipo
- con inserzione casuale di sequenze retrovirali o trasposoni
GENETICA INVERSA (REVERSE): conoscendo una molecola (sequenza di
DNA, RNA o una proteina) cercare di capire la funzione del gene
nell’organismo
Approcci:
- mutagenesi specifica nel gene d’interesse
- creando fenocopie: stesso fenotipo mediante interferenza mRNA
antisenso (mutazione non trasmissibile ad altre cellule o nella linea
germinale)
CLASSE
VANTAGGI
SVANTAGGI E LIMITI
Primati non umani
Molto simili all’uomo a
livello biochimico,
fisiologico, genetico;
importanti per le
neuroscienze
Eticamente inaccettabili
per molti; alti costi;
progenie ridotta
Altri mammiferi
Simili per alcuni aspetti
(pecore e maiali); topi e
ratti facili da manipolare,
generazioni brevi, alta
numerosità progenie
Non sono buoni modelli
per funzioni cerebrali, es
malattie come Alzheimer,
breve vita per studio m.
insorgenza tardiva
Altri vertebrati
Pollo, Zebrafish, Xenopus,
buoni per sviluppo
embrionale; bassi costi,
Zebrafish: embrione
piccolo per manipolazioni
Xenopus: genoma
tetraploide
Pollo: numero individui
limitato
Invertebrati
C. elegans, Drosophila.
Bassi costi; facile analisi
genetica
Molto distanti
evolutivamente dall’uomo