Lez_13-14_vettori_19-4 - Università degli Studi di Roma "Tor

Lezione 13 - 14
martedì 19 Marzo 2011
corso vettori biologici II
Biotec industriali
ore 14:00 -16:00 aula 6A
la doppia elica da e riceve
informazioni
l’informazione genetica
non procede a senso
unico dal genoma verso il
nucleo - citoplasma matrice - e ambiente,
è vero anche il contrario
perchè il genoma deve
essere pronto a ricevere
messaggi dall’ambiente
in cui si trova le cellula:
questa è la regolazione
Si può intervenire sulla regolazione ?
Quali possono essere le strategie e le tecniche?
- La maggior parte dei vettori servono per esprimere o far
esprimere dei geni
- Si conoscono ancora pochi sistemi e pochi meccanismi che
non siano legati direttamente all’attività di un singolo gene
- I metodi utilizzati ricorrono a sostituzioni o delezioni di
promotori o enhancers
- a livello genomico non ci sono molti esperimenti controllati
- ci sono casi con macrodelezioni o inversioni cromosomiche
ma se sono vitali è difficle capire quanti e quali funzioni
alterino
le nuove prospettive
Manipolazioni genomiche più vaste o sono state fatte tramite
inserzioni in regioni regolative o tramite delezioni estese
Più recentemente sono stati adottati vasti BAC con intere
regioni da inserire nel genoma di cellule ed in animali
transgenici per verificare il fenotipo o solamente
l’espressione dei geni presenti nel BAC ed espressi
autonomamente prescindendo dalle funzioni endogene
Si tratta della sola possibilità di studio di un cluster
Con gli studi sulle cellule staminali si cominciano ad avere
studi su sistemi di controllo superiore, cioè su sitemi a monte
che controllano livelli più alti della regolazione
falsi problemi
Assolutamente importante: va considerato che a qualunque
stadio differenziativo di una cellula o di un organismo ci sarà
sempre una serie di geni espressi col loro turn-over con il
metabolismo di base identico
- geni house keeping
- marcatori di membrana (da noi considerati segnali di
differenziamento a volte con una funzione non ancora
identificata)
- quindi solo una certa parte del genoma sarà attiva
specifica dello stadio e del tessuto
- nella progressione è nostra l’attribuzione del livello
superiore di controllo, ma solamente perché temporalmente
è precedente allo stadio successivo di differenziamento
- il sistema è ciclico (come la tavola rotonda non ha
capotavola)
Prove di staminalità
per poter controllare la staminalità le prove possibili erano
di mimare l’espressione dei geni identificati per non essere
espressi in altre condizioni simultaneamente
- la prova essenziale è dimostrare tramite espressione di
geni la reversibilità degli stadi differenziativi
- trovare questi geni darebbe la possibilità di poter studiare i
meccanismi retrogradi del differenziamento più del livello
così detto superiore di controllo
- si tratta di trovare la temporalità nell’espressione con i
passaggi della modulazione delle varie fasi
- alcuni passaggi a cascata non possono essere ripercorsi
come il passaggio da linfocita a plasmacellula (dopo il
riarrangiamento somatico non ci può essere più recupero)
Molti tumori in varie fasi
Infatti non da ogni tipo di cellula può scaturire una neoplasia
- alcuni geni non possono essere attivati senza far perdere
funzioni essenziali per la sopravvivenza della cellula stessa
- alcune funzioni possono essere conflittuali
- per poter intervenire artificialmente devono esserci
strategie più mirate che tengano conto di possibili interazioni
evidenziate da studi così detti throughput
- questi studi permettono di analizzare il controllo di molti
geni contemporaneamente
usi classici dei plasmidi
dai clonaggi e subclonaggi per analisi più fini e sequenziamento
le libraries di DNA genomico e cDNA (trascrittoma)
i vettori di espressione in E.coli o eucarioti
sistemi con promotori costitutivi o inducibili
negli eucarioti i plasmidi non si replicano
trasfezione transiente o stabile
la trasfezione stabile avviene tramite
integrazione del vettore
Fino a qui metodi classici
Con questi tipi di vettori si è potuto usare il metodo ormai
classico :
- enzimi di restrizione
- ligasi
da quando è stata inventata (non scoperta) la PCR è stata
utilizzata parzialmente o totalmente in sostituzione di
questa metodologia comunque efficiente
- limitazione ai siti di taglio riconosciuti degli enzimi
- in certi casi sono aggiunti o tolti per mutagenesi
sito specifica i siti di taglio di consensus
dell’enzima voluto
per proseguire si deve
conoscere a fondo la PCR:
la PCR è una derivazione o applicazione del sistema
naturale della sintesi del DNA
in natura c’è solo la sintesi del DNA per duplicarlo prima
della mitosi
questa tecnica amplifica quantità di DNA specifiche e
limitate in lunghezza in maniera logaritmica raddoppiando
il templato ad ogni amplificazione
le basi erano precedenti
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959
"for their discovery of the mechanisms in the biological
synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid"
Severo Ochoa
Arthur Kornberg
il figlio Roger ha vinto
il Nobel nel 2006 per
aver scoperto il
meccanismo di
trascrizione negli
eucarioti tramite
l’mRNA poly II
half 1/2 of the prize
New York University
b. 1905 (in Luarca, Spain) d. 1993
half 1/2 of the prize
College of Medicine Stanford University
CA, USA b. 1918 d. 2007
inizio difficile
Kerry Mullis stated “lets you pick the piece of DNA you’re
interested in and have as much of it as you want”. 1983
The double-stranded DNA was separated
into two single strands by heating it to 96°C.
At this temperature, however, the E.Coli DNA
polymerase was destroyed so that the
enzyme had to be replenished after the
heating stage of each cycle. Mullis's original
PCR process was very inefficient since it
required a great deal of time, vast amounts of
DNA-Polymerase, and continual attention
throughout the PCR process.
La polimerasi era il punto debole cruciale della nuova tecnica
seconda intuizione geniale
The PCR group tested several different thermophillic
bacterial species, and eventually settled on Thermus
aquaticus, a strain of bacteria which had been discovered
living in Yellowstone hot springs. Because the bacteria lived
in water that often approached boiling conditions, its
polymerase enzyme had no problem remaining functional at
the PCR temperatures
However, higher annealing temperatures were not
established until the single “most important development of
PCR development”, the cloning, purification and commercial
distribution of a heat-resistant DNA polymerase from the
thermophilic bacterium Thermus aquaticus (Taq) in 1988.
il premio Nobel in Chimica
Kary Banks Mullis, Ph.D. (born December 28, 1944) is an
American biochemist and Nobel laureate.
Mullis shared the 1993 Nobel Prize in Chemistry with
Michael Smith. Mullis received the prize for his
development of the Polymerase Chain Reaction (PCR), a
reaction first described by Kjell Kleppe and 1968 Nobel
laureate H. Gobind Khorana that allows the amplification of
specific DNA sequences. The improvements provided by
Mullis have made PCR a central technique in biochemistry
and molecular biology. Mullis also received the Japan Prize
in 1993.
Metodo vagheggiato già da tempo
I premi Nobel Kornberg dello studio delle DNA polimerasi
sapevano che avendo a disposizione una DNA polimerasi
sarebbe stato possibile sintetizzare del DNA, ma sempre e
solo su un templato: extenction
- la sintesi ex novo pareva un miraggio e anche la rapida
amplificazione di grosse quantità
la PCR e le sue applicazioni
la tecnica in cosa consiste
PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica atta ad amplificare in
provetta frammenti di DNA di cui siano note le due estremità. Inventata da
Kerry Mullis nel 1983 (premio Nobel nel 1993), fu resa efficiente nel 1988
grazie all’uso dell’enzima Taq DNA polymerase del batterio Thermus
aquaticus, resistente ad alte temperature. Questa tecnica è diventata
indispensabile nella biologia per le tante applicazioni anche in medicina
diagnostica. Con la PCR è possibile amplificare ed isolare uno specifico
segmento di DNA (amplicone) dal genoma di specie viventi o da un DNA
artificiale o clonato. Le dimensioni dell’amplicone possono variare da poche
decine di paia di basi fino ad un massimo di 15-20 mila paia di basi (un
cromosoma ha una lunghezza di milioni di paia di basi). L’amplificazione
avviene grazie a cicli successivi di sintesi del segmento di DNA, delimitato
da due primers o inneschi sintetici (frammenti a singola elica di DNA lunghi
~15-25 basi) complementari alle sue estremità.
come è la tecnica
amplificazione diretta: come si setta un protocollo
le fasi della PCR
temperature
durata e numero dei cicli
scelta dei primers
le basi della PCR
Polimerase Chain Reaction
reazione di polimerizzazione a catena
amplificazione esponenziale del DNA (di qualunque
provenienza)
amplificazione in vitro del DNA tramite una DNA polimerasi
Come sintetizza la polimerasi
Ricordare per sempre:
Le polimerasi sintetizzano DNA o RNA in direzione 5’
3’ a partire da un innesco 3’ libero su un templato.
Il DNA e’ una molecola a doppia elica, le due eliche sono
antiparallele, la sintesi avviene sempre nella stessa
direzione per ognuna delle eliche, quindi in verso
opposto su ognuna di esse, ma sempre 5’ 3’
La polimerasi poiche’ sintetizza in direzione 5’ 3’
scorrera’ sulla elica di DNA templato in direzione 3’ 5’
ma come funziona la PCR ?
i vari passaggi per sintetizzare in vitro il DNA
la sintesi con la polimerasi avviene sulla singola elica
tramite un innesco (“primer”) appaiato per
complementarietà alla elica che funziona da templato
1 passaggio: denaturazione della doppia elica di DNA
2 passaggio: appaiamento dei “primers” sul templato ssDNA
3 passaggio: sintesi ed estenzione della nuova elica a
partire dal primer ad opera della Taq-polimerase
il ciclo è terminato e ricomincia
3 passaggi a 3 temperature
perchè all’inizio era difficile la PCR ?
non solo per l’inattivazione della polimerasi di E.coli al
passaggio della denaturazione del DNA a 94°C
ma per i successivi passaggi alle diverse temperature
se i passaggi sono lenti i primers si possono appaiare
anche ad altre sequenze genomiche dando amplificazioni
aspecifiche indesiderate
necessità di una macchina rapida nei passaggi di temperatura
invenzione del termociclatore ad aria invece dei bagni Maria
La reazione a catena della DNA polimerasi
PCR “polymerase chain reaction”
Descrizione della tecnica, metodo, componenti,
variabili, strumenti = termociclatori
Tecnica: amplificazione esponenziale a cicli successivi tramite
DNA polimerasi (adesso e’ termo resistente)
DNA polimerasi di “thermophilus aquaticus” (Taq polimerasi)
- salto di qualita’ del metodo, molto piu’ efficiente.
Le applicazioni si sono moltiplicate nella ricerca biologica e
medica, nella diagnostica e medicina forense (legale)
Il principio sfrutta l’efficienza (velocita’ di sintesi) della DNA
polimerasi utilizzando due inneschi (primers) artificiali scelti dallo
sperimentatore sulla sequenza da amplificare (modo esponenziale).