Il Progetto genoma Umano

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Il progetto “Genoma Umano” è iniziato nel
1990.
E’ stato possibile perchè nel 1986 era stato
sviluppato il sequenziamento automatizzato
del DNA.
Progetto internazionale finanziato da vari
paesi, affidato al National Human Genome
Research Institute (NHGRI) ed al Sanger
Centre di Cambridge.
Sviluppo dell’algoritmo BLAST per la ricerca di
somiglianze.
1992: disponibilità dei BAC.
BLAST
(basic local alignment
search tool)
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Gli obiettivi principali del progetto erano di:
- decifrare in maniera accurata la sequenza
completa delle 3 billioni coppie di basi del
DNA umano;
- identificare tutti i 20.000 – 25.000 geni umani.
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Elementi genetici unici di cui sia nota con
precisione la disposizione lungo il genoma.
L’insieme di questi marcatori costituisce la:
mappa fisica o mappa genetica, in funzione
delle modalità attraverso le quali viene
determinata la disposizione spaziale relativa
dei marcatori.
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Mappa genetica (mappa di linkage):
diagramma dell’ordine dei geni su un
cromosoma, in cui la distanza tra i geni
adiacenti è proporzionale alla frequenza di
ricombinazione fra di essi durante la meiosi.
Tipo di marcatore
Nome
Polimorfico
RFLP
393 RFLP nel genoma umano.
Microsatellite
Sequenza di 1-4 nucleotidi ripetuti in tanden 10
o più volte. Mappa di 814 (1992).
SNP
Non polimorfico
Una recente mappa di SNP ne contiene 3
milioni.
Sequencetagged site
(STS)
Un sequenza qualsiasi di DNA che è stata
mappata in una posizione subcromosomica
specifica e che può essere saggiata mediante
amplificazione di PCR.
Expressed
sequence tag
(EST)
Un sottoinsieme di sequence-tagged site che è
posizionato all’interno di sequenze di DNA
note per essere trascritte.
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Approccio dell’assemblaggio del genoma clone per
clone (CGS): molte copie del genoma sono tagliate in
frammenti di circa 150.000 bp medinate digestione
parziale con endonucleasi di restrizione.
I grandi frammenti di DNA sono clonati in BAC ed
amplificati in ospiti batterici
Selezione e purificazione dei cloni  digestione con
endonucleasi di restrizione per produrre piccoli
frammenti di ciascun clone  mappatura dei siti del
genoma tagliati dalle endonucleasi di restrizione
(mappa fisica).
I frammenti più piccoli vengono subclonati.
Sequenziamento dei subcloni.
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Il sequenziamento finanziato privatamente
sviluppato dalla Celera Genomics Corporation
si è basato sull’approccio shutgun.
Il progetto iniziò nel 1998 e terminò
contemporaneamente a quello del consorzio
pubblico.
L’approccio prevede la preparazione di cloni
con piccoli inserti( 2-10 kb) direttamente dal
DNA genomico.
Sequenziamento dei frammenti clonati.
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Trascriptoma
Da RNA a cDNA  clonaggio 
sequenziamento.
Sequenze della lunghezza massima di 1kb che
corrispondono a frammenti di trascritti maturi
denominati EST (Expressed Sequence Tag).
Le sequenze EST sono depositate in banche
dati: NCBI e EBI.
Gruppi di EST (cluster) che derivano da uno
stesso gene sono depositati nella banca dati
specializzata Unigene.
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Ricerca degli Open Reading Frame (ORF).
Più facile per i genomi procariotici.
Programmi bioinformatici:
Pattern discovery
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BLAST: allineamenti “locali” tra la sequenza in
esame e tutte quelle presenti in una banca dati.
Confronto a livello nucleotidico od a livello
proteico.
Allineamento “globale”: programmi
bioinformatici CLUSTAL o MUSCLE.
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I geni omologhi che hanno cominciato ad
evolvere in modo indipendente in seguito a
speciazione sono detti ortologhi.
I geni che si sono generati grazie ad un evento
di duplicazione genica sono detti paraloghi.
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Il progetto ENCODE (Enciclopedia degli
elementi del DNA) ha lo scopo di fornire una
rappresentazione biologicamente più
informativa del genoma umano usando metodi
“high-throughput” per identificare e catalogare
gli elementi funzionali codificati.