Meccanismo di maintenance del telomero: rilevanza

LUNG CANCER
Diagnosi precoce del tumore polmonare con TAC spirale, PET e biomarcatori: studio
randomizzato condotto su individui ad alto rischio.
(Ugo Pastorino – Head of Fuctional department of solid tumors)
In Europa la sopravvivenza globale a 5 anni per il tumore polmonare è solo del 10%. La diagnosi
tardiva di una patologia estesa è il principale motivo di fallimento del trattamento, considerando che
la sopravvivenza a lungo termine per i tumori resecati in stadio precoce supera l’80%. Trials sulla
diagnosi precoce condotti negli Stati Uniti dal National Cancer Institute (NCI) negli anni ‘70 non
hanno condotto ad una riduzione della mortalità per cancro al polmone e neppure la prevenzione di
patologia in fase avanzata a causa della scarsa sensibilità della radiografia del torace e della
citologia condotta. Al contrario, studi pilota con la TAC spirale del torace in Giappone e l’Early
Lung Cancer Action Project (ELCAP) negli Stati Uniti hanno dimostrato che la TAC spirale può
identificare tumori di dimensioni molto piccole in un gruppo di soggetti ad alto rischio, con un tasso
di resecabilità molto alto e oltre l’80% di cancri polmonari diagnosticati in stadio I. Comunque, per
ottenere la performance migliore, la TAC deve essere applicata in una alta proporzione di
partecipanti, con un complesso algoritmo di ricostruzione tridimensionale per la valutazione della
crescita dimensionale e per un lungo periodo diagnostico (oltre 2 anni). In principio, il nostro
progetto di ricerca era focalizzato sulla combinazione delle più avanzate tecniche di imaging con i
nuovi sviluppi della biologia molecolare al fine di implementare le effettive strategie per la diagnosi
precoce del tumore polmonare, e valutare l’efficacia in termini di riduzione della mortalità.
Per semplificare il workup diagnostico e migliorare l’accuratezza della TAC spirale per i noduli
polmonari indeterminati, le lesioni con dimensione inferiore a 5 mm sono state considerate non
sospette e rivalutate con TAC a basso dosaggio di radiazioni a distanza di 1 anno, mentre la PET è
stata utilizzata per caratterizzare lesioni non calcifiche di dimensioni maggiori (7 mm) evidenziate
dalla TAC.
Alla fine del secondo anno di studio, sono stati diagnosticati 22 casi di tumori polmonari (11 al
baseline, 11 al 2° anno); 440 lesioni polmonari sono state identificate in 298 (29%) partecipanti, ma
solo 95 sono stati richiamati per eseguire una TAC torace ad alte risoluzione con mezzo di contrasto
[Lancet 2003; 362:593-7]. La PET è risultata positiva in 18 dei 20 casi di cancro diagnosticati. La
resezione completa è stata eseguita in 21 tumori polmonari (95%), 17 (77%) erano in stadio I, e la
media della dimensione era di 18 mm.
La complicanza maggiore nell’uso sistematico della TAC spirale è l’elevata frequenza di falsi
positivi. Infatti, il report della Mayo Clinic dopo 2 anni di studio ha dimostrato che il 69% di 1520
dei soggetti screenati con TAC multi-slice aveva noduli polmonari non calcificati e solo il 3% di
questi erano maligni, con il nostro protocollo selettivo solo il 9% dei partecipanti (4,6% degli esami
TAC low-dose) è stato sottoposto a ulteriori indagini per una lesione sospetta e il 23% di queste
lesioni erano maligne. Sei pazienti sono stati sottoposti a biopsia chirurgica per patologie benigne a
causa di un risultato falso positivo (6% dei richiami, il 22% delle procedure invasive). Questo
innovativo algoritmo diagnostico che usa la TAC spirale low-dose associata a una PET selettiva con
approccio conservativo verso le lesioni più piccole, sembra essere sicuro ed efficace per la diagnosi
precoce del tumore polmonare. Infatti, l’accuratezza diagnostica della PET (85%) è risultata elevata
senza necessità di ricorrere ad ago-biopsia, non si sono verificati casi di cancro intervallo in un
totale di 2631 persone-anno in follow-up, e lesioni inferiori ai 5 mm sono state seguite con
sicurezza con una esecuzione di TAC dopo 12 mesi senza rischio di progressione.
Alla fine dei 5 anni, la compliance finale è stata dell’85%, il tasso cumulativo di richiami per un
TAC ad alta risoluzione è stato del 17% e il tasso di PET di 1.4% (69/4818 TAC low-dose). E’ stato
diagnosticato un totale di 38 tumori polmonari primitivi, con una resezione completa in 33 casi
(87%) e 24 (63%) erano in stadio I. Non sono state effettuate pneumonectomie e non si sono
verificate morti perioperatorie, il 63% dei pazienti sono vivi e liberi da malattia (96% dei tumori in
stadio I).
Tuttavia, il tasso di detection si è ridotto durante il quarto e il quinto anno, e abbiamo riscontrato
una certa proporzione di neoplasie in stadio avanzato a rapida crescita, compreso un cancro
intervallo. Questo può costituire un problema se dovesse perdurare in futuro, in quanto uno dei
benefici attesi da un programma di prevenzione è la riduzione o prevenzione del riscontro di
neoplasie polmonari in stadio avanzato e incurabili. Non abbiamo riscontrato mortalità chirurgica,
abbiamo confermato attraverso uno studio condotto in cooperazione con il gruppo di diagnosi
precoce di Torino-Orbassano, basato su una seria consecutiva di 1387 resezioni polmonari per
tumore, che anche nei casi di tumore in stadio I diagnosticati routinariamente la mortalità e la
morbilità sono molto basse (0.5%) se paragonate agli stadi più avanzati [ASCO 2004, abstract #
2564].
Un programma specifico sull’analisi del valore di cDNA microarray per lo studio della biologia dei
tumori in fase precoce è stato condotto in cooperazione con le Unità di oncologia sperimentale
dell’Istituto Europeo di oncologia di Milano (Prof. P. Di Fiore, Dr. F. Bianchi) e di patologia
dell’Ospedale ICRF di Oxford (Dr. F. Pezzella). In un recente articolo riguardante uno studio casocontrollo, abbiamo dimostrato che tumori riscontrati con TAC e tumori sintomatici hanno un profilo
di espressione genica simile, con pochi geni espressi in maniera differente [Clin Cancer Res 2004,
10:6023-28]. In particolare, tumori diagnosticati in fase precoce dimostrano un livello di acido
retinoico più alto e un più alto livello di espressione di caveolina 2, matrix Gla, and cystatin A, che
vengono perdute durante la progressione tumorale. Questo studio dimostra che tumori in fase
precoce, diagnosticati con TAC spirale in individui asintomatici, hanno un pattern di espressione
genica simile ma non identica dei carcinomi polmonari sintomatici.
Stiamo lavorando con il Dr. Peter Bach del Memorial Sloan Kettering Cancer Centre per valutare la
potenziale riduzione della mortalità per carcinoma polmonare attribuibile alla diagnosi precoce in
un trial non randomizzato. Il primi risultati di questa collaborazione sono stati pubblicati
recentemente [Chest 2004; 126:1742-49].
Il nuovo trial randomizzato sulla diagnosi precoce del tumore polmonare.
Nonstante gli esiti positivi, rimangono ancora molti punti critici da chiarire su un programma di
screening del tumore polmonare, e la reale capacità della TAC di ridurre la mortalità per tale
patologia deve essere testata in studi controllati. Il trial del NCI ha randomizzato più di 50,000
individui ad alto rischio negli Stati Uniti che ricevono una TAC spirale o una radiografia del torace
ogni anno per tre anni, un numero simile di soggetti sarà arruolato in Europa per valutare l’uso della
TAC paragonata alla radiografia del torace (Francia) o a un gruppo di controllo che non esegue
alcun esame (Olanda, Belgio, Denimarca) per cinque anni. I vari studi randomizzati condotti in tutto
il mondo nella prossima decade sono stati disegnati con lo scopo di rispondere a molte delle
questioni aperte e per fornire contributi originali per le strategie future sulla diagnosi precoce del
tumore polmonare.
Un nuovo studio prospettico multicentrico randomizzato è stato intrapreso nel nord Italia. Il nuovo
studio, denominato MILD, recluterà 10000 individui (età maggiore di 49 anni, forti fumatori) che
verranno seguiti per un periodo totale di intervento di dieci anni, randomizzati in due gruppi: un
gruppo di controllo che sarà sottoposto a un programma di prevenzione primaria, una visita
pneumologica con valutazione della funzionalità polmonare e un gruppo che sarà sottoposto a
esecuzione periodica di TAC spirale ± PET associata a un programma di prevenzione primaria, una
visita pneumologica con valutazione della funzionalità polmonare. Quest’ultimo gruppo sarà a sua
volta randomizzato in due braccia: TAC a basso dosaggio di radiazioni ogni anno vs TAC a basso
dosaggio ogni due anni.
L’End-point primario dello studio è di valutare la percentuale di cessazione da fumo e l’impatto
sulla mortalità di un programma di diagnosi precoce. Una TAC multislice di ultima generazione (16
strati) e una TAC/PET sono combinate con analisi gnomica e proteomica su campioni di plasma.
Il nuovo trial vuole testare anche la fattibilità di un programma di screening attraverso un network
che comprende 10 ospedali con adeguati servizi di diagnostica e adeguata esperienza che garantisca
un rapido arruolamento della popolazione e un’elevata qualità di intervento per l’intero periodo dei
dieci anni di intervento. Tutti i centri saranno collegati attraverso un network nazionale, con lo
stesso database utilizzato da altri studi prospettici in Europa e negli Stati Uniti e validato
dall’ELCAP. Sarà attivata anche una banca dei tessuti per la revisione dei campioni istologici dei
tumori diagnosticati e sarà effettuata anche analisi dei biomarcatori. Questo progetto è finanziato
dal Ministero della Salute e dall’AIRC. La Fondazione Carialo ha finanziato l’analisi proteomica
sul plasma nella diagnosi precoce del tumore polmonare.
Un ulteriore progetto di ricerca riguarda lo studio del SUV ottenuto con la PET come predittore
della prognosi nei tumori resecati e diagnosticati con la TAC. Questo studio è condotto in
collaborazione con il Dipartimento di Medicina Nucleare del San Raffaele (Prof. F. Fazio) e il
nostro Istituto (Dr. E. Bombardieri).
Uso di biomarcatori molecolari per la diagnosi precoce del tumore polmonare
(Gabriella Sozzi – Head of Unit of Cytogenetics and molecular genetics)
Lo scopo di questo progetto è quello di stabilire se i biomarcatori sono in grado di identificare
individui ad alto rischio di sviluppare tumore in una popolazione di forti fumatori, che si candidano
come volontari, e di migliorare l’accuratezza della diagnosi precoce attraverso la TAC spirale a
basso dosaggio di radiazioni.
Abbiamo studiato la frequenza e il modello di metilazione dei promotori di tre geni RAR-2,
p16INK4A e RASSF1A in campioni tumorali di 29 pazienti sottoposti a Tac spirale per ca polmonare.
Inoltre, siamo stati in grado di analizzare il profilo di metilazione nei campioni di espettorato di un
sottogruppo di 18 pazienti screenati. L’espettorato è stato confrontato con quello osservato in 112
forti fumatori sani arruolati nello studio pilota del 2000.
I risultati di questo studio hanno indicato che un’alta frequenza di ipermetilazione di promotori di
RARβ2, p16INK4A e RASSF1A è presente nei tumori evidenziati con TAC spirale dal momento che
23/29 (79.3%) dei tumori presentavano metilazione in almeno un gene. L’ipermetilzaione dei
promotori di questi geni nello sputo non indotto dei pazienti era simile a quello individuato in
fumatori sani e mostrava un valore diagnostico limitato nella diagnosi precoce del tumore
polmonare. (Cirincione R. IJC 2005).
In precedenza, abbiamo riportato che i livelli di DNA libero circolante sono più alti nel plasma di
pazienti neoplastici che non in quello di pazienti sani, e abbiamo suggerito che questo biomarcatore
può essere una componente utile per lo screening del tumore polmonare.
I biomarcatori del DNA plasmatico possono essere utile nella clinica, tuttavia, le misurazioni
devono essere resistenti alle variazioni che possono avvenire durante il campionamento, la
processazione e lo stoccaggio. Abbiamo analizzato l’effetto di uno stoccaggio prolungato sia per il
DNA plasmatico che DNA isolato nella quantificazione del DNA libero circolante attraverso la
tecnica PCR real-time. Per entrambi i campioni i livelli si riducono sensibilmente nel tempo, con un
tempo di decadimento annuo di circa il 30%. Questa osservazione è importante per analisi
retrospettive di campioni già storati e deve essere tenuta in considerazione negli sviluppi futuri di
studi clinici.(Sozzi G. JNCI 2005).
In futuro saranno condotti studi per la validazione dei biomarcatori nel DNA in un campione ampio
di prelievi raccolti durante studi europei e italiani sulla diagnosi precoce del tumore polmonare e
per lo sviluppo di nuove tecniche basate sull’utilizzo della proteomica nel plasma. La
caratterizzazione genomica del DNA plasmatico nei pazienti affetti da cancro e in controlli sarà
condotta valutando l’integrità dei frammenti di DNA plasmatici, il suo enrichment in specifiche
sequenze genomiche e il meccanismo del rilascio di DNA circolante.
Differenti espressioni e localizzazioni della survivina umana in lesioni neoplastiche e non, e la
loro relazione con markers correlati con l’apoptosi e l’indice di proliferazione.
(Maria Grazia Daidone – Head of Unit of Traslational research)
La Survivina, il membro più piccolo della famiglia delle proteine che inibiscono l’apoptosi (IAP), è
espressa in molti tipi di tumori umani, dove rappresenta uno dei geni più tumore specifico
recentemente identificato nel genoma umano, ma è di solito non riscontrabile in tessuti normali ,
questo suggerisce che la riattivazione della sua espressione può risultare comune nella
tumorigenesi. Varie esperienze supportano l’esistenza di un non ridondante, multifunzionale
pathway di survivina posizionato tra la progressione mitotica e l’inibizione apoptotica e che
preserva la viabilità delle cellule tumorali proliferanti. Il nostro obiettivo è di studiare: 1)
l’espressione e la funzione delle differenti forme di survivina nel cancro e nelle forme
preneoplastiche e se possibile nel tessuto sano che circonda le lesioni; 2) la relazione con i vari
fattori che influenzano la sua espressione e il pathway di survivina. I nostri dati confermano la
presenza di un’espressione sregolata della survivina e degli altri geni della famiglia IAP (X-IAP, cIAP1, c-IAP2) non solo nei carcinomi invasivi ma anche nei non invasivi o nelle lesioni benigne del
colon-retto e della mammella come anche nel mesotelioma peritoneale maligno (PM). La molecola
proapoptotica SMAC/Diablo, al contrario, è espressa in una piccola frazione del PM (in accordo
con il modesto tasso di apoptosi spontanea nel PM) e in alta frazione nei tumori del colon-retto e
della mammella. SMAC/Diablo può essere rilevato in una piccola frazione di cellule di lesioni
benigne o di carcinomi in situ rispetto ai carcinomi invasini del colon-retto o della mammella.
Come atteso, la immunoreattività al MIB-1 aumenta se si passa da tumori benigni, tumori in situ
fino ai tumori invasivi. I nostri risultati dovrebbero supportare l’ipotesi che la survivina si comporta
come un marker non ridondante rispetto alla misurazione diretta della proliferazione cellulare e
dell’apoptosi. Infatti, è sempre over-espressa nella zona di transizione tra lesione benigna e lesione
in situ/invasiva, e la differente associazione con la proliferazione cellulare osservata nella
trasformazione di lesioni benigne in maligne indirettamente supporta l’ipotesi che la survivina
contribuisce alla tumorigenesi del colon-retto e della mammella aumentando la proliferazione
cellulare e la resistenza all’apoptosi nelle lesioni preneoplastiche. Vista la sua overespressione nei
tumori invasivi, la survivina può essere associata in maniera indipendente con la progressione
neoplastica. Al contrario per la sua presenza nelle cellule tumorali e per il suo cruciale
coinvolgimento nella sopravvivenza del tumore può essere considerata uno dei bersagli strategici di
nuovi trattamenti.
Meccanismo di maintenance del telomero: rilevanza sulla progressione dei tumori solidi
(Nadia Zaffaroni – Unit of Traslational research)
Il mantenimento della lunghezza del Telomero è importante per rendere immortali le cellule, and
hence for cancer biology. In molti tumori dell’uomo, l’accorciamento del telomero può
controbilanciare de novo la sintesi di DNA telomerico catalizzato dalla telomerasi. Alcuni tumori
non presentano attività telomerasica e mantengono la lunghezza dei loro telomeri con un
meccanismo alternativo (ALT). Telomere dynamics in ALT cells consistono in un meccanismo di
ricombinazione e le caratteristiche delle cellule ALT comprendono telomeri lunghi ed eterogenei e
una struttura nucleare chiamata ALT-associated promyelocytic leukemia bodies (APBs) che
contiene DNA telomerico, telomere-specific binding proteins e proteine coinvolte nella
ricombinazione e replicazione del DNA. La telomerasi e l’ALT sono capaci di supportare
l’immortalità delle cellule, in vivo conferiscono diverse proprietà alle cellule tumorali, è importante
quindi studiare le implicazioni prognostiche del meccanismo di maintenance (TMMs) nei tumori
clinici. Utilizzando metodiche disponibili grazie a recenti scoperte, in questo progetto vogliamo
valutare la possibile rilevanza clinica di ALT e della telomerasi in un campione ampio di tumori
polmonari dell’uomo, della mammella e dell’ovaio oltre che dei sarcomi dei tessuti molli con gli
oittivi specifici di determinare la prevalenza di ALT in questi tipi di tumore, di valutare
l’associazione di ALT con recidive e/o fenotipi metastastici e correlare ALT con outcome clinici.
Abbiamo studiato TMMs in 86 tumori polmonari neuroendocrini. Abbiamo riscontrato una bassa
frequenza di casi telomerasi positivi in casi carecinoide tipico (14%) rispetto a tumori
neuroendocrini a grandi cellule (87%) e a tumore polmonare a piccole cellule (92%). Telomeri
erano significativamente più lunghi nei carcinoidi telomerasi negativi rispetto a quelli positivi
(mediana, 9.15 vs 4.47 Kb). ALT, come valutato dalla presenza di APBs, non era presente in questi
tumori. Questi risultati suggeriscono che l’assenza di TMM contribuisce ad una prognosi
favorevole. TMMs sono stati analizzati in 139 liposarcomi. ALT o l’attività telomerasica è stata
riscontrata rispettivamente nel 25.9% e 26.6% delle lesioni. L’incidenza dei due TMMs era simile
nelle lesioni pimitive e nelle recidive, mentre le metastasi risultavano maggiormente telomerasi
poisitive che ALT-positive (59% versus 18%). La presenza di TMMs influenza negativamente la
prognosi del paziente: un aumento della mortalità è associato a una telomerasi- o ALT-positività se
paragonata all’assenza di TMM. ALT sembra essere un potente discriminante prognostico rispetto
alla telomerasi se aggiustato per localizzazione del tumore e per istologia (hazard ratio per morti
causa-specifica, 3.41 v 1.02).
Studio caso-controllo sul ruolo del polimorfismo genico nel rischio di tumore polmonare.
(Tommaso A. Dragani – Head of Unit of polygenic inheritance)
Ogni anno in Italia circa 50 persone su 100 000 abitanti ricevono diagnosi di tumore al polmone.
Tale patologia ha scarsa prognosi e pochi sono i metodi per una prevenzione o una diagnosi
porecoce. Dati epidemiologici suggeriscono che il rischio di tumore al polmone è determinato da un
una interazione tra fattori di predisposizione genetica e fattori ambientali come l’esposizione al
fumo di tabacco. Il possibile ruolo di fattori ereditari nel rischio di insorgenza di tumore pol monare
non può essere negato. Con lo scopo di identificare i geni coinvolti nel rischio di sviluppo di tumore
polmonare abbiamo analizzato i polimorfismi di un singolo nucleotide (SNPs) sull’intero genoma
con un approccio su larga scala usando tecniche recenti che permettono di valutare
contemporaneamente 100 000 SNP nello stesso campione di DNA.
Prima abbiamo reclutato pazienti affetti da tumore polmonare e i relativi controlli sani dalla
popolazione generale con l’obiettivo di costituire un campione ben caratterizzato dal punto di vista
clinico e patologico. Poi abbiamo analizzato l’intero genoma (100 000 SNPses) su pools di DNA
derivati sia dai soggetti affeti da tumore che dai soggetti sani per identificare il polimorfismo genico
associato con il rischio di insorgenza di tumore polmonare. Successivamente abbiamo voluto
validare i risultati ottenuti nella prima serie come una serie indipendente costituita da una
popolazione di soggetti con cancro non fumatori e soggetti sani appartenenti allo stesso nucleo
familiare reclutati su scala nazionale in collaborazione con l’associazione"Marta Nurizzo". La
disponibilità dei parametri clinici e il follow-up dei pazienti potrà permettere di associare il
polimorfismo genico a parametri clinici e prognostici. Abbiamo condotto uno studio pilota su due
pools di DNA ottenuti da pazienti affetti da adenocarcinoma polmonare o controlli sani matchati
analizzati con Affymetrix 100K SNP chip. Abbiamo individuato alcuni geni candidati che mostrano
differenti frequenze all’eliche nei casi e nei controlli. Molti di questi risultano essere falsi positivi
all’analisi di conferma. Ulteriori studi sono in corso. I risultati di questi studi potranno permettere lo
sviluppo di nuove tecniche per la diagnosi precoce del tumore polmonare, basato
sull’individuazione del rischio individuale associato al polimorfismo genico.
Study on possible association between gene expression profile of normal lung tissue and lung
cancer risk
(Tommaso A. Dragani – Head of Unit of polygenic inheritance)
I nostri primi studi su condotti su cavie suggeriscono che il profilo di espressione genica del
polmone sano può essere predittivo del rischio di insorgenza di tumore polmonare. I risultati
suggeriscono che alterazioni nel profilo di espressione genica sono identificabili nel tessuto
polmonare normale e può essere associato a rischio di insorgenza di tumore al polmone. Basandoci
su questi risultati vogliamo studiare il profilo di espressione genica nei polmoni sani umani in
relazione con lo sviluppo di tumore polmonare. E’ stata creata una banca biologica di tessuti
normali provenienti da pazienti sottoposti a lobectomia per rimozione di cancro polmonare o
metastasi da tumore non primitivo del polmone. Verranno estratti gli RNA dei campioni e verranno
analizzati profili di espressione genica in associazione con lo stadio clinico del paziente. I risultati
verranno confermati con una real-time quantitativa RT-PCR. E’ stato condotto uno studio pilota
usando pools di RNA di polmoni sani ottenuti da resezioni polmonari di cancro polmonare o
metastasi da tumore non primitivo del polmone. I cDNA preparati da questi due pools di RNA
pools sono stati ibridizzati con Affymetrix human genome expression array. Alcuni geni hanno
presentato un diverso livello di espressione di mRNA. I risultati di questo studio potranno
identificare un profilo di espressione genica nel polmone sano associato con il rischio di insorgenza
di tumore polmonare. Successivamente potremo sviluppare specifici anticorpi contro prodotti di
proteine dei geni identificati per sviluppare nuove metodiche diagnostiche non invasive, come per
esempio sullo sputo, per stimare il rischio individuale, e migliorare la prevenzione di questa
patologia.