Programma FARMACOGENOMICA ANNO ACCADEMICO 2009

Programma FARMACOGENOMICA
ANNO ACCADEMICO 2009-2010
Docente: Dr.ssa Carlotta De Filippo
• Strutture dei genomi e Progetti genoma
Definizione genotipo e fenotipo, evoluzione del concetto di gene. Definizione di genoma. Il genoma
di procarioti e eucarioti, principali caratteristiche. I geni discontinui e il processamento dell’RNA
negli eucarioti. Mappe citologiche, l’eucromatina e l’eterocromatina. Struttura e impacchettamento
della cromatina, gli istoni.
Obbiettivi progetti genoma. Principali tappe del progetto genoma umano, strategie di
sequenziamento e annotazione, organizzazione del genoma umano. Banche dati (NCBI, OMIM,
CGAP). Progetto genoma di topo e di ratto, principali tappe, vantaggi nell’utilizzo di sistemi
modello, banche dati. Gli invertebrati come modello nella ricerca biomedica: Drosophila
melanogaster, Caenorhabditis elegans. Studi sull’evoluzione e origine della vita mediante analisi
dei genomi. I genomi di organismi parassiti: Plasmodium falciparum. Genomica comparativa,
sintenia, chromosome painting. Comparazione genoma di topo con genoma umano. Categorie
funzionali genomi eucarioti. Organizzazione delle sequenze dei genomi eucariotici: DNA a singola
copia, geni che codificano per proteine; DNA presente in più di una copia: a) Sequenze funzionali:
famiglie di geni codificanti , famiglie geniche disperse, famiglie geniche in tandem, sequenze
funzionali non codificanti (telomeri); b) Sequenze senza funzione nota: Ripetizioni
nell’eterocromatina centromerica, SINE, LINE, HnRNA nucleare, UTRs. Ripetizioni in tandem di
numero variabile (VNTR), Sequenze trasposte, Trasposoni che si muovono come DNA (Pelements in Drosophila, IS batteriche, elementi Ty in lievito), Retrotrasposoni, Sequenze correlate a
retrovirus; Sequenze ripetute semplici: microsatelliti, minisatelliti. Patologie associate all’instabilità
dei microsatelliti. Struttura dei centromeri e dei telomeri. DNA spaziatore. Annotazione funzionale
e cluster di famiglie geniche. Gene Ontology.
•
Metodi di sequenziamento e annotazione dei geni
Mappe citologiche, Mappe genetiche, Mappe fisiche, Polymerase Chain Reaction (PCR) principi
e applicazioni, Sequenziamento del DNA, Metodo di Sanger. Nuovi Metodi per sequenziare il
DNA: il pirosequenziamento. Strategie di sequenziamento dei genomi, Hierarchical Sequencing,
Sequenziamento “clone by clone”, Shotgun, Chromosome walking, Annotazione genoma,
Sequenziamento EST. Banche dati: UniGene
• Metodi di individuazione di SNPs (Single Nucleotide polymorphisms)
Concetti generali sulla variabilità umana e risposta farmacologica. Definizione di Single Nucleotide
Polymorphism. Tipologie di SNPs: transizioni , transversioni , inserzioni e/o delezioni singola
base. SNPs non codificanti; SNPs codificanti: Replacement Polymorphism, Synonymous
Polymorphism, Non-replacement Polymorphism. Effetti degli SNPs nella risposta ad un farmaco.
Metodiche classiche per l’identificazione di polimorfismi: Sequenziamento del DNA (Metodo di
Sanger), Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), Single Stranded Conformation
Polymorphism (SSCP), Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP). Uso di microarrays
per studiare variazione a livello genomico. Uso di arrays contenenti geni interi per studiare
delezioni (Comparative genome hybridization, CGH).
Strategie sperimentali per analisi di sequenza mediante oligonucleotide-array: Gain–of–signal
sequence, Loss of hybridization signal sequence analysis, Combinazione Gain–of–signal sequence
con Loss of hybridization signal sequence analysis (Affymetrix).
Il Progetto Hap Map: caratterizzazione della distribuizione allelica degli aplotipi-polimorfismi in
popolazioni, in studi di associazione fra polimorfismi e malattie per scoprire i geni responsabili di
una malattia o della sensibilità a un farmaco.
 La metagenomica
Generalità sul genoma batterico, Progetto genomi microbici. Ruolo delle comunità microbiche
commensali nell’organismo umano. Il progetto microbioma umano: scopi e obbiettivi. Definizione
metagenomica. Sequence-based metagenomics: Identificazioni specie batteriche presenti (16S
rDNA), Organizzazione dei genomi microbici, Identificazione geni e pathways metabolic,
Distribuzione delle funzioni in una comunità microbica, Comparazione con altre comunità
microbiche. Function-based metagenomics: Screening per identificare funzioni di interesse quali la
produzione di vitamine e antibiotici, Identificazione geni che codificano per funzioni di interesse (e.
resistenze, enzimi detossificanti etc.). Il Ribosomal Database Project. Descrizione della struttura di
comunità batteriche senza il bisogno di colture batteriche (DGGE, RFLP). Identificazione a livello
di specie mediante sequenziamento del 16S rDNA. La microflora intestinale umana. L’utilizzo dei
microarray per lo studio della microflora umana. Ruolo della microflora intestinale umana nei
processi metabolici e di detossificazione.
 Farmacogenetica del metabolismo umano
Concetti generali del metabolismo di un farmaco. Le reazioni di Fase I (Ossidazione, riduzione,
idrolisi); le reazioni di Fase II (Coniugazione: acetilazione, glucuronazione, solfatazione,
metilazione, coniugazione con GSH). Variabilità degli enzimi metabolizzanti. Variabilità
interspecie. Il polimorfismo genetico relativo agli enzimi metabolizzanti i farmaci nella
popolazione: i lenti e i rapiti metabolizzatori.
 Farmacogenetica degli enzimi idrolizzanti
Le esterasi. Le butiril-colinesterasi e la deficienza pseudocolinesterasica. Farmacogenetica dei
citocromi P-450 (CYP-450). Caratteristiche dei citocromi P450, classificazione. Gli enzimi
CYP450 e i loro substrati e inibitori selettivi. Reazioni ossidative di inattivazione catalizzate dai
CYP450. Principali Citocromi P450 dei mammiferi. Cause dei polimorfismi e delle variazioni di
espressione dei CYP450 dei mammiferi. Meccanismo di induzione delle monossigenasi.
Polimorfismi dei CYP-450 correlati a variazioni dell’azione dei farmaci: I CYP450 1A1 e P450
1A2; I Citocromi 2C (CYP2C9 e CYP2C19); Il caso del CYP2D6. Errori del metabolismo
congeniti connessi a mutazioni dei CYP450.
 Farmacogenetica dell’etanolo
La tossicità dell’etanolo. Variabilità nell’intolleranza all’alcool nelle diverse popolazioni umane. Il
metabolismo dell’etanolo: L’ Alcool deidrogenasi (ADH) e l’aldeide deidrogenasi. Il CYP450 2E1
nel metabolismo dell’etanolo. I geni ADH. Attivita’ catalitica di forme diverse della ADH umana.
Le varianti dei geni ADH di classe I e fenotipo associato. La tossicità dell’acetaldeide. Il gene
ALDH2 e le sue varianti e fenotipo associato.
 Glutatione S-transferasi (GST), polimorfismo e sue conseguenze biologiche
I processi di coniugazioni con il glutatione. La Glutatione S-transferasi umana generalità. Le due
sottofamiglie: GST dimeriche citosoliche (biotransformazione degli xenobiotici, inattivazione dei
radicali) e le GST trimeriche microsomiali. I polimorfismi comuni delle GST citosoliche.
Meccanismi epigenetici di regolazione delle GSTP1. Variazione di rischio di tumori specifici in
soggetti GST deficienti.
 Farmacogenetica delle acetiltranferasi
Ruolo delle acetiltranferasi. Variazioni della N-acetilazione della isoniazide.
Effetti del
polimorfismo della N-acetiltranferasi (NAT): i lenti e i veloci acetilatori. I due sottotipi principali
di NAT umane: NAT1 e NAT2, geni e attività enzimatica. Gli alleli NAT2 responsabili del
fenotipo lento-acetilatore. Varianti NAT1. Farmaci e xenobiotici influenzati dalle variazioni di
acetilazione. Il metabolismo delle amine aromatiche e cancro vescicale.
 Farmacogenetica della Tiopurina-S-Metil-Transferasi
L’enzima Tiopurina-S-Metil-Transferasi e il metabolismo di 6-mercaptopurina (6MP) e azatioprina
(AP). Il gene umano della TPMT e le sue varianti alleliche. Variazioni etniche della TPMT.
Metodi di dosaggio della TPMT. Effetti del polimorfismo della TPMT sulla terapia.
 Farmacogenetica di farmaci di nuova generazione
Erlotinib, un inibitore dei recettori ad attività tirosinchinasica (es. EGFr): ruolo dei geni KRAS e
EGFR come Biomarkers di risposta farmacologica. L’Herceptin (Trastuzumab) nel trattamento del
carcinoma della mammella: ruolo del gene HER2 nella risposta farmacologica.
• L’espressione genica e il trascrittoma
Definizioni di trascrittoma. Fasi principali dell’espressione genica nei Procarioti e negli Eucarioti.
La Trascrizione. La regolazione dell’espressione genica. Tecnologie per l’analisi dei profili di
espressione genica: DNA microarrays, Oligonucleotides arrays. La tecnologia Illumina. Analisi
dell’espressione genica di singoli geni : Northern Blot, Real Time-PCR.
I DNA microarrays: scelta e amplificazione dei geni da depositare sul vetrino. Costruzione di un
cDNA microarray di S.cerevisiae. Tecnologie per la stampa: tipologie di arrayer. Procedura di
ibridazione. Marcatura diretta mediante incorporazione di Cy-dUTP e marcatura indiretta mediante
accoppiamento con Cy3/Cy5. Acquisizione Immagine Normalizzazione e analisi dei dati.
Hierarchical Clustering. Tecnologia “GeneChip” Affymetrix: reazione di marcatura, tecnica di
ibridazione.
Applicazioni DNA microarray. Esempi di studi effettuati mediante DNA microarray: analisi di
espressione genica in pazienti affetti da linfoma DLBCL .